賴麗梨，段華英，鄒爭(zhēng)志

(1.廣州市增城區(qū)人民醫(yī)院婦產(chǎn)科， 廣州 511300； 2.廣州醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院婦產(chǎn)科， 廣州 510260；3.華南師范大學(xué)生物光子學(xué)研究院激光生命科學(xué)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室， 廣州 510631; 4.華南師范大學(xué)生物光子學(xué)研究院， 廣東省激光生命科學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室， 廣州 510631)

絲裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase，MAPK)是一個(gè)能被不同的細(xì)胞外刺激激活的絲氨酸-蘇氨酸蛋白激酶家族，細(xì)胞外的因素包括細(xì)胞生長(zhǎng)因子、神經(jīng)遞質(zhì)、激素、細(xì)胞應(yīng)激及細(xì)胞黏附。MAPK信號(hào)通路是真核生物信號(hào)傳遞網(wǎng)絡(luò)中的重要途徑之一，在基因表達(dá)調(diào)控和細(xì)胞功能活動(dòng)中發(fā)揮著關(guān)鍵作用。經(jīng)典的MAPK家族可分為ERK、p38、JNK和ERK5 4個(gè)亞族。已知MAPK這4個(gè)家族成員在細(xì)胞的生長(zhǎng)、分化、對(duì)環(huán)境的應(yīng)激適應(yīng)、炎癥反應(yīng)等多種重要的細(xì)胞生理/病理過(guò)程中發(fā)揮著重要的作用。MAPK家族的過(guò)度激活在多種腫瘤中被發(fā)現(xiàn)，MAPK的激活與腫瘤細(xì)胞的增殖、轉(zhuǎn)移和遷移有重要關(guān)系[1]。MAPK4是MAPK家族的一個(gè)非典型的成員，關(guān)于MAPK4的生物學(xué)功能以及與疾病的關(guān)系，目前報(bào)導(dǎo)的很少。有研究發(fā)現(xiàn),MAPK4能夠通過(guò)調(diào)節(jié)MAPK5的功能去影響細(xì)胞的增殖[2]。最近的研究發(fā)現(xiàn),MAPK4在前列腺癌中過(guò)表達(dá)，干擾MAPK4的表達(dá)顯著地抑制了癌細(xì)胞的增殖和錨定依賴的增長(zhǎng)。同時(shí)，在小鼠體內(nèi)的研究也發(fā)現(xiàn)，抑制MAPK4活性能夠顯著地抑制移植瘤的生長(zhǎng)[3]。通過(guò)研究MAPK4誘導(dǎo)腫瘤形成的分子機(jī)制，他們發(fā)現(xiàn)MAPK4通過(guò)激活mTOR信號(hào)通路去誘導(dǎo)腫瘤的發(fā)生發(fā)展。最近在骨髓瘤研究中，F(xiàn)eng等[4]發(fā)現(xiàn)MAPK4在腫瘤進(jìn)展中起了重要作用，同時(shí)也發(fā)現(xiàn)，CircRNA circ_0000190通過(guò)調(diào)控miR-767-5p抑制了MAPK4的表達(dá)，從而抑制骨髓瘤的發(fā)展。

經(jīng)典的MAPK家族在宮頸癌中的研究已有一些報(bào)導(dǎo)，然而MAPK4在宮頸癌中的作用，目前尚沒(méi)有研究報(bào)導(dǎo)。在本研究中，我們發(fā)現(xiàn)MAPK4能夠激活宮頸癌細(xì)胞HeLa和SiHa中的蛋白激酶B(protein kinase B，AKT，又稱PKB)信號(hào)，進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)MAPK4的表達(dá)與宮頸癌細(xì)胞的增殖顯著相關(guān)。

1 材料與方法

1.1 試劑

DMSO購(gòu)買于Sigma公司，MAPK4抗體購(gòu)買于Abcam公司，p-AKT-Ser473、AKT和Actin抗體購(gòu)買于Cell Signalling Technology公司，siRNA合成于上海吉瑪公司，LipofectamineTM3000、CCK8檢測(cè)試劑盒、胰蛋白酶消化液購(gòu)買于Thermo Scientific公司。MAPK4過(guò)表達(dá)質(zhì)粒由本課題組構(gòu)建。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)

人宮頸癌細(xì)胞系HeLa和SiHa(購(gòu)于中科院上海細(xì)胞庫(kù))，培養(yǎng)采用含10%胎牛血清(Gbico)的DMEM培養(yǎng)基，置于37 ℃、5%CO2、飽和濕度的細(xì)胞培養(yǎng)箱中常規(guī)培養(yǎng)，經(jīng)檢測(cè)培養(yǎng)箱無(wú)支原體污染[5]。

1.3 細(xì)胞增殖檢測(cè)

取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞，用胰酶消化后稀釋成每毫升5×104個(gè)細(xì)胞的懸液接種于96孔板中，每孔200 μL(即10 000個(gè)細(xì)胞)。在37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，分別培養(yǎng)至24、48、72及96 h，按照CCK8檢測(cè)試劑盒說(shuō)明書流程在上述時(shí)間點(diǎn)完成細(xì)胞增殖檢測(cè)。簡(jiǎn)單的流程如下：試驗(yàn)中止前4 h加入CCK8液20 μL，再培養(yǎng)4 h，在酶聯(lián)檢測(cè)儀上檢測(cè)450 nm 波長(zhǎng)下每孔的吸光度OD(optical density)值，按下列公式求出細(xì)胞活力。細(xì)胞活力(cell viability)=(干擾或過(guò)表達(dá)MAPK4組平均OD值/對(duì)照組平均OD值)×100%[6]。

1.4 GSCA分析細(xì)胞系mapk4基因表達(dá)

通過(guò)在線軟件GSCA(http://bioinfo.life.hust.edu.cn/web/GSCALite/)[7]，分析mapk4基因在已經(jīng)檢測(cè)過(guò)的癌細(xì)胞系中mRNA的表達(dá)水平。根據(jù)mapk4基因的表達(dá)水平，選取了表達(dá)相對(duì)高的宮頸癌細(xì)胞HeLa和表達(dá)相對(duì)低的宮頸癌細(xì)胞SiHa。

1.5 細(xì)胞轉(zhuǎn)染

mapk4的siRNA干擾片段序列如下：5′-GGGU GAGCUGUUCAAGUUCTT-3′。對(duì)照序列(negative control,NC)：5′-UCCGUUUCGGUCCACAUUC-3′。轉(zhuǎn)染時(shí)根據(jù)LipofectamineTM3000說(shuō)明書，用適量無(wú)血清培養(yǎng)液將siRNA(終濃度100 nmol/L)或MAPK4過(guò)表達(dá)質(zhì)粒(6孔板中每孔加入2 μg)與LipofectamineTM3000混勻，然后加入到細(xì)胞中，8 h后換為含10%胎牛血清培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)，在轉(zhuǎn)染后48 h內(nèi)完成免疫印跡試驗(yàn)，在轉(zhuǎn)染后96 h內(nèi)完成細(xì)胞增殖檢測(cè)[8]。

1.6 免疫印跡

將處理過(guò)的細(xì)胞用胰酶消化收集，用預(yù)冷的PBS洗3遍，加入適量裂解液(50 mmol/L Tris-HCl pH 8.0、150 mmol/L NaCl、1%Triton X-100、1 mmol/L Na3VO4、100 mmol/L PMSF)在冰上裂解30 min，用移液槍反復(fù)吹打40次，避免產(chǎn)生氣泡。12 000 r/min離心15 min，收集上清蛋白液。采用10%～12%SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳，然后轉(zhuǎn)移到聚偏二氟乙烯(polyvinylidene fluoride, PVDF)膜上，轉(zhuǎn)膜完成后，用5%奶粉液或5%的牛血清白蛋白(bovine serum albumin,BSA)在室溫封閉1 h，之后分別在4 ℃孵育一抗12 h，在室溫孵育二抗1 h。ECL(electrochemiluminescence)底物顯色，A、B液以1∶1的體積比例混合，用濾紙將膜表面液體吸干，加ECL底物顯色液，放入暗盒中并壓片，5 s～5 min后顯影、定影[9]。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

統(tǒng)計(jì)學(xué)方法數(shù)據(jù)均采用SPSS16.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，所有試驗(yàn)重復(fù)3次，均為獨(dú)立試驗(yàn)，計(jì)量資料采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，數(shù)據(jù)的比較分析采取student’t檢驗(yàn)分析，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果與分析

2.1 mapk4在癌細(xì)胞系中的差異表達(dá)

為了評(píng)估m(xù)apk4在腫瘤細(xì)胞系中的表達(dá)， 通過(guò)GSCA在線軟件，在12個(gè)組織類型共65種腫瘤細(xì)胞系中，我們分析了mapk4的mRNA水平。

如圖1a所示，mapk4在肺癌細(xì)胞SCLC-21H中表達(dá)最高，其次是宮頸癌細(xì)胞HeLa。本研究選取了mapk4高表達(dá)的HeLa細(xì)胞和mapk4表達(dá)相對(duì)低的宮頸癌細(xì)胞SiHa作為研究的細(xì)胞模型。首先，通過(guò)RT-PCR試驗(yàn)，我們?cè)谶@兩個(gè)宮頸癌細(xì)胞中驗(yàn)證了mapk4的表達(dá)，如圖1b所示，發(fā)現(xiàn)相對(duì)于HeLa細(xì)胞，SiHa細(xì)胞中mapk4的mRNA表達(dá)顯著降低。接下來(lái)，我們通過(guò)Western blot試驗(yàn)，在這兩個(gè)細(xì)胞系中進(jìn)一步驗(yàn)證MAPK4蛋白的表達(dá)水平。如圖1c所示，與mapk4的mRNA表達(dá)結(jié)果一致，MAPK4的蛋白表達(dá)在HeLa細(xì)胞中顯著高于SiHa細(xì)胞。

圖1 mapk4在癌細(xì)胞系中的差異表達(dá)Fig.1 Expression of mapk4 mRNA in cancer cell lines(a)通過(guò)在線軟件GSCA(http://bioinfo.life.hust.edu.cn/web/GSCALite/)[8]分析mapk4在已經(jīng)檢測(cè)過(guò)的癌細(xì)胞系中mRNA的表達(dá)水平；(b)通過(guò)RT-PCR檢測(cè)HeLa和SiHa細(xì)胞中mapk4的mRNA水平。*** P<0.001，顯示有統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著差異；(c)通過(guò)Western blot檢測(cè)HeLa和SiHa細(xì)胞中MAPK4的蛋白水平。Actin作為內(nèi)參蛋白(a)The mapk4 mRNA levels of cancer cell lines are obtained from GSCA database(http://bioinfo.life.hust.edu.cn/web/GSCALite/);(b) mapk4 mRNA levels were detected by RT-PCR in HeLa and SiHa cells. *** P<0.001 indicates significant difference;(c)MAPK4 protein levels were detected by Western blot in HeLa and SiHa cells. Actin serving as loading control

2.2 MAPK4表達(dá)影響宮頸癌細(xì)胞增殖能力

MAPK家族蛋白在促進(jìn)細(xì)胞增殖過(guò)程中起了重要作用。為探索MAPK4是否與宮頸癌細(xì)胞的增殖能力相關(guān)，本研究選取了MAPK4表達(dá)相對(duì)高的HeLa細(xì)胞，通過(guò)轉(zhuǎn)染mapk4的siRNA完成了MAPK4敲低試驗(yàn)，并通過(guò)CCK8(cell counting kit-8)試驗(yàn)檢測(cè)了細(xì)胞的增殖能力。如圖2a所示，在轉(zhuǎn)染了mapk4的siRNA后，MAPK4的蛋白表達(dá)顯著降低。細(xì)胞活力試驗(yàn)也表明，干擾MAPK4后，細(xì)胞的增殖能力顯著降低，具體見(jiàn)圖2b。同時(shí)，我們選取了MAPK4相對(duì)表達(dá)低的SiHa細(xì)胞，在細(xì)胞中轉(zhuǎn)染MAPK4的過(guò)表達(dá)質(zhì)粒，然后通過(guò)CCK8試驗(yàn)檢測(cè)了細(xì)胞的增殖能力。如圖2c所示，在轉(zhuǎn)染了MAPK4的過(guò)表達(dá)質(zhì)粒后，MAPK4的蛋白表達(dá)顯著升高。細(xì)胞活力試驗(yàn)也表明，高表達(dá)MAPK4蛋白后，細(xì)胞的增殖能力顯著增強(qiáng)(圖2d)。以上結(jié)果表明，抑制MAPK4表達(dá)能夠抑制細(xì)胞的增殖能力，而促進(jìn)MAPK4蛋白表達(dá)能夠增強(qiáng)宮頸癌細(xì)胞的增殖能力。這些都說(shuō)明在宮頸癌中MAPK4可能和腫瘤細(xì)胞的增殖能力有關(guān)。

圖2 MAPK4表達(dá)影響宮頸癌細(xì)胞增殖能力Fig.2 MAPK4 expression is associated with cell proliferation in cervical cancer cell lines(a)在HeLa細(xì)胞中轉(zhuǎn)染mapk4的siRNA 48 h后，通過(guò)Western blot檢測(cè)MAPK4的表達(dá)，Actin作為內(nèi)參蛋白；(b)在HeLa細(xì)胞中轉(zhuǎn)染mapk4的siRNA 48 h后，通過(guò)CCK8試驗(yàn)檢測(cè)圖中所示時(shí)間點(diǎn)的細(xì)胞增殖能力；(c) 在SiHa細(xì)胞中轉(zhuǎn)染MAPK4過(guò)表達(dá)質(zhì)粒48 h后，通過(guò)Western blot檢測(cè)MAPK4的表達(dá)，Actin作為內(nèi)參蛋白；(d)在SiHa細(xì)胞中轉(zhuǎn)染MAPK4過(guò)表達(dá)質(zhì)粒48 h后，通過(guò)CCK8試驗(yàn)檢測(cè)圖中所示時(shí)間點(diǎn)的細(xì)胞增殖能力。NC：陰性對(duì)照；Ctrl：對(duì)照。*** P<0.001，顯示有統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著差異(a)HeLa cells were transfected MAPK4 siRNA, after 48 h, MAPK4 were detected by Western blot,Actin serving as loading control;(b) HeLa cells were transfected MAPK4 siRNA, after 48 h, cell viability was detected by CCK8 assay at the time points shown in the figure;(c)SiHa cells were transfected MAPK4-overexpressed plasmid. After 48 h, MAPK4 was detected by Western blot. Actin serving as loading control;(d)SiHa cells were transfected MAPK4-overexpressed plasmid, after 48 h, cell viability was detected by CCK8 assay at the time points shown in the figure. NC:negativecontrol;Ctrl:Control. *** P<0.001indicates significant difference

2.3 在宮頸癌細(xì)胞中MAPK4促進(jìn)了AKT的活性

以上的試驗(yàn)研究結(jié)果表明，MAPK4促進(jìn)了細(xì)胞的增殖能力，然而其下游的分子機(jī)制尚不清楚，因此，接下來(lái)我們探索了MAPK4下游與細(xì)胞增殖可能相關(guān)的蛋白。在肺癌細(xì)胞中的研究發(fā)現(xiàn)MAPK4激活了AKT信號(hào)，因此，在本研究中我們探討了MAPK4在宮頸癌細(xì)胞中是否也能激活A(yù)KT。我們同樣地選取了MAPK4表達(dá)相對(duì)高的HeLa細(xì)胞，通過(guò)轉(zhuǎn)染mapk4的siRNA完成了MAPK4敲低試驗(yàn)。接下來(lái),通過(guò)Western blot試驗(yàn)檢測(cè)了AKT的活化形式磷酸化AKT(p-AKT-Ser473)的表達(dá)。如圖3a所示，在轉(zhuǎn)染了mapk4的siRNA后，MAPK4的蛋白表達(dá)顯著降低，同時(shí)p-AKT-Ser473的表達(dá)水平也顯著降低。同時(shí)，我們選取了MAPK4表達(dá)相對(duì)低的SiHa細(xì)胞，通過(guò)轉(zhuǎn)染MAPK4的過(guò)表達(dá)質(zhì)粒，檢測(cè)了p-AKT-Ser473的表達(dá)水平。如圖3b所示，在轉(zhuǎn)染了MAPK4的過(guò)表達(dá)質(zhì)粒后，MAPK4的蛋白表達(dá)顯著升高，同時(shí)p-AKT-Ser473的表達(dá)水平也顯著上升。以上結(jié)果表明，抑制MAPK4表達(dá)能夠抑制AKT的活性，而促進(jìn)MAPK4表達(dá)能夠增強(qiáng)AKT的活性。這說(shuō)明在宮頸癌中MAPK4可能通過(guò)激活A(yù)KT增強(qiáng)了腫瘤細(xì)胞的增殖能力。

圖3 在宮頸癌細(xì)胞中MAPK4促進(jìn)了AKT的活性Fig.3 MAPK4 activates AKT in cervical cancer cells(a)和 (b)在宮頸癌細(xì)胞HeLa和SiHa中，分別轉(zhuǎn)染mapk4的siRNA和MAPK4過(guò)表達(dá)質(zhì)粒，48 h后通過(guò)Western blot檢測(cè)MAPK4和p-AKT-Ser473的表達(dá)。AKT作為p-AKT-Ser473的內(nèi)參蛋白，Actin作為總的內(nèi)參蛋白(a) and (b) HeLa and SiHa cells were transfected mapk4 siRNA and MAPK4-overexpressed plasmid respectively, after 48 h, MAPK4 and p-AKT were detected by Western blot. AKT serving as loading control for p-AKT, Actin serving as loading control for total protein

3 討論

在全世界宮頸癌是女性第三常見(jiàn)的癌癥[10]。隨著篩選方法的不斷改進(jìn)以及發(fā)達(dá)國(guó)家的疫苗接種計(jì)劃，發(fā)達(dá)國(guó)家與資源匱乏的發(fā)展中國(guó)家的婦女在宮頸癌發(fā)病率方面差異越來(lái)越顯著[11]。目前，大于85%的宮頸癌死亡發(fā)生在中低收入人群的國(guó)家。已知宮頸癌的發(fā)生與人乳頭瘤病毒(human papilloma virus,HPV)感染顯著相關(guān)，然而在沒(méi)有感染HPV的人群中也有一部分人會(huì)發(fā)展為宮頸癌[12]，這可能和遺傳以及病毒之外的環(huán)境因素有關(guān)?，F(xiàn)已有研究表明，一些原癌基因的突變能夠引起宮頸癌的發(fā)生，因而靶向抑制這些癌基因?qū)m頸癌的治療有潛在的價(jià)值[13]。在本研究中，我們發(fā)現(xiàn)MAPK4促進(jìn)了宮頸癌細(xì)胞的增殖，因而MAPK4可以作為宮頸癌治療的潛在靶點(diǎn)。但本研究我們僅用到了2個(gè)宮頸癌細(xì)胞系驗(yàn)證MAPK4促進(jìn)宮頸癌細(xì)胞增殖，缺乏動(dòng)物試驗(yàn)的結(jié)果。因此，下一步需要構(gòu)建動(dòng)物模型，在體內(nèi)驗(yàn)證MAPK4促進(jìn)了宮頸癌的增殖，同時(shí)，也需要在臨床組織標(biāo)本中檢測(cè)MAPK4的表達(dá)是否與病人的預(yù)后相關(guān)。

在大多數(shù)人類腫瘤中，AKT蛋白是最常見(jiàn)的、活化的癌基因產(chǎn)物。AKT活化的主要機(jī)制包括2個(gè)主要途徑：一是通過(guò)腫瘤抑制基因pten突變，從而使PTEN失活，PTEN是AKT的一個(gè)抑制蛋白，因此PTEN突變的失活會(huì)導(dǎo)致AKT的過(guò)度激活；二是PI3K酶活性亞基的活化突變，pi3k是AKT蛋白的直接上游基因，PI3K能夠直接磷酸化激活A(yù)KT，因此PI3K的突變激活能夠促進(jìn)AKT的過(guò)度激活[14,15]。最近越來(lái)越多的證據(jù)表明，除了上述兩條途徑外還有一些蛋白的表達(dá)和活性失調(diào)也影響了AKT的活性。比如ras基因突變導(dǎo)致Ras蛋白的過(guò)度活化也直接影響了AKT的活性，另外，akt基因自身的突變也是導(dǎo)致其過(guò)度活化的原因，如發(fā)生在AKT蛋白的pH功能區(qū)E17位的突變[16]。akt基因的擴(kuò)增導(dǎo)致AKT蛋白的過(guò)度表達(dá)也是AKT過(guò)度活化的原因之一。在本研究中，我們發(fā)現(xiàn)MAPK4過(guò)表達(dá)能夠激活A(yù)KT的活性，然而具體的分子機(jī)制仍然不清楚。MAPK4是否直接與AKT相互作用，從而磷酸化AKT？還是通過(guò)激活一個(gè)中間分子間接激活A(yù)KT？這其中的分子機(jī)制還有待進(jìn)一步研究。最近在肺癌的研究報(bào)道中發(fā)現(xiàn)MAPK4激活了AKT的活性，然而關(guān)于MAPK如何激活A(yù)KT活性的具體機(jī)制并未闡明。AKT促進(jìn)細(xì)胞的增殖主要涉及以下幾種機(jī)制：1)抑制細(xì)胞周期抑制蛋白p27表達(dá)，p27蛋白能夠與細(xì)胞周期相關(guān)蛋白激酶(cyclin-dependent kinases,CDK)結(jié)合，從而抑制CDK的活性，進(jìn)而阻止細(xì)胞周期的進(jìn)展[17]；2)促進(jìn)細(xì)胞糖代謝，為細(xì)胞分裂增殖提供營(yíng)養(yǎng)[18]；3)抑制GSK3β的活性，GSK3β能夠促進(jìn)細(xì)胞周期蛋白cyclinD1的降解，從而使細(xì)胞周期從G1向S期轉(zhuǎn)化受到阻止，而AKT能夠抑制GSK3β的活性，因此促進(jìn)了cyclinD1的表達(dá)，從而加速細(xì)胞周期從G1向S期轉(zhuǎn)化[19]。本研究中我們發(fā)現(xiàn)MAPK4激活了AKT，然而并沒(méi)有檢測(cè)AKT下游促進(jìn)細(xì)胞增殖的信號(hào)。因此，在接下來(lái)的研究中，需要進(jìn)一步檢測(cè)AKT下游的信號(hào)是否受MAPK4的影響。

總之，本研究發(fā)現(xiàn)MAPK4促進(jìn)宮頸癌細(xì)胞的增殖，這表明在宮頸癌中靶向抑制MAPK4能夠抑制宮頸癌的進(jìn)展，MAPK4可以作為宮頸癌治療的潛在靶點(diǎn)。