李澤福，李越，齊梵琨

1.廣州中醫(yī)藥大學(xué) 第三附屬醫(yī)院，廣東 廣州 510378；2.北京中醫(yī)藥大學(xué)，北京 102488；3.南方醫(yī)科大學(xué)，廣東 佛山 528300

皮膚老化可以分為內(nèi)源性老化和外源性老化。皮膚作為全身的最大器官，日常生活中不能避免地會暴露在日光下，日光中的紫外線輻射是容易造成皮膚的外源性老化即光損傷。光損傷主要是由紫外線中的UVA和UVB引起的，紫外線可誘發(fā)氧化應(yīng)激反應(yīng)。皮膚暴露于紫外線下，細(xì)胞水平下活性氧簇(ROS)的增加會損害表皮和真皮細(xì)胞中的脂類、蛋白和核酸，從而會產(chǎn)生曬傷反應(yīng)、皮膚光老化及光致癌效應(yīng)。目前，臭氧層的破壞越來越嚴(yán)重，地面紫外線輻射強度越來越大，光損傷皮膚病也越來越多，因此，緩解和改善皮膚光損傷的研究成為了當(dāng)前研究的熱點之一。

本研究將廣州中醫(yī)藥大學(xué)第三附屬醫(yī)院的臨床經(jīng)驗方“光復(fù)膏”進一步研發(fā)，制備得到光復(fù)凝膠制劑，以便于更好地服務(wù)臨床?！肮鈴?fù)”由蘆丁、枸杞子、絞股藍(lán)等中藥組成，在臨床應(yīng)用時，將中藥原粉進行粉碎后，由凡士林作為基質(zhì)，涂抹于受損皮膚，療效確切，但具有藥效成分溶出不完全、衛(wèi)生不達標(biāo)、涂抹用量較大及穩(wěn)定性差等問題。因此，本課題組將光復(fù)膏進行劑型改造，制備成了光復(fù)凝膠[1]。不僅解決了上述問題，對小鼠急性皮膚損傷有較好的治療作用，也提高了生物利用度和患者的依從性，具有一定的臨床參考價值，也為劑型的開發(fā)和改造提供了依據(jù)。

1 材料

1.1 儀器

粉碎機(永康市鉑歐五金制品有限公司，型號：800Y)；藥篩(DOLO，型號：DL-248)；脫毛器(Riwa，型號：RF-770A)；電熱恒溫水浴鍋(林茂科技有限公司)；恒溫磁力攪拌器(LICHEN，型號：DF-101)、313 nm UVB 燈管(冠鴻睿，型號：UVB-313)；G16型醫(yī)用高速離心機(白洋離心機廠)；T10 basic S25 型手持勻漿機(德國IKA公司)；大龍TopPette移液器(北京大龍興創(chuàng)實驗儀器有限公司)；WD-2102A型全自動酶標(biāo)儀(北京六一生物科技有限公司)。

1.2 試劑

磷酸緩沖液(批號：71010)、鐵氰化鉀溶液(批號：11342)、氯乙酸溶液(批號：120221)、氯化鐵溶液(批號：72032)、維生素C溶液(Vc,實驗室配制)、鹽酸(批號：11002)、冰醋酸(批號：11006)購自北京通廣精細(xì)化工有限公司；超氧化物歧化酶(SOD)試劑盒(批號：R22261)、丙二醛試劑盒(批號：R21869)、谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)試劑盒(批號：R21877)、過氧化氫酶(CAT)試劑盒(批號：R21885)購自上海源葉生物科技有限公司。

1.3 動物

SPF級昆明種小鼠，雌性[5周齡，體質(zhì)量(20±2)g，合格證號 SCXK(京)2018-0002，購于北京斯貝福實驗動物科技有限公司]。

2 方法與結(jié)果

2.1 中藥原液的提取與濃縮

取適量中藥細(xì)粉與輔料麩皮按比例混合均勻后滅菌備用，接種5%綠色木霉，于一定溫度下培養(yǎng)。

2.2 鐵離子還原能力測定

抗氧化劑(還原劑)是通過自身的還原作用，給出電子而清除自由基的。還原能力越強，抗氧化性越強，實驗中樣品的抗氧化性能使鐵氰化鉀的三價鐵還原成二價鐵(亞鐵氰化鉀)，二價鐵進一步在和氯化鐵的反應(yīng)下生成在700 nm處有最大吸收光度的普魯士藍(lán)，因此測定700 nm處吸光度的高低，可以代表抗氧化劑的還原能力，其吸光度和還原能力呈正相關(guān)。

測定鐵離子還原能力具體操作如下[2]：將提取液濃縮干燥，配置成不同濃度梯度的樣品溶液，依次加入一定量磷酸緩沖液、鐵氰化鉀溶液，混合均勻，將該體系置于50 ℃的水浴中反應(yīng)20 min，取出后迅速冷卻，加入三氯乙酸溶液，離心10 min 后取上清液再加入蒸餾水和一定濃度的氯化鐵溶液，混勻后反應(yīng)繼續(xù)10 min，測定其在波長700 nm處的吸光度，實驗重復(fù)3次。另以Vc溶液為標(biāo)準(zhǔn)對照，測定不同質(zhì)量濃度下Vc反應(yīng)的吸光度，將Vc質(zhì)量濃度作為自變量，吸光度作為因變量繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，其線性回歸方程為Y=0.898X+0.009，r=0.998。樣品還原Fe3+能力用Vc抗氧化當(dāng)量(AEAC,mg·mL-1)表示。

2.3 Box-Behnken響應(yīng)面法優(yōu)選中藥原液的提取工藝

2.3.1設(shè)計及結(jié)果 本實驗將中藥細(xì)粉與輔料麩皮質(zhì)量比A，培養(yǎng)溫度B和培養(yǎng)時間C作為3個考察因素，以Vc抗氧化當(dāng)量為評價指標(biāo)，優(yōu)化中藥原液的提取工藝。每個因素選取低、中、高3個水平，設(shè)計因素水平見表1，具體實驗設(shè)計和實驗結(jié)果見表2。

表1 中藥原液提取工藝優(yōu)化的設(shè)計實驗因素與水平

表2 Box-Behnken響應(yīng)面法優(yōu)選制備工藝實驗設(shè)計及其結(jié)果

2.3.2模型擬合 采用Design-Expert對上述數(shù)據(jù)進行分析，以Y擬合自變量模型，得到二次多項式回歸方程Y=21.34+8.36A-10.29B+12.02C-2.24AB+6.48AC-1.65BC+1.59A2+5.01B2+3.10C2，P<0.01，F(xiàn)=448.86，表明模型項顯著；失擬項P=0.186 5>0.05，失擬項不顯著，說明該模型擬合度和可信度均有效，建模成功；r=0.998 3，接近1，說明該模型實際值與預(yù)測值擬合性較高，可以用其進行預(yù)測。此外，由F檢驗可知3個因素對AEAC的影響按主次排位順序為C>B>A，這3種因素對AEAC的影響都極顯著，且交互作用顯著,具體結(jié)果見表3。

2.3.3響應(yīng)面優(yōu)化分析 根據(jù)擬合方程，通過Design-Expert V8.0.6.1軟件繪制評價指標(biāo)Vc抗氧化當(dāng)量隨因素變化的等高線圖和響應(yīng)面圖，見圖1。

由圖lA可知，在一定范圍內(nèi)，藥液的抗氧化能力隨著溫度的降低而增加；圖1B可知，藥輔比一定時，藥液的抗氧化能力隨著培養(yǎng)時間的延長而升高，當(dāng)藥輔比為3∶2時達到最高；由圖lC可知，當(dāng)培養(yǎng)時間一定時，藥液的抗氧化能力隨著溫度的升高而降低。響應(yīng)曲面的結(jié)果表明，當(dāng)藥輔比一定時，在較長的培養(yǎng)時間和較低的培養(yǎng)溫度下藥液的抗氧化能力較好。

表3 光復(fù)凝膠制備工藝方差分析

根據(jù)回歸模型分析可知，中藥原液的最優(yōu)制備條件為：藥輔比為2.31∶1.54，培養(yǎng)溫度為27.9 ℃，培養(yǎng)4.35 d。按照優(yōu)化的條件，考慮實際操作的可行性，各因素值保留為整數(shù)，藥輔比為3∶2，培養(yǎng)溫度為30 ℃，培養(yǎng)5 d。

2.4 光復(fù)凝膠的制備

取處方量中藥細(xì)粉與輔料麩皮按3∶2混勻后滅菌備用，接種5% 綠色木霉，于30 ℃ 培養(yǎng)5 d，加入75% 乙醇于80 ℃ 提取90 min，收集上清液，定容，備用。羥丙基甲基纖維素(HPMC)中注入蒸餾水(5%)，使其充分潤濕并分散，4 ℃冰箱放置24 h使其充分溶脹；溶脹后，依次加入溶解有處方量冰片的丙二醇和中藥提取濃縮液，邊加邊攪拌，攪拌均勻，即得。

注：A.藥材細(xì)粉與輔料麩皮質(zhì)量比;B.培養(yǎng)溫度;C.培養(yǎng)時間。圖1 各因素交互作用對ACAE影響的響應(yīng)面圖和等高線圖

2.5 藥效學(xué)研究

2.5.1光復(fù)凝膠對小鼠皮膚急性損傷后體質(zhì)量及皮膚外觀的影響

2.5.1.1動物分組 空白對照組(A)、模型組(B)、基質(zhì)組(C)、光復(fù)凝膠低劑量組(D)、光復(fù)凝膠中劑量組(E)和光復(fù)凝膠高劑量組(F)，每組10 只小鼠，并脫去小鼠背部的毛，脫毛范圍(2 cm×2 cm)。

2.5.1.2建立小鼠皮膚紫外損傷模型 開啟紫外線燈[3]，預(yù)熱15 min，照射燈光源距小鼠背部25 cm，輻照劑量為0.56 w·cm-2，每天照射2 h，連續(xù)照射2 周，此時小鼠皮膚肉眼可見表現(xiàn)出變紅、起皮，局部有紅疹、潰爛、有皮革樣觸感，即為造模成功[4-5]。除正常對照組之外，各光照組動物均置于鼠籠內(nèi)，照射前15 min各組分別涂抹凝膠基質(zhì)，光復(fù)凝膠低、中、高劑量，載提取液分別對應(yīng)藥材/凝膠2、3、4 g·mL-1，涂抹量為每只小鼠每次2 mg·cm-2。

2.5.1.3光復(fù)凝膠對小鼠皮膚急性損傷后體質(zhì)量及外觀的影響 照射前每隔2 d稱體質(zhì)量1次，觀察小鼠體質(zhì)量變化趨勢。每天觀察小鼠背部皮膚變化，第14天根據(jù)評分標(biāo)準(zhǔn)進行評分，具體評分標(biāo)準(zhǔn)[6]見表4。具體結(jié)果見圖2和表5。

表4 小鼠背部 UVB 照射區(qū)域皮膚損傷狀況評分標(biāo)準(zhǔn)

圖2 小鼠體質(zhì)量變化趨勢

表5 各組小鼠皮膚外觀狀態(tài)評分結(jié)果

注：與空白組相比，*P<0.05,**P<0.001;與紫外模型組相比，#P<0.05，##P<0.01，下同。

實驗結(jié)果表明，空白對照組的小鼠體質(zhì)量漲幅為36.55%，以此為參照，模型組與空白組的漲幅分別為16.21%和16.33%，光復(fù)凝膠低、中、高劑量組漲幅分別28.58%、30.36%和30.42%，說明該模型影響小鼠正常發(fā)育，給藥組小鼠體質(zhì)量比不給藥組小鼠的體質(zhì)量增長快，即光復(fù)凝膠對小鼠狀態(tài)恢復(fù)有良好的影響。除此之外，實驗結(jié)果表明，長期中、長波紫外線照射可引起昆明小鼠背部皮膚的光老化，如粗糙及皺紋(P<0.01)，在照射前外敷光復(fù)凝膠對紫外線有一定防護作用，且光復(fù)凝膠劑量越高，越能改善中、長波紫外線所致的昆明小鼠皮膚粗糙、脫屑及皺紋等光老化外觀狀態(tài)(P<0.01)，而基質(zhì)軟膏則無此作用。

2.5.2光復(fù)凝膠對小鼠損傷皮膚的抗氧化酶活性和丙二醛(MDA)含量的影響

2.5.2.1皮膚組織勻漿制備 取小鼠背部皮膚組織塊，在0.9%氯化鈉溶液中漂洗，除去血液，濾紙拭干稱質(zhì)量，放入5 mL燒杯中冰??；取預(yù)冷的0.9%氯化鈉溶液，將組織充分研磨制成10%的皮膚組織勻漿。將制備好的組織勻漿放入5 mL的離心管中以3000 r·min-1的速度離心15 min(離心半徑：100 mm)，取上清液。

2.5.2.2測定皮膚組織中各項生化指標(biāo) 嚴(yán)格按照試劑盒標(biāo)準(zhǔn)進行操作測量，實驗結(jié)果見表6。

與正常對照組相比較，模型組皮膚組織中的SOD活性明顯降低(P<0.01)；光復(fù)凝膠高劑量組與模型組相比較，小鼠皮膚組織中SOD表達明顯增加(P<0.01)；低劑量組、基質(zhì)組與模型組相比較，各數(shù)值差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。與正常對照組相比較，模型組小鼠皮膚組織MDA表達明顯增高(P<0.01)；光復(fù)凝膠低中高劑量組與模型組比較，小鼠皮膚組織中MDA表達明顯減少(P<0.01)；基質(zhì)組與模型組比較，各數(shù)值變化差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。與正常對照組相比較，模型組小鼠皮膚組織GSH-Px酶活力明顯降低(P<0.01)；光復(fù)凝膠中高劑量組與模型組比較，均能顯著增加GSH-Px酶活力(P<0.01)；低劑量組與模型組比較，各數(shù)值變化差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)；基質(zhì)組與模型組比較，各數(shù)值變化差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。與正常對照組相比較，模型組小鼠皮膚組織CAT活性明顯降低(P<0.01)；光復(fù)凝膠中高劑量組與模型組比較，小鼠皮膚組織中CAT活性都明顯增高(P<0.01)；基質(zhì)組與模型組比較，各數(shù)值變化差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。

由以上結(jié)果可知優(yōu)化后的光復(fù)凝膠可防止UVB輻照導(dǎo)致的皮膚損傷，其原因可能是通過提高皮膚組織內(nèi)SOD，GSH-Px和CAT的活性，從而有效地清除皮膚組織自由基，使得皮膚自身抵抗紫外線的能力增強。

表6 小鼠背部皮膚組織中各項生化指標(biāo)的活性

3 討論

3.1 劑型的選擇

凝膠劑是將藥物加入至適宜的高分子材料凝膠基質(zhì)中混勻，形成含有溶解、混懸或乳劑型狀態(tài)的乳膠稠厚液體或澄清透明、均一穩(wěn)定的半固體凝膠大分子網(wǎng)狀體系[7-8]。作為一種新型透皮給藥載體，凝膠能使有效成分以分子形式分散于大分子網(wǎng)絡(luò)體系中，形成質(zhì)地均勻細(xì)膩，具有良好生物相容性和穩(wěn)定性的局部外用制劑[9-11]。本研究中選擇的主要輔料為羥丙基甲基纖維素(hydroxypropyl methyl cellulose，HPMC)，其物理和化學(xué)性質(zhì)優(yōu)良，結(jié)構(gòu)中的非離子型纖維素醚不帶離子，親水親油基團和疏水基團的合理比例使其具有較好的與不同分了相互作用能力，是應(yīng)用最多、范圍最廣的親水凝膠骨架材料[12-13]。因此，本實驗結(jié)合凝膠劑的優(yōu)點，將膏劑改變劑型成以HPMC為主要材料的凝膠劑，獲得了澄清透明、均勻細(xì)膩、涂展性良好且使用安全無刺激的光復(fù)凝膠，從而增加藥物溶解度、提高生物利用度、增強抗紫外線能力，為進一步研究與開發(fā)透皮給藥新劑型提供了依據(jù)。

3.2 優(yōu)選方法的選擇

響應(yīng)面法是通過一系列確定性的試驗，擬合一個響應(yīng)面來模擬真實極限狀態(tài)的曲面圖。利用響應(yīng)面設(shè)計試驗，根據(jù)Box-Behnken的試驗設(shè)計得到最優(yōu)的考察因素和響應(yīng)值來避免傳統(tǒng)數(shù)理統(tǒng)計存在的問題，能夠清晰明確地看出各因素之間的交互作用，除此之外，還能確定最佳實驗條件并預(yù)測最佳值[14-17]。響應(yīng)面法計算比較簡便，是解決實際問題的有效手段。與正交試驗相比，響應(yīng)面法在優(yōu)化實驗條件過程中，能夠通過中心組合實驗設(shè)計對各個水平進行分析，結(jié)果精準(zhǔn)、可靠，而正交試驗只能對單個實驗進行分析，數(shù)據(jù)可靠性較響應(yīng)面法低。因此，本研究選擇了Box-Behnken響應(yīng)面法篩選光復(fù)凝膠的最優(yōu)工藝。

3.3 生化指標(biāo)的選擇

SOD是生物體系中抗氧化酶系的重要組成成員，廣泛分布在微生物、植物和動物體內(nèi)。其具有特殊的生理活性，是清除生物體內(nèi)自由基的主要物質(zhì)。生物體中SOD的水平可以反映機體的衰老狀況，現(xiàn)已證實，有60多種疾病是由氧自由基引起的。SOD還能抵抗和阻斷氧自由基對細(xì)胞的損傷，及時修復(fù)受損細(xì)胞，恢復(fù)自由基對細(xì)胞的損傷。此外，SOD還可以通過過氧化作用攻擊皮膚細(xì)胞中的脂質(zhì)體，產(chǎn)生MDA，MDA可引起組織中的大分子交聯(lián)反應(yīng)，損害真皮組織。因此將SOD與MDA放在一起來評估皮膚組織氧化損傷的程度。GSH-Px，是體內(nèi)清除過氧化氫和許多有機氫過氧化物的重要酶，通過催化谷胱甘肽使有毒的過氧化氫及脂質(zhì)過氧化物還原為無毒的羥基化合物，從而保護細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)及功能不受過氧化物的損傷和干擾[18]，也是機體抗過氧化能力指標(biāo)之一。

4 結(jié)論

本研究Box-Behnken響應(yīng)面法優(yōu)選出的光復(fù)凝膠質(zhì)量穩(wěn)定可控，制備工藝簡便，為實際生產(chǎn)提供了理論依據(jù)。且通過藥效實驗證明光復(fù)凝膠可以通過提高皮膚組織內(nèi)SOD、GSH-Px和CAT的活性，增強皮膚自身抵抗紫外線的能力，對小鼠急性皮膚損傷有較好的治療作用，也為光復(fù)凝膠的臨床應(yīng)用提供了一定的參考價值。