姚 靖，吳 婷，葉世蔚，高玉峰，鄭 煒*，秦水介

(1.貴州大學(xué) a.物理學(xué)院； b.貴州省光電子技術(shù)與應(yīng)用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室， 貴陽 550025；2.中國(guó)科學(xué)院深圳先進(jìn)技術(shù)研究院生物醫(yī)學(xué)光學(xué)與分子影像研究室， 深圳 518055)

雙光子顯微鏡(two-photon microscopy，TPM)具備快速、高分辨和三維成像能力，被廣泛地應(yīng)用于生物醫(yī)學(xué)[1]、材料科學(xué)[2]和電子科學(xué)[3]等研究領(lǐng)域。隨著腦科學(xué)研究的逐漸升溫，雙光子顯微技術(shù)得到了進(jìn)一步的發(fā)展。包括組織光透明[4]、自適應(yīng)光學(xué)[5]等技術(shù)的開發(fā)使得TPM在小鼠腦內(nèi)的縱向成像深度得到了很大的提高，但橫向視場(chǎng)卻主要限制在0.5 mm×0.5 mm左右，這種成像視場(chǎng)的局限使得TPM難以開展多腦區(qū)的神經(jīng)活動(dòng)成像研究。所以，如何實(shí)現(xiàn)大視場(chǎng)高分辨TPM成像已經(jīng)成為了目前光學(xué)顯微成像領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)之一[6-9]。

掃描系統(tǒng)設(shè)計(jì)對(duì)于實(shí)現(xiàn)大視場(chǎng)高分辨的雙光子成像起著至關(guān)重要的作用。檢流計(jì)振鏡可以靈活地控制掃描角，從而調(diào)節(jié)激光掃描區(qū)域的大小，這種特性使得它被廣泛地應(yīng)用于TPM的二維掃描系統(tǒng)中。最早使用于TPM的二維掃描系統(tǒng)是由X方向和Y方向的兩片檢流計(jì)振鏡緊挨著構(gòu)成的，中間沒有中繼光學(xué)系統(tǒng)[10,11]。這種設(shè)計(jì)比較簡(jiǎn)潔，便于安裝調(diào)試，但是該方法無法使兩片振鏡同時(shí)共軛到物鏡后背孔徑處，所以不可避免地會(huì)使部分激光能量在掃描過程中損失掉。并且，由于受第一片掃描鏡的掃描角度的限制，第二片掃描鏡需要增大面積，從而限制了它的掃描速度[12]。在兩片檢流計(jì)振鏡中間加入提供中繼作用的透鏡系統(tǒng)能有效地解決上述問題，并且已經(jīng)成為常見的TPM掃描系統(tǒng)之一[13-16]。但是，要滿足TPM大視場(chǎng)的成像需求，該掃描系統(tǒng)存在一系列技術(shù)難點(diǎn)，包括：1)現(xiàn)有的商業(yè)透鏡由于孔徑和焦距的限制，在大角度掃描的情況下，掃描光束很難全部通過共焦透鏡中繼；2)即使光束全部通過共焦透鏡中繼，但是隨著掃描角度的增大，透鏡共焦掃描中繼會(huì)產(chǎn)生較大的像差[9,17]，對(duì)系統(tǒng)的成像質(zhì)量造成嚴(yán)重的影響，包括成像面的掃描光強(qiáng)沿視場(chǎng)徑向方向衰減，成像面不平整等；3)由于TPM需要飛秒激光作為光源，其一般為寬光譜系統(tǒng)。針對(duì)寬光譜，透鏡系統(tǒng)引入的色差會(huì)造成飛秒脈沖展寬，使得雙光子激發(fā)熒光信號(hào)急劇減弱[18]。目前，高端商業(yè)TPM會(huì)使用專門設(shè)計(jì)和加工的透鏡中繼系統(tǒng)，這能極大地改善以上問題，但是，其設(shè)計(jì)難度和加工成本較高，不適合于探索性為主的實(shí)驗(yàn)室研究需求。如何在維持成像質(zhì)量不變的前提下提升掃描范圍同時(shí)控制硬件成本仍是當(dāng)前TPM掃描系統(tǒng)開發(fā)待解決的重點(diǎn)問題。

相對(duì)于透鏡中繼系統(tǒng)而言，反射鏡中繼系統(tǒng)具有天生的無色差優(yōu)勢(shì)。美國(guó)Amos等[19]在90年代初就提出了利用共焦球面反射鏡作為中繼系統(tǒng)，并且申請(qǐng)了專利。該系統(tǒng)利用一對(duì)球面反射鏡共焦放置來實(shí)現(xiàn)掃描中繼，它很好地解決了中繼系統(tǒng)的色差問題，目前已經(jīng)被廣泛地應(yīng)用于需要更寬光譜的共聚焦顯微系統(tǒng)中。早期的雙光子顯微鏡也有用該系統(tǒng)作為中繼的，但是由于僅使用一對(duì)球面反射鏡，無法有效地補(bǔ)償像差，限制了雙光子成像視場(chǎng)，一般視場(chǎng)僅為0.5 mm × 0.5 mm左右[18,20]。Sharafutdinova等[20,21]的研究指出，相對(duì)于共焦球面反射鏡系統(tǒng)，離軸拋物鏡共焦系統(tǒng)能提供更好的掃描線性度和掃描光斑質(zhì)量，預(yù)測(cè)該系統(tǒng)可以實(shí)現(xiàn)更高成像質(zhì)量的共聚焦或雙光子成像。然而，該研究仍缺乏離軸拋物鏡共焦系統(tǒng)像差，如球差(spherical aberration)、掃描過程中邊緣視場(chǎng)的像散(astigmatism)、場(chǎng)曲(field curvature)和畸變(distortion)等的量化分析。至今為止，也沒有相關(guān)研究將離軸拋物鏡共焦系統(tǒng)與大視場(chǎng)雙光子成像技術(shù)結(jié)合，來實(shí)現(xiàn)高成像質(zhì)量的視場(chǎng)直徑大于3 mm的雙光子成像。

在本文中，我們首先借助ZEMAX光學(xué)設(shè)計(jì)軟件(Copyright ? 2020 ZEMAX LLC. All rights reserved)進(jìn)行仿真測(cè)試，在大掃描角度時(shí)，對(duì)離軸拋物鏡(off-axis parabolic mirror，OAPM)共焦掃描中繼系統(tǒng)與傳統(tǒng)的雙膠合透鏡(doublet lens,DB)式共焦掃描中繼系統(tǒng)光學(xué)性能的優(yōu)劣進(jìn)行理論分析對(duì)比。包括系統(tǒng)調(diào)制傳遞函數(shù)(modulation transfer function，MTF)分析，系統(tǒng)場(chǎng)曲、像散與畸變分析，系統(tǒng)球差分析以及物鏡聚焦后光斑點(diǎn)列圖與圈入能量的分析。其次，搭建了實(shí)際的光學(xué)系統(tǒng)，并測(cè)量比較了傳統(tǒng)的DB與OAPM共焦掃描中繼系統(tǒng)像面的聚焦光斑。最后，將OAPM掃描共焦中繼加入到自主搭建的雙光子顯微成像系統(tǒng)中，實(shí)現(xiàn)了2.4 mm×2.4 mm(視場(chǎng)直徑3.4 mm)的大視場(chǎng)小像差的成像，橫向分辨率為1 μm，縱向分辨率為11 μm。利用此顯微鏡，我們?cè)?.4 mm×2.4 mm的大視場(chǎng)下能夠清晰地分辨小鼠大腦切片中微米量級(jí)的神經(jīng)軸突結(jié)構(gòu)。仿真結(jié)果和試驗(yàn)結(jié)果均表明，OAPM中繼系統(tǒng)能有效地解決大視場(chǎng)掃描過程中由掃描系統(tǒng)引起的線性誤差和視場(chǎng)邊緣像差問題。值得一提的是，本文所涉及的所有光學(xué)部件都是現(xiàn)成商業(yè)光學(xué)元件，無需定制，能極大地縮減雙光子系統(tǒng)開發(fā)的時(shí)間和經(jīng)濟(jì)成本。采用本文提出的離軸拋物鏡共焦掃描系統(tǒng)能為掃描顯微鏡技術(shù)研發(fā)提供較大便利。

1 材料與方法

基于OAPM的共焦掃描中繼系統(tǒng)ZEMAX模擬光路圖如圖1a所示。入射光經(jīng)X振鏡(位于OAPM-1的焦點(diǎn)處)反射后，通過一對(duì)離軸拋物鏡(MPD229-M01，焦距f=50.8 mm，孔徑Φ=50.8 mm，Thorlabs，ZEMAX參數(shù)見表1)構(gòu)成的中繼系統(tǒng)，共軛到Y(jié)振鏡(位于OAPM-2的焦點(diǎn)處)，再由一個(gè)F-theta矯正掃描透鏡(LSM54-850，焦距f=54 mm，Thorlabs)聚焦。使用多重態(tài)的方形反射鏡(X方向傾斜機(jī)械角為：0°，1°，…，6°)來模擬檢流計(jì)振鏡掃描過程，并進(jìn)行MTF分析。使用視場(chǎng)角(Y方向視場(chǎng)角參數(shù)為：0°，2°，…，12°)來模擬振鏡掃描角，并進(jìn)行像差與光斑屬性分析。入瞳位置放置于X-掃描振鏡面，入瞳直徑設(shè)置為5 mm，波長(zhǎng)為760 nm。作為對(duì)照，傳統(tǒng)的DB共焦中繼系統(tǒng)ZEMAX模擬光路如圖1b所示，將OAPM共焦掃描中繼系統(tǒng)的OAPM組更換為雙膠合透鏡組(89683，焦距f=50 mm,孔徑Φ=40 mm，Edmund，ZEMAX參數(shù)見表2)，其余組件保持不變。

圖1 DB和OAPM掃描中繼系統(tǒng)結(jié)構(gòu)示意圖Fig.1 DB and OAPM afocal scanning system setup(a)ZEMAX模擬OAPM共焦掃描中繼系統(tǒng)圖；(b)ZEMAX模擬DB共焦掃描中繼系統(tǒng)圖；(c)OAPM共焦掃描中繼像面光斑測(cè)量光路圖；(d)DB共焦掃描中繼像面光斑測(cè)量光路圖(a)Optical layout of the OAPM afocal scanning system in ZEMAX;(b)Optical layout of the DB afocal scanning system in ZEMAX;(c)Experimental setup of OAPM afocal scanning system;(d)Experimental setup of DB afocal scanning system

圖1c和1d是實(shí)際搭建的光學(xué)系統(tǒng)示意圖。圖中激光(Chameleon Ultra II，700～1 000 nm tunable，Coherent)出射后，通過4倍擴(kuò)束系統(tǒng)(焦距f1=50 mm，f2=200 mm)進(jìn)行擴(kuò)束，其后放置一個(gè)直徑5 mm光闌，之后分別通過OAPM共焦掃描中繼系統(tǒng)和傳統(tǒng)DB共焦掃描中繼系統(tǒng)，再由F-theta矯正掃描透鏡進(jìn)行聚焦，在掃描透鏡焦點(diǎn)處使用CCD(E3CMOS，3 072 pixels×2 048 pixels，ToupTek)進(jìn)行光斑測(cè)量分析。

表1 ZEMAX模擬OAPM參數(shù)(mm)Tab.1 The parameter of OAPM in ZEMAX simulation (mm)

表2 ZEMAX模擬雙膠合透鏡參數(shù)(mm)Tab.2 The parameter of doublet lens in ZEMAX simulation (mm)

2 結(jié)果與分析

2.1 仿真結(jié)果與分析

2.1.1 場(chǎng)曲、像散和畸變分析

場(chǎng)曲、像散和畸變是系統(tǒng)像差的重要組成部分。場(chǎng)曲表示為子午(tangential,T)或弧矢(sagittal,S)光束的交點(diǎn)沿光軸方向到高斯像面的距離。像散則描述子午像點(diǎn)和弧矢像點(diǎn)在光軸上分開的距離。對(duì)于傳統(tǒng)的DB共焦掃描中繼系統(tǒng)，如圖2a所示，在像面，隨著掃描角度的增加，即沿+Y方向，場(chǎng)曲和像散逐漸增大，對(duì)比掃描角度為12°與0°(不掃描)時(shí)的情況，場(chǎng)曲造成的子午方向(T)軸向移動(dòng)為-23.13 mm，弧矢方向(S)為-7.82 mm，子午(T)和弧矢(S)像點(diǎn)不重合造成的像散(子午場(chǎng)曲與弧矢場(chǎng)曲之差)為-15.31 mm。這表明了DB共焦掃描中繼系統(tǒng)在進(jìn)行大掃描角度成像時(shí)會(huì)有極為嚴(yán)重的場(chǎng)曲和像散。該場(chǎng)曲會(huì)導(dǎo)致樣品面掃描場(chǎng)為大曲率的曲面，將嚴(yán)重影響成像質(zhì)量。而子午像點(diǎn)和弧矢像點(diǎn)的不重合導(dǎo)致的像散，則導(dǎo)致樣品面焦點(diǎn)在某一方向拉長(zhǎng)，在成像過程中造成X方向和Y方向的分辨率不等。

對(duì)于本文提出的OAPM掃描中繼系統(tǒng)中的場(chǎng)曲和像散，如圖2b所示，對(duì)比掃描角度為12°與0°(不掃描)時(shí)的情況，場(chǎng)曲造成的子午方向(T)軸向移動(dòng)為+0.07 mm，弧矢方向(S)大致為-0.10 mm。子午(T)和弧矢(S)方向像點(diǎn)不重合造成的像散也僅為+0.17 mm左右。這證明了相比于傳統(tǒng)的DB系統(tǒng)，OAPM共焦掃描中繼系統(tǒng)在場(chǎng)曲與像散方面有了明顯的優(yōu)化。

圖2 DB和OAPM掃描中繼系統(tǒng)的場(chǎng)曲和畸變曲線對(duì)比Fig.2 Comparison of field curvature and distortion profile between DB and OAPM afocal scanning system(a)DB共焦掃描中繼像面的場(chǎng)曲曲線；(b)OAPM共焦掃描中繼像面的場(chǎng)曲曲線；(c)DB共焦掃描中繼像面的畸變曲線；(d)OAPM共焦掃描中繼像面的畸變曲線 (a)The field curvature profile in the image plane of DB afocal scanning system;(b)The field curvature profile in the image plane of OAPM afocal scanning system;(c)The distortion profile in the image plane of DB afocal scanning system; (d)The distortion profile in the image plane of OAPM afocal scanning system

畸變是垂軸像差，不會(huì)影響像的清晰程度，只會(huì)改變軸外物點(diǎn)在像面的成像位置。在TPM中，系統(tǒng)的畸變會(huì)對(duì)掃描過程的線性造成影響，畸變?cè)叫?，則掃描過程越趨于線性。從圖2c和2d中，可以看到兩系統(tǒng)的畸變對(duì)比，OAPM共焦掃描中繼系統(tǒng)的畸變(-1.57%)相比于傳統(tǒng)的DB共焦掃描中繼系統(tǒng)(-2.75%)也減小了將近1倍。所以，使用OAPM共焦掃描中繼作為雙光子顯微成像系統(tǒng)的掃描中繼系統(tǒng)，在掃描線性度方面能得到明顯的提升。

2.1.2 球差分析

球差是軸上點(diǎn)像差，即軸上點(diǎn)發(fā)出的同心光束經(jīng)光學(xué)系統(tǒng)后，不再是同心光束，不同入射高度的光線經(jīng)過光學(xué)系統(tǒng)后交光軸于不同位置，相對(duì)于近軸像點(diǎn)有不同程度的偏離，導(dǎo)致在高斯像面的像點(diǎn)不是一個(gè)點(diǎn)，而是一個(gè)圓形的彌散斑。球差會(huì)使本應(yīng)該集中在中心位置處的能量彌散。在TPM中能量的彌散會(huì)造成分辨率下降以及信噪比降低。傳統(tǒng)的DB共焦掃描中繼和OAPM共焦掃描中繼的軸向球差曲線如圖3a和3b所示，OAPM共焦掃描中繼系統(tǒng)的球差僅是DB中繼系統(tǒng)的1/4左右。

圖3 DB和OAPM掃描中繼系統(tǒng)的軸向球差對(duì)比Fig.3 Comparison of spherical aberration profile between DB and OAPM afocal scanning system(a)DB共焦掃描中繼像面的軸向球差曲線；b)OAPM共焦掃描中繼像面的軸向球差曲線 (a)The longitude spherical aberration profile in the image plane of DB afocal scanning system;(b)The longitude spherical aberration profile in the image plane of OAPM afocal scanning system

2.1.3 調(diào)制傳遞函數(shù)MTF對(duì)比分析

調(diào)制傳遞函數(shù)MTF是成像光學(xué)系統(tǒng)像質(zhì)評(píng)價(jià)的另一個(gè)重要指標(biāo)。圖4為不同掃描角下的MTF曲線，其橫坐標(biāo)表示空間頻率，單位為每毫米可分辨的線數(shù)。MTF值降為0時(shí)的空間頻率，稱為截止頻率，即系統(tǒng)分辨細(xì)節(jié)的能力。截止頻率越大，MTF曲線變化越平穩(wěn)，空間頻率和MTF值圍成的面積越大，則系統(tǒng)的成像質(zhì)量越好。

在傳統(tǒng)的DB共焦掃描中繼系統(tǒng)(圖4a)中，隨著振鏡掃描角的增大，系統(tǒng)能通過的截止頻率出現(xiàn)嚴(yán)重地下降。當(dāng)掃描角增大到6°往上時(shí)，系統(tǒng)所能通過的空間頻率成分不足衍射極限的1/12，這時(shí)系統(tǒng)的成像性能已無法滿足成像的需求。這種情況在實(shí)際的掃描系統(tǒng)中會(huì)嚴(yán)重地影響到物鏡下聚焦光斑的形狀，導(dǎo)致這種情況的主要因素是當(dāng)掃描角增大時(shí)，場(chǎng)曲增加，光束不能有效地聚焦在像面上，另外，由于子午弧矢方向焦點(diǎn)位置不同，像散增加，最終影響邊緣視場(chǎng)的熒光信號(hào)強(qiáng)度和成像分辨率。

然而，在本文提出的OAPM掃描中繼系統(tǒng)(圖4b)中，隨著振鏡掃描角度的增加，由于其對(duì)各類像差的優(yōu)化，在各個(gè)掃描角的MTF曲線中，截止頻率和衍射極限曲線相同，各頻率成分的MTF透過率同衍射極限MTF相比只有極小的衰減。這說明在進(jìn)行大視場(chǎng)掃描時(shí)，OAPM共焦掃描中繼系統(tǒng)的成像性能和不掃描時(shí)(0°)的基本相同，在TPM中使用OAPM共焦掃描中繼能顯著地提高成像質(zhì)量。

2.1.4 中繼系統(tǒng)像面光斑分析

點(diǎn)列圖分析是另一種較為直觀的像質(zhì)整體分析方式，主要通過像面聚焦光斑的形狀比較來觀察整個(gè)成像系統(tǒng)的優(yōu)劣。通過DB共焦掃描中繼系統(tǒng)和OAPM共焦掃描中繼系統(tǒng)之后在像面的點(diǎn)列圖分別為圖5a和5b所示。對(duì)于傳統(tǒng)的DB共焦掃描中繼系統(tǒng)(圖5a)，隨著掃描角的增大，由于嚴(yán)重的場(chǎng)曲、像散以及球差等的影響，像面光斑的均方根(root-mean-square，RMS)半徑從0°視場(chǎng)角(衍射極限艾里光斑半徑為9.90 μm)的7 μm彌散至12°視場(chǎng)角時(shí)的588 μm。對(duì)于本文提出的OAPM共焦掃描中繼系統(tǒng)在像面的點(diǎn)列圖，即使在大掃描角度12°的時(shí)候，光斑的RMS半徑為7.09 μm，同衍射極限9.90 μm相近。與像面的光斑點(diǎn)列圖相對(duì)應(yīng)，圖5c和5d分別為傳統(tǒng)的DB共焦掃描中繼系統(tǒng)和OAPM共焦掃描中繼系統(tǒng)的像面圈入能量圖。對(duì)于DB共焦掃描中繼系統(tǒng)，隨著掃描角的增大，聚焦光斑逐漸彌散；而對(duì)于OAPM共焦掃描中繼系統(tǒng)，即使大角度掃描時(shí)，聚焦光斑也基本上集中于艾里光斑內(nèi)。

2.2 試驗(yàn)結(jié)果與分析

2.2.1 中繼系統(tǒng)像面光斑形狀測(cè)量

實(shí)際系統(tǒng)很難精確測(cè)得各類像差的具體分量，考慮到我們?cè)O(shè)計(jì)中繼系統(tǒng)的最終目的是為了實(shí)現(xiàn)高分辨大視場(chǎng)成像，具體體現(xiàn)在雙光子成像系統(tǒng)上就是要求在樣品面上有較好的光學(xué)聚焦光斑，所以在實(shí)際試驗(yàn)驗(yàn)證系統(tǒng)中，我們通過測(cè)量不同掃描角的光斑形狀來對(duì)比模擬分析結(jié)果。我們搭建了如圖1c和1d所示的光斑測(cè)量系統(tǒng)，由測(cè)量系統(tǒng)得到不同掃描角下兩個(gè)中繼系統(tǒng)的光斑分布情況，如圖6所示。

圖4 DB和OPAM掃描中繼系統(tǒng)的MTF曲線對(duì)比Fig.4 Comparison of MTF profile between DB and OAPM afocal scanning system(a)DB共焦掃描中繼的MTF曲線；(b)OAPM共焦掃描中繼的MTF曲線 (a)The MTF profile of DB afocal scanning system;(b)The MTF profile of OAPM afocal scanning system

圖5 DB和OPAM掃描中繼系統(tǒng)的像面點(diǎn)列圖和圈入能量圖對(duì)比Fig.5 Comparison of the spot size and the energy in the image plane between DB and OAPM afocal scanning system(a)DB共焦中繼系統(tǒng)光斑的點(diǎn)列圖；(b)OAPM共焦中繼系統(tǒng)光斑的點(diǎn)列圖；(c) DB共焦中繼系統(tǒng)光斑的圈入能量圖；(d)OAPM共焦中繼系統(tǒng)光斑的圈入能量圖 (a)Spot diagram in the image plane of DB afocal scanning system;(b)Spot diagram in the image plane of OAPM afocal scanning system;(c)Enclosed energy in the image plane of DB afocal scanning system;(d)Enclosed energy in the image plane of OAPM afocal scanning system

圖6 CCD測(cè)得的DB和OAPM掃描中繼系統(tǒng)在不同掃描角度的像面焦點(diǎn)光斑圖Fig.6 Focus spots with different scanning-angle in the image plane of DB and OAPM afocal scanning system measured by CCD (a)在傳統(tǒng)的DB共焦掃描中繼系統(tǒng)中；(b)在OAPM共焦掃描中繼系統(tǒng)中 (a)In DB afocal scanning system; (b)In OAPM afocal scanning system

從實(shí)測(cè)結(jié)果也可以得出：在傳統(tǒng)DB共焦掃描中繼系統(tǒng)中，隨著掃描角度的增大，在包括場(chǎng)曲和像散以及球差等像差的影響下，聚焦光斑逐漸彌散；而對(duì)于OAPM共焦掃描中繼系統(tǒng)，隨著掃描角度的增加，聚焦光斑大小同不掃描時(shí)(0°)相差不大。通過試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行對(duì)比分析，進(jìn)一步驗(yàn)證了通過ZEMAX模擬分析得出的結(jié)論，在大角度掃描時(shí)，OAPM更適合作為TPM 的共焦掃描中繼。

2.2.2 高分辨率大視場(chǎng)雙光子成像結(jié)果

為了測(cè)試實(shí)際的OAPM共焦掃描中繼系統(tǒng)在雙光子顯微鏡中的光學(xué)性能，基于該共焦中繼系統(tǒng)，我們自主搭建了一臺(tái)大視場(chǎng)雙光子顯微成像系統(tǒng)(物鏡：XLPLN10XSVMP, 10× 0.6NA, Olympus；套筒透鏡：88596, 孔徑Φ=75 mm, 有效焦距EFL=200 mm, Edmund)。其余部分與OAPM共焦掃描中繼系統(tǒng)驗(yàn)證光路相同。實(shí)際測(cè)得的最大視場(chǎng)為2.4 mm×2.4 mm(對(duì)應(yīng)最大掃描角度12°)，遠(yuǎn)大于常規(guī)雙光子顯微鏡約0.5 mm×0.5 mm的視場(chǎng)大小。實(shí)測(cè)橫向分辨率為1 μm，縱向分辨率為11 μm。通過該系統(tǒng)測(cè)量了Thy1-eGFP小鼠腦片，得到如圖7a所示的大視場(chǎng)圖像(激發(fā)波長(zhǎng)為920 nm，圖像大小1 536 pixels×1 536 pixels)，并可以清晰地分辨出神經(jīng)元軸突(圖7b)。試驗(yàn)結(jié)果表明，通過OAPM共焦掃描中繼的光學(xué)矯正，可以在2.4 mm×2.4 mm的視場(chǎng)下清晰地采集到量級(jí)為微米的神經(jīng)元軸突，為神經(jīng)科學(xué)的研究提供了有效的成像技術(shù)手段。

圖7 使用OAPM掃描中繼的雙光子大視場(chǎng)成像結(jié)果，樣品為Thy1-eGFP小鼠腦片F(xiàn)ig.7 Two-photon microscopy imaging of Thy1-eGFP mouse brain tissue, the system was equipped with our OAPM afocal scanning system(a)2.4 mm×2.4 mm全視場(chǎng)圖；(b)在(a)圖中紅色框選區(qū)域，視場(chǎng)為0.8 μm×0.8 μm(a)The whole field-of view image, 2.4 mm×2.4 mm;(b)0.8 μm×0.8 μm field-of-view image at red box in(a)

3 討論

本項(xiàng)研究的主要目的是解決雙光子成像大視場(chǎng)掃描過程中由掃描系統(tǒng)引起的線性誤差和視場(chǎng)邊緣成像質(zhì)量較差的問題。鑒于此目的，我們提出了一種基于離軸拋物鏡的共焦掃描中繼系統(tǒng)，可用于矯正TPM進(jìn)行大視場(chǎng)成像時(shí)的邊緣視場(chǎng)像差。相比于傳統(tǒng)的DB共焦掃描中繼系統(tǒng)，OAPM共焦掃描中繼系統(tǒng)具備以下優(yōu)勢(shì)：1)場(chǎng)曲、像散、畸變和軸向球差大幅減??；2)即使在大掃描角度下，MTF曲線仍然與衍射極限保持一致；3)像面光斑尺寸不隨掃描角度增大而增大，能量基本集中于艾里斑內(nèi)。在實(shí)際的生物樣品成像試驗(yàn)中，我們將OAPM共焦中繼整合到雙光子成像系統(tǒng)內(nèi)，實(shí)現(xiàn)了對(duì)Thy1-eGFP小鼠腦片2.4 mm×2.4 mm(視場(chǎng)直徑3.4 mm)的大視場(chǎng)成像，并可清晰地分辨微米量級(jí)的神經(jīng)軸突結(jié)構(gòu)。

經(jīng)典的幾何光學(xué)理論認(rèn)為拋物面鏡的主要作用在于矯正軸上球差，對(duì)軸外像差幫助不大。這個(gè)觀點(diǎn)對(duì)于靜態(tài)光學(xué)成像系統(tǒng)而言是成立的，但是對(duì)于中繼掃描系統(tǒng)而言，需要特殊考慮。中繼掃描系統(tǒng)是一個(gè)動(dòng)態(tài)的掃描過程，它的光軸隨著掃描角度的不同時(shí)刻在變化，換言之，中繼掃描系統(tǒng)是由多個(gè)不同的靜態(tài)系統(tǒng)組成的，每個(gè)靜態(tài)系統(tǒng)代表一個(gè)掃描角度。在這種情況下，拋物面反射鏡可以矯正場(chǎng)曲、像散和畸變，從而提升周邊視場(chǎng)的成像質(zhì)量，增大成像視場(chǎng)。

具體而言， 場(chǎng)曲和像散的改善主要得益于巧妙的OAPM構(gòu)架設(shè)計(jì)。OAPM中的拋物面反射鏡縱向?yàn)閽佄锞€面型，橫向?yàn)榍蛎婷嫘?，并且拋物面反射鏡的焦點(diǎn)也是球面鏡的焦點(diǎn)。入射平行光由位于拋物面反射鏡焦點(diǎn)處的X-掃描鏡投射到拋物面反射鏡上，并沿球面方向做橫向掃描。對(duì)于球面反射鏡而言，圓心處發(fā)出的小口徑平行光入射球面任何反射區(qū)域都是等價(jià)的，所以掃描過程中，橫向焦距基本不變。另外，由于縱向焦距有拋物面焦距決定并且在掃描過程中也基本不變，致使在掃描過程中，由縱向焦距和橫向焦距之差造成的像散得以緩解，從而解決了邊緣視場(chǎng)的像散問題。進(jìn)一步，像散的優(yōu)化直接造成場(chǎng)曲問題的解決，兩者是直接相關(guān)的。

而畸變對(duì)于掃描中繼系統(tǒng)而言，則是由中繼系統(tǒng)對(duì)掃描角度的線性保持情況來決定的。通俗地講，如果掃描過程中，中繼系統(tǒng)的輸出角度和輸入角度是線性對(duì)應(yīng)關(guān)系，則不會(huì)產(chǎn)生畸變，反之則會(huì)產(chǎn)生畸變。由于我們的OAPM中繼系統(tǒng)是由兩片拋物面鏡對(duì)稱放置且嚴(yán)格共焦，由幾何光學(xué)可知，光束在OAPM-1表面產(chǎn)生的角度偏移(平行光匯聚點(diǎn)相對(duì)于理想焦點(diǎn)的偏移)同其在OAPM-2表面產(chǎn)生的角度偏移大小相等且方向相反，該掃描方式造成在OAPM-1掃描產(chǎn)生的弧形畸變和OAPM-2產(chǎn)生的弧形畸變之間相互抵消，從而優(yōu)化了成像系統(tǒng)的畸變情況。

需要指出的是，雖然該OAPM共焦中繼系統(tǒng)在大掃描角度下能對(duì)場(chǎng)曲、像散、畸變和球差進(jìn)行矯正，但是對(duì)彗差的矯正效果不明顯，這主要是由拋物面反射鏡中拋物線的性質(zhì)決定的。彗差會(huì)造成成像分辨率的下降及成像信號(hào)的減弱，這也是目前在OAPM共焦中繼系統(tǒng)中限制成像視場(chǎng)進(jìn)一步增大的主要原因之一。在今后的工作中，我們建議可以通過引入透鏡組來補(bǔ)償彗差,從而進(jìn)一步優(yōu)化該OAPM掃描中繼系統(tǒng),或通過自適應(yīng)光學(xué)補(bǔ)償?shù)仁侄蝸磉M(jìn)一步提高視場(chǎng)邊緣的成像質(zhì)量。

綜上所述，本文提出了一種基于離軸拋物鏡的共焦掃描中繼系統(tǒng)，該系統(tǒng)能有效矯正TPM進(jìn)行大視場(chǎng)成像時(shí)的球差以及掃描引起的像散、場(chǎng)曲、畸變等像差，從而提高視場(chǎng)邊緣成像分辨率以及雙光子熒光強(qiáng)度。本項(xiàng)研究結(jié)果可應(yīng)用于所有雙光子顯微成像系統(tǒng)中，有助于推進(jìn)腦科學(xué)研究中多腦區(qū)甚至全腦區(qū)神經(jīng)活動(dòng)的成像研究。