馮紫薇，張媛，2，孟磊，趙婷，2，石玥，魏勝利，2*

1.北京中醫(yī)藥大學(xué) 中藥學(xué)院，北京 102488；2.中藥材規(guī)范化生產(chǎn)教育部工程研究中心，北京 100102

何首烏為蓼科植物何首烏PolygonummultiflorumThumb.的干燥塊根，生何首烏性平偏涼，有解毒、截瘧、潤(rùn)腸燥的功效，制何首烏又可以補(bǔ)肝腎、益精血、烏須發(fā)、強(qiáng)筋骨，在藥品、食品、保健品、化妝品業(yè)應(yīng)用廣泛[1]?，F(xiàn)代研究表明，何首烏中有多種有效成分，反式二苯乙烯苷具有抗衰老、保護(hù)神經(jīng)細(xì)胞、調(diào)節(jié)免疫、清除自由基、提高記憶力、保肝等多種藥理活性[2]，游離蒽醌和結(jié)合蒽醌均有調(diào)節(jié)免疫、抗腫瘤的藥理活性[3-5]，而結(jié)合蒽醌又有較強(qiáng)的瀉下作用。與此同時(shí)，何首烏中產(chǎn)生肝毒性的成分也引起了大家的關(guān)注，有研究推測(cè)順式二苯乙烯苷是何首烏特異性肝損傷的重要易感物質(zhì)[6-7]，通過(guò)控制其含量可減輕何首烏的肝毒性。張樂(lè)等[8]通過(guò)對(duì)順式二苯乙烯苷與肝損傷相關(guān)性的研究，初步得出了順式二苯乙烯苷含量的建議安全限度為0.1%。何首烏的初加工技術(shù)雖然簡(jiǎn)單但對(duì)何首烏的質(zhì)量影響甚大[9]。本研究擬通過(guò)以順式二苯乙烯苷含量為毒性指標(biāo)，以反式二苯乙烯苷、兩游離蒽醌(大黃素、大黃素甲醚)和兩結(jié)合蒽醌(大黃素葡萄糖苷、大黃素甲醚葡萄糖苷)的含量為功效指標(biāo)，建立基于初加工技術(shù)的高反式二苯乙烯苷型、高游離蒽醌型和高結(jié)合蒽醌型3類(lèi)優(yōu)質(zhì)何首烏藥材定向加工生產(chǎn)體系[10]。

1 材料與方法

1.1 材料

Agilent Technologies 1260 Infinity型高效液相色譜儀系統(tǒng)(安捷倫科技有限公司)；ME104型萬(wàn)分之一電子分析天平(梅特勒-托利多儀器有限公司)；BT 25S型十萬(wàn)分之一電子分析天平(賽多利斯上海貿(mào)易有限公司)；KQ5200D型超聲清洗器(江蘇省昆山市超聲儀器有限公司)；FW100型高速萬(wàn)能粉碎機(jī)(天津市泰斯特儀器有限公司)。

甲醇(分析純，北京化工廠)；甲醇(色譜純，F(xiàn)isher)；乙腈(色譜純，F(xiàn)isher)；屈臣氏蒸餾水；對(duì)照品2，3，5，4′-四羥基二苯乙烯-2-O-β-D-葡萄糖苷、反式-二苯乙烯苷、大黃素、大黃素甲醚、大黃素-8-O-β-D-葡萄糖苷購(gòu)自中國(guó)藥品生物制品檢定所，純度均>98%，大黃素甲醚-8-O-β-D-葡萄糖苷(上海源葉生物科技有限公司，純度>98%)。順式-二苯乙烯苷自制，參考文獻(xiàn)[11]方法，通過(guò)反式-二苯乙烯苷在紫外365 nm下轉(zhuǎn)化而得，純度>98%。

2年生何首烏塊根經(jīng)北京中醫(yī)藥大學(xué)魏勝利教授鑒定為蓼科植物何首烏P.multiflorumThumb.的塊根。

1.2 方法

1.2.1樣品處理 設(shè)置陰干、自然晾曬、真空干燥、微波干燥、40 ℃烘干、50 ℃烘干、60 ℃烘干、70 ℃烘干、80 ℃烘干9個(gè)處理，每個(gè)處理重復(fù)3次。

選取大小均一何首烏塊根10個(gè)，切成邊長(zhǎng)為5 cm的方塊，混合均勻后隨機(jī)分為6組。其中1組直接切制成厚度為1 cm的片，置于50 ℃烘箱烘至干燥，不發(fā)汗處理。其余5組置于50 ℃烘箱，分別烘5、10、20、25 、30 h后取出，再發(fā)汗48 h，最后切制成厚度為1 cm的片50 ℃烘至干燥。

1.2.2含量測(cè)定 參考李雨萌等[12]HPLC一測(cè)多評(píng)法，對(duì)何首烏中的反式二苯乙烯苷、順式二苯乙烯苷、大黃素-8-O-β-D-葡萄糖苷、大黃素甲醚-8-O-β-D-葡萄糖苷、大黃素、大黃素甲醚6個(gè)成分進(jìn)行含量測(cè)定，對(duì)照品和供試品溶液HPLC圖見(jiàn)圖1。

注：A.對(duì)照品溶液；B.供試品溶液；1.順式二苯乙烯苷；2.反式二苯乙烯苷；3.大黃素-8-O-β-D-葡萄糖苷；4.大黃素甲醚-8-O-β-D-葡萄糖苷；5.大黃素；6.大黃素甲醚。圖1 對(duì)照品和供試品溶液的HPLC圖

1.2.3統(tǒng)計(jì)分析 所有數(shù)據(jù)均采用Microsoft Excel software 2010及SPSS 19.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。采用單因素方差分析(ANOVA)對(duì)Duncan′s進(jìn)行單因素檢驗(yàn)，其中P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同干燥方式對(duì)何首烏質(zhì)量成分的影響

據(jù)表1、圖2的何首烏不同干燥方式活性成分含量比較可知，曬干和陰干能使順、反式二苯乙烯苷、大黃素苷、大黃素、大黃素甲醚等成分含量維持在較高水平，但曬干的何首烏中大黃素和大黃素甲醚2種游離蒽醌含量較低。真空干燥和微波干燥時(shí)順、反式二苯乙烯苷含量均較低。真空干燥時(shí)大黃素苷含量較低而大黃素含量較高，微波干燥結(jié)果與之相反，大黃素甲醚苷含量較高、大黃素甲醚含量較低。在烘干的干燥方式中，隨著烘干溫度升高何首烏大黃素苷含量降低、大黃素含量升高，以60、70 ℃烘干為例，70 ℃烘干比60 ℃烘干大黃素苷含量降低了20.77%、大黃素含量升高了60.56%。反式二苯乙烯苷隨溫度升高有較弱的下降趨勢(shì)，而順式二苯乙烯苷未有明顯規(guī)律。

表1 何首烏不同干燥方式活性成分質(zhì)量分?jǐn)?shù) %

注：*P<0.05；**P<0.01。

注：A.順式二苯乙烯苷；B.反式二苯乙烯苷；C.2種結(jié)合蒽醌；D.2種游離蒽醌。圖2 何首烏不同干燥方式活性成分質(zhì)量分?jǐn)?shù)比較圖

2.2 發(fā)汗前不同烘干時(shí)間對(duì)何首烏質(zhì)量成分的影響

據(jù)表2、圖3可知，隨發(fā)汗前烘干時(shí)間的增加，何首烏中呈現(xiàn)出順式二苯乙烯苷和大黃素含量逐漸升高、而反式二苯乙烯苷和大黃素苷含量逐漸降低的趨勢(shì)，大黃素甲醚、大黃素甲醚苷無(wú)顯著規(guī)律變化。蒽醌類(lèi)成分尤其是大黃素苷和大黃素比二苯乙烯苷類(lèi)含量受發(fā)汗前烘干時(shí)間影響更為顯著。以發(fā)汗前烘10、20 h為例，大黃素苷在樣品烘20 h后發(fā)汗烘干時(shí)比烘10 h后發(fā)汗烘干時(shí)含量下降了74.71%，而反式二苯乙烯苷此時(shí)含量?jī)H下降了9.30%；大黃素在樣品烘20 h后發(fā)汗烘干時(shí)比烘10 h后發(fā)汗烘干時(shí)含量升高了74.88%，而順式二苯乙烯苷此時(shí)含量?jī)H升高了34.28%。

3 結(jié)論與討論

根據(jù)張樂(lè)等[8]的研究結(jié)果，將順式二苯乙烯苷含量低于0.1%作為何首烏加工的安全限度，不同干燥方式和發(fā)汗前不同烘干時(shí)間的何首烏均能達(dá)到安全限度，在保障安全性的基礎(chǔ)上進(jìn)行基于初加工技術(shù)的不同類(lèi)型何首烏定向加工研究。高含量反式二苯乙烯苷型何首烏定向加工方法為：將藥材置50 ℃條件下烘5～10 h，發(fā)汗，曬干或陰干。高含量結(jié)合蒽醌型何首烏定向加工方法為：將藥材置50 ℃條件下烘5～10 h，發(fā)汗，曬干。高含量游離蒽醌型何首烏定向加工方法為：將藥材置50 ℃條件下烘25～30 h，發(fā)汗，真空干燥、陰干或70～80 ℃烘干。

3.1 干燥方式及發(fā)汗前不同烘干時(shí)間對(duì)二苯乙烯苷類(lèi)成分含量影響

曬干和陰干的何首烏中順、反式二苯乙烯苷含量較高，推測(cè)可能在適宜溫度尤其是有適宜光照的條件下，何首烏中含有的可促使二苯乙烯苷合成的相關(guān)酶系活化，產(chǎn)生酶促效應(yīng)使順、反式二苯乙烯苷的量增加。真空干燥和微波干燥時(shí)順、反式二苯乙烯苷含量均較低，文獻(xiàn)報(bào)道二苯乙烯苷類(lèi)熱穩(wěn)定性較差[13]，推測(cè)微波加熱瞬時(shí)的高溫會(huì)對(duì)二苯乙烯苷類(lèi)成分產(chǎn)生破壞，真空干燥同時(shí)有高溫和含水量迅速降低雙重因素的影響，影響相關(guān)酶促效應(yīng)的發(fā)生使反式二苯乙烯苷類(lèi)含量更低。發(fā)汗前不同烘干時(shí)間實(shí)驗(yàn)的結(jié)果也證明了含水量對(duì)二苯乙烯苷類(lèi)的影響，發(fā)汗前何首烏含水量越大順、反式二苯乙烯苷含量越低，而反式二苯乙烯苷含量越高。

表2 何首烏發(fā)汗前不同烘干時(shí)間活性成分質(zhì)量分?jǐn)?shù) %

注：*P<0.05；**P<0.01。

注：A.順式二苯乙烯苷；B.反式二苯乙烯苷；C.2種結(jié)合蒽醌；D.2種游離蒽醌。圖3 何首烏發(fā)汗前不同烘干時(shí)間活性成分質(zhì)量分?jǐn)?shù)比較圖

3.2 干燥方式及發(fā)汗前不同烘干時(shí)間對(duì)蒽醌類(lèi)成分含量影響

蒽醌類(lèi)成分含量受干燥方式的影響較為明顯。結(jié)合蒽醌含量以曬干方式最高，陰干次之，而游離蒽醌則以陰干方式含量最高。據(jù)報(bào)道，何首烏在干燥過(guò)程中結(jié)合蒽醌易被酶水解，陰干的溫度適合水解酶發(fā)揮作用，結(jié)合型蒽醌的分解率高于曬干方式，所以導(dǎo)致結(jié)合型蒽醌的含量降低，游離蒽醌的含量升高[14]。曬干時(shí)的光照可能破壞水解酶活性，從而降低結(jié)合型蒽醌向游離型蒽醌的轉(zhuǎn)化率，最終導(dǎo)致降低游離型蒽醌的含量。

3.3 何首烏定向加工的研究前景

反式二苯乙烯苷、結(jié)合型蒽醌和游離型蒽醌是何首烏中的3類(lèi)主要活性成分?，F(xiàn)代藥理研究表明，反式二苯乙烯苷具有抗衰老、調(diào)節(jié)免疫、提高記憶力、抗血小板凝集等多種活性[2，15]，部分游離蒽醌有誘導(dǎo)癌細(xì)胞凋亡、逆轉(zhuǎn)腫瘤多藥耐藥性、抑制金黃色葡萄球菌生長(zhǎng)等藥理活性[16-17]，結(jié)合蒽醌有較強(qiáng)的瀉下作用[18]，該3類(lèi)成分可能分別與補(bǔ)肝腎強(qiáng)筋骨、解毒截瘧和潤(rùn)腸燥的功效相關(guān)聯(lián)。高含量反式二苯乙烯苷型何首烏可能更側(cè)重補(bǔ)益功效；高含量結(jié)合蒽醌型何首烏可能更側(cè)重潤(rùn)腸燥作用；高含量游離蒽醌型何首烏可能有解毒截瘧的作用趨勢(shì)。隨著何首烏毒性及功效物質(zhì)基礎(chǔ)的進(jìn)一步研究和“精準(zhǔn)醫(yī)學(xué)” “精準(zhǔn)藥材”的發(fā)展，何首烏的定向加工將有望對(duì)臨床中藥的使用產(chǎn)生更加重要的作用。當(dāng)然，本研究?jī)H基于對(duì)何首烏生品的部分初加工技術(shù)進(jìn)行討論，定向加工對(duì)何首烏藥效的影響仍需大量藥理和臨床試驗(yàn)驗(yàn)證。