曹權，劉為營，石立瑩，甘建琛，劉民，朱云娟，湯華

1天津醫(yī)科大學·天津市生命中心實驗室，天津 3000702天津醫(yī)科大學第二醫(yī)院

結直腸癌在世界范圍內(nèi)是一類多發(fā)的惡性腫瘤，其臨床發(fā)病率居惡性腫瘤第三位，臨床致死率在所有腫瘤中位居第三[1]。據(jù)統(tǒng)計，全世界每年被診斷出患結直腸癌的病例多達百萬，超過1/2的患者死亡[2]。由于結直腸癌難以及時發(fā)現(xiàn)，往往一經(jīng)診斷即為晚期，預后極差。近年研究發(fā)現(xiàn)，微小RNA(miRNA)在腫瘤發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮復雜和多樣性的作用[3,4]。miRNA是一種長度約22 nt的非編碼RNA，能結合在其相應靶基因的3′-UTR區(qū)域，進而通過調(diào)控靶基因的表達參與腫瘤的發(fā)生發(fā)展[5,6]。研究表明，miR-621通過下調(diào)CAPRIN1表達在肝癌進展中充當腫瘤抑制基因，并且可能是肝癌新的潛在診斷和預后生物標志物[7]。另外，miR-621通過抑制FBXO11和增強p53活性抑制來增強乳腺癌細胞對PTX/CBP化學療法的化學敏感性[8]。然而，在結直腸癌中miR-621的功能仍不清楚。本研究中，我們檢測了miR-621在結直腸癌組織中的表達，并研究其對細胞活性、細胞增殖和遷移侵襲的影響。

1 材料與方法

1.1 材料 組織樣本與細胞株:20對結直腸癌患者的癌組織及其相應癌旁正常組織(距癌組織邊緣>5 mm)來源于2015年11月天津醫(yī)科大學第二醫(yī)院普通外科，所有的組織樣本均來自于未經(jīng)過放化療的結直腸癌患者手術切除，且經(jīng)過術后病理學證實。本研究經(jīng)過天津醫(yī)科大學第二醫(yī)院倫理委員會同意進行。結直腸癌細胞系HCT116和SW480為本實驗室所保存，培養(yǎng)基為DMEM(GIBCO BRL公司，美國)：含10%胎牛血清和1%雙抗(100 μg/mL青霉素和100 μg/mL鏈霉素)。細胞培養(yǎng)在含5%CO2的細胞培養(yǎng)孵箱中進行，溫度為37 ℃。主要試劑:DMEM培養(yǎng)基、無血清培養(yǎng)基Opti-MEMα、胰蛋白酶和胎牛血清購自美國GIBCO BRL公司；Lipofectamine2000脂質(zhì)體購自美國Invitrogen公司；SYBR Premix Ex Taq試劑盒購自日本TaKaRa公司，引物由通用生物系統(tǒng)(安徽)有限公司合成；Transwell小室購自美國Corning Incorporated公司，Matrigel膠來自美國BD公司；實驗所用抗體全部購自中國天津賽爾生物技術有限公司。

1.2 miR-621表達檢測 采用qRT-PCR法。使用TRIzol裂解液提取結直腸癌組織與結直腸癌細胞中的總RNA。提取后的總RNA用逆轉(zhuǎn)錄法制備RT產(chǎn)物得到相應cDNA。其中，miR-621的逆轉(zhuǎn)錄法制備RT產(chǎn)物所需要的RT引物為5′-GTCGTATC-CAGTGCAGGGTCCGAGGTGCACTGGATACGACAGG-TAAGC-3′；制備內(nèi)參U6的RT產(chǎn)物所用的RT引物為：5′-GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTATTCG-CACTGGATACGACAAAATATGGAAC-3′。使用Bio-Rad iQ5實時熒光定量PCR儀檢測miR-621、U6的RNA水平。反應體系為15 μL：2×SYBR Premix Ex Taq 7.5 μL；PCR正向引物(5 pmol/μL) 1 μL;PCR反向引物(5 pmol/μL)1 μL；RT產(chǎn)物cDNA 1 μL；RNA酶free H2O 4.5 μL。擴增條件：95 ℃預變性4 min；95 ℃ 30 s，56 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，40 個循環(huán)。miR-621與U6 RNA的擴增引物序列：miR-621正向引物:5′-TGCGGGGCTAGCAACAGCGCTT-3′，反向引物:5′-CCAGTGCAGGGTCCGAGGT-3′；U6 正向引物:5′-TGCGGGTGCTCGCTTCGGCAGC-3′，反向引物:5′-CCAGTGCAGGGTCCGAGGT-3′。數(shù)據(jù)計算采用2-ΔΔCt法。

1.3 質(zhì)粒構建 pcDNA3/pri-miR-621質(zhì)粒構建：以HCT116的基因組DNA為模板，PCR擴增pri-miR-621的DNA片段。擴增正向引物：5′-CGCGGATCCTCCCCAAGATGCTCTACTCTT-3′；反向引物：5′-CCTGAATTCAGCCACTGCGCCTGGCCTACA-3′。擴增后的PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳后進行回收，并且經(jīng)BamHⅠ和EcoRⅠ兩個酶切位點酶切，連接至經(jīng)相同酶切位點酶切后的空載體pcDNA3上。

1.4 細胞轉(zhuǎn)染 使用Lipofectamine2000對相應結直腸癌細胞HCT116和SW480進行轉(zhuǎn)染。具體方法按照說明書操作。

1.5 miR-621干預后結直腸癌細胞活性檢測 采用MTT實驗。取對數(shù)生長期的結直腸癌細胞HCT116和SW480，分為NC組、miR-621組、ASO-NC組、ASO-miR-621組，種板后第2天對細胞分別轉(zhuǎn)染pcDNA3、pcDNA3-miR-621、ASO-NC及ASO-miR-621，轉(zhuǎn)染24 h后分別取3 000/孔(HCT116細胞系)、5 000/孔(SW480細胞系)種于96孔細胞培養(yǎng)板中(設置5個復孔)，放入細胞培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)，在24、48和96 h三個時間點分別對孔內(nèi)細胞用DMSO和MTT進行處理，之后檢測570 nm波長處的吸光度值。細胞活性=對照組吸光度值-實驗組吸光度值/(對照組吸光度值-空白組吸光度值)×100%。

1.6 細胞克隆形成率測算 采用平板克隆形成實驗。取對數(shù)生長期的結直腸癌細胞HCT116和SW480，分為NC組、miR-621組、ASO-NC組、ASO-miR-621組，種板后第2天對細胞分別轉(zhuǎn)染pcDNA3、pcDNA3-miR-621、ASO-NC及ASO-miR-621，轉(zhuǎn)染24 h后分別取300/孔(HCT116細胞系)、500/孔(SW480細胞系)種在6孔細胞培養(yǎng)板中(設置復孔)，每3～5 d更換一次細胞培養(yǎng)板中的培養(yǎng)基，并在顯微鏡下持續(xù)觀察孔板內(nèi)細胞生長狀況，待細胞數(shù)量達到≥50的集落形成標準后，從細胞培養(yǎng)孵箱中取出細胞培養(yǎng)板，用2%的結晶紫溶液對孔內(nèi)細胞染色，拍照記錄每孔細胞克隆數(shù)，平行孔取均值。

1.7 細胞遷移侵襲能力檢測 采用Transwell遷移侵襲實驗。取對數(shù)生長期的結直腸癌細胞HCT116和SW480，分為NC組、miR-621組、ASO-NC組、ASO-miR-621組，種板后第2天對細胞分別轉(zhuǎn)染pcDNA3、pcDNA3-miR-621、ASO-NC及ASO-miR-621，轉(zhuǎn)染24 h后分別取3×104個/孔(HCT116細胞系)、5×104個/孔(SW480細胞系)和200 μL無血清DMEM培養(yǎng)基混勻后接種在已放入24孔板內(nèi)的Transwell小室中，24孔板內(nèi)加入700 μL含10%血清的DMEM培養(yǎng)基。侵襲實驗在遷移實驗基礎上將Matrigel膠融化后與不含血清的DMEM培養(yǎng)基以1∶4混合后加入在Transwell小室的上層面后，再放入細胞培養(yǎng)孵箱中4 h，使其凝固后繼續(xù)細胞遷移實驗的操作。接種完畢后將細胞培養(yǎng)板放入培養(yǎng)箱中分別繼續(xù)培養(yǎng)約24、48 h后，取出小室后擦凈內(nèi)側(cè)細胞，再使用固定液(甲醇與冰乙酸的比例為3∶1)將小室外側(cè)細胞固定，利用結晶紫對小室外細胞進行染色并用顯微鏡拍照記錄后。

2 結果

2.1 miR-621在結直腸癌及癌旁正常組織中的表達比較 miR-621在結直腸癌、癌旁正常組織中的相對表達量分別為0.49±0.03、1.03±0.05，miR-621在結直腸癌組織中表達低于癌旁正常組織(P<0.01)。

2.2 miR-621對結直腸癌細胞增殖、遷移和侵襲能力的影響 過表達miR-621可抑制細胞活性，封閉內(nèi)源性miR-621后可促進結直腸癌細胞的活性(表1)。對于HCT116細胞，NC組、miR-621組、ASO-NC組、ASO-miR-621組結直腸癌細胞克隆形成率分別為(32.33±4.12)%、(11.67±2.32)%、(29.12±3.54)%、(72.33±7.24)%;對于SW480細胞，NC組、miR-621組、ASO-NC組、ASO-miR-621組結直腸癌細胞克隆形成率分別為(18.00±2.48)%、(6.14±0.98)%、(19.67±3.09)%、(49.02±6.28)%。對于HCT116細胞，NC組、miR-621組、ASO-NC組、ASO-miR-621組結直腸癌細胞遷移數(shù)量分別為(187±11)、(129±8)、(169±11)、(412±32)個，對于SW480細胞，NC組、miR-621組、ASO-NC組、ASO-miR-621組結直腸癌細胞遷移數(shù)量分別為(108±7)、(65±3)、(116±6)、(268±30)個，對于HCT116細胞，NC組、miR-621組、ASO-NC組、ASO-miR-621組結直腸癌細胞侵襲數(shù)量分別為(128±7)、(61±6)、(118±7)、(187±28)個，對于SW480細胞，NC組、miR-621組、ASO-NC組、ASO-miR-621組結直腸癌細胞侵襲數(shù)量分別為(105±10)、(58±5)、(118±6)、(170±19)個，miR-621組細胞生長活性、增殖和遷移侵襲能力低于NC組(P均<0.05)，ASO-miR-621組細胞生長活性、增殖和遷移侵襲能力高于ASO-NC組(P均<0.05)。

表1 各組結直腸癌細胞活性比較

3 討論

近年來，在腫瘤組織中發(fā)現(xiàn)較多的miRNA異常表達，多數(shù)異常表達的miRNA在腫瘤發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要作用[9～11]。最近報道顯示，miR-621在肝癌組織和細胞中低表達，且在肝癌中充當抑癌基因角色[7,12]。另外，還有報道稱miR-621在乳腺癌細胞中可通過抑制FBXO11表達提高p53的活性[8]。然而關于miR-621在結直腸癌中的作用仍未報道。因此，我們選取了miR-621作為結直腸癌細胞的實驗研究對象，我們猜測miR-621可能通過某種方式使結直腸癌細胞的生物功能得到了抑制，從而通過實驗研究miR-621在結直腸癌中的功能。首先，我們用qRT-PCR法檢測了miR-621在結直腸癌細胞中的表達情況，結果表明，相比于癌旁正常組織，miR-621在結直腸癌中的表達較低。而過表達miR-621是否可抑制結直腸癌細胞的一些生物功能有待探究。我們猜想miR-621可能通過一些生物機制抑制結直腸癌細胞的發(fā)生發(fā)展。因此我們通過MTT、細胞平板克隆形成實驗及Transwell遷移侵襲實驗探究miR-621對結直腸癌細胞惡性表型的影響。實驗結果顯示，miR-621可抑制結直腸癌的細胞活性、增殖能力及遷移侵襲能力，表明miR-621在結直腸癌中發(fā)揮了抑癌基因的作用。

綜上所述，miR-621在結直腸癌組織中呈低表達;miR-621可抑制結直腸癌細胞的活性、增殖和遷移侵襲，起到抑癌基因的作用。