黃偉釗，吳穎猛，胡榮貴，葉紅雨，傅劍華

1中山大學(xué)腫瘤防治中心·華南腫瘤學(xué)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室廣東食管癌研究所，廣州510089；2 中山市人民醫(yī)院

基金項(xiàng)目：廣東省自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(2016A030310409)。

第一作者簡(jiǎn)介：黃偉釗(1978-)，男，副主任醫(yī)師，博士，主要研究方向?yàn)槭彻馨┑木C合治療。E-mail： zhijiaoyy@163.com

通信作者簡(jiǎn)介：傅劍華(1965-)，男，主任醫(yī)師，博士，主要研究方向?yàn)槭彻馨┑木C合治療。E-mail： jiahu0101@126.com

食管癌是最常見(jiàn)的惡性腫瘤之一，是世界上第八大最常見(jiàn)癌癥和第六大最常見(jiàn)的癌癥死亡原因[1]。食管癌主要分為兩型：食管鱗狀細(xì)胞癌(ESCC)與食管腺癌(EAC)，我國(guó)主要以前者為主。微小RNA(miRNA)是長(zhǎng)度為20～22個(gè)核苷酸的非編碼RNA亞型，與多種腫瘤的發(fā)生發(fā)展有關(guān)，如非小細(xì)胞肺癌[2]。通常情況下，miRNA可與靶基因的3′-UTR結(jié)合，從而促進(jìn)癌細(xì)胞的增殖、遷移[3]。如miR-216a可通過(guò)抑制TLR48來(lái)抑制腎癌細(xì)胞的生長(zhǎng)。miR-1269家族包括miR-1269a和miR-1269b兩個(gè)成員，miR-1269a是在大腸癌中首次被發(fā)現(xiàn)的一種癌基因miRNA，其基因位于染色體4q13.2。miR-1269a可通過(guò)與轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β12(TGF-β12)間的反饋環(huán)促進(jìn)癌癥的發(fā)展和轉(zhuǎn)移[4]。在肝癌中，miR-1269a可靶向調(diào)節(jié)LRP6和SPATS2L13的表達(dá)來(lái)影響其發(fā)展[5]。SOX6屬于性別決定區(qū)Y框相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子D亞家族的一員,染色體位置為11號(hào)染色體短臂15.2～15.3區(qū)域，具有多種生物學(xué)功能，如促進(jìn)軟骨形成、神經(jīng)發(fā)育及骨髓造血等[6]。SOX6基因編碼的蛋白可通過(guò)高遷移率族蛋白與DNA結(jié)合，在細(xì)胞分化、增殖及凋亡中發(fā)揮關(guān)鍵作用[7]。在食管癌的相關(guān)研究中發(fā)現(xiàn)，SOX6基因是miR-1269a的靶基因，miR-1269a可抑制SOX6蛋白表達(dá)，促進(jìn)腫瘤的發(fā)生發(fā)展。但兩者在食管癌中的具體作用機(jī)制尚不清楚，有待進(jìn)一步研究。2013年1月～2019年6月，我們檢測(cè)了食管癌組織中miR-1269a和SOX6的表達(dá)，并探究二者在食管癌發(fā)生發(fā)展中的作用及意義。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選取2013年1月～2019年6月于中山市人民醫(yī)院住院治療的食管癌患者120例，納入標(biāo)準(zhǔn)：①經(jīng)病理活檢或術(shù)后病理檢查明確診斷；②均為首次診斷食管癌，既往未接受過(guò)抗腫瘤治療；③臨床病理資料完整，且均簽署知情同意書(shū)。排除標(biāo)準(zhǔn)：①患有其他消化系統(tǒng)疾病，如反流性食管炎、胃潰瘍等；②患有其他系統(tǒng)疾病或惡性腫瘤，如胃癌、肺癌等；③患有免疫功能缺陷疾病。120例患者中，男109例、女11例，年齡30～70(55.3±3.7歲)，其中≥55歲者52例，<55歲者68例；組織病理檢查結(jié)果顯示，中低分化55例，高分化65例；腫瘤TNM分期(參照文獻(xiàn)[8]標(biāo)準(zhǔn))：Ⅰ期51例，Ⅱ期33例，Ⅲ期20例，Ⅳ期16例；有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移52例；腫瘤浸潤(rùn)深度T1：42例，T2：29例，T3：28例，T4：21例。

1.2 食管癌及癌旁正常組織中miR-1269a和SOX6表達(dá)檢測(cè) 收集術(shù)中獲取的新鮮癌組織和癌旁正常組織(距離癌組織>5 mm)，保存在液氮中，立即轉(zhuǎn)運(yùn)至實(shí)驗(yàn)室，置于-80 ℃冰箱中保存。取50 mg標(biāo)本，應(yīng)用TRIzol法提取總RNA(試劑盒購(gòu)自美國(guó)Invitrogen公司)，使用微量核酸蛋白檢測(cè)儀檢測(cè)RNA濃度，將符合標(biāo)準(zhǔn)的RNA凍存，備用。使用TaqMan miRNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒(購(gòu)自美國(guó)Invitrogen公司)將RNA反轉(zhuǎn)錄合成cDNA，反應(yīng)條件：42 ℃ 60 min，42 ℃ 30 min，85 ℃ 5 min。U6作為內(nèi)參基因。反應(yīng)條件：65 ℃ 5 min ，16 ℃ 30 min，72 ℃ 15 min。實(shí)驗(yàn)步驟嚴(yán)格按照反轉(zhuǎn)錄試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。miR-1269a正向引物：5′-CGTTGGAT-GAAGTCTCATGATAGGCCATC-3′，反向引物:5′-ATTGCGTGTCGT-GGAGTCGGCAATGC-3′；SOX6 正向引物：5′-GCTGGAGGAGATGACTC-GGAC-3′，反向引物:5′-GTTCGGTCCACTATTGATGGGG-3′；內(nèi)參基因U6正向引物:5′-GCTTCGGCAGCACATATACTAAAAT-3′，反向引物:5′-GGCTGAGAACTGAATTCCA-3′；以GAPDH作為內(nèi)參照，正向引物:5′-CGGATTTGGT-CGTATTGGG-3′，反向引物:5′-TGCTGGAAGATGGTGATGGGATT-3′。反應(yīng)體系：cDNA 1.0 μL，正反向引物各1.0 μL，TaqDNA聚合酶0.125 μL，1 μL 20×SYBR Green及1 μL dNTPs，用去離子水補(bǔ)足體系至20 μL。PCR擴(kuò)增反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性5 min，95 ℃ 15 s，60 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，共循環(huán)40 次，72 ℃延伸5 min。每個(gè)樣本至少重復(fù)3次。用FastStart Essential DNA Green Master(美國(guó)羅氏制藥國(guó)際集團(tuán)公司)檢測(cè)miR-1269a和SOX6的相對(duì)表達(dá)量，以2-ΔΔCt法計(jì)算miR-1269a和SOX6的相對(duì)表達(dá)量。

2 結(jié)果

2.1 食管癌組織與癌旁組織中miR-1269a、SOX6 mRNA表達(dá)比較 食管癌組織與癌旁正常組織中miR-1269a的相對(duì)表達(dá)量分別為1.243±0.213、0.816±0.098，癌組織中miR-1269a的相對(duì)表達(dá)量高于癌旁正常組織(t=19.950，P=0.000)；食管癌組織與癌旁正常組織中SOX6 mRNA相對(duì)表達(dá)量分別為0.761±0.082、1.027±0.162，癌組織中SOX6 mRNA相對(duì)表達(dá)量低于癌旁正常組織(t=16.048，P=0.000)。

2.2 食管癌組織中miR-1269a、SOX6表達(dá)與患者臨床病理特征間的關(guān)系 食管癌組織中miR-1269a、SOX6表達(dá)與腫瘤TNM分期、組織分化程度及腫瘤浸潤(rùn)深度有關(guān)(P均<0.05)，與患者年齡、性別及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移無(wú)關(guān)(P均>0.05)。見(jiàn)表1。

2.3 食管癌組織中miR-1269a與SOX6表達(dá)的相關(guān)性 Pearson相關(guān)分析顯示，食管癌組織中miR-1269a與SOX6表達(dá)呈負(fù)相關(guān)(r=-0.716，P=0.000)。

3 討論

食管癌是消化系統(tǒng)常見(jiàn)的惡性腫瘤之一。雖然近年來(lái)其發(fā)病率有所下降，但由于食管癌早期癥狀不明顯，因此部分患者就診時(shí)已進(jìn)入晚期。食物過(guò)燙、經(jīng)常進(jìn)食刺激性食物是罹患食管癌的危險(xiǎn)因素，還可能與環(huán)境因素和家族遺傳史有關(guān)。食管癌的治療方式包括手術(shù)、化療、放療或兩者結(jié)合等方式，但癌癥患者的治愈率低，預(yù)后差，食管癌患者的術(shù)后5年生存率為14%～22%[9]。

表1 食管癌組織中miR-1269a、SOX6表達(dá)與患者臨床病理特征間的關(guān)系

miR-1269a是近年發(fā)現(xiàn)的與腫瘤轉(zhuǎn)移相關(guān)的miRNAs，在多種腫瘤細(xì)胞中均呈高表達(dá)狀態(tài)，如肝癌、胃癌。有文獻(xiàn)報(bào)道，miR-1269a參與癌細(xì)胞的增殖、分化及轉(zhuǎn)移，使得腫瘤惡性程度升高，進(jìn)一步影響其治療效果[5]，如miR-1269a可促進(jìn)結(jié)腸癌及膽管癌細(xì)胞的增殖、分化及侵襲過(guò)程。miR-1269a通過(guò)調(diào)節(jié)靶基因(如MYCBP2、ZNF70、SPATS2L和LRP6)的表達(dá)，進(jìn)而發(fā)揮其生物學(xué)功能[10，11]。因此，我們推測(cè)miR-1269a在食管癌的發(fā)生發(fā)展中亦發(fā)揮一定作用。本研究結(jié)果顯示，食管癌組織中miR-1269a相對(duì)表達(dá)量高于癌旁正常組織。提示miR-1269a可能參與了食管癌的癌變進(jìn)展，其機(jī)制可能為高表達(dá)的miR-1269a上調(diào)靶基因(如MYCBP2)表達(dá)，促進(jìn)細(xì)胞增殖，并且加速了細(xì)胞從G0向G1期的轉(zhuǎn)變過(guò)程，從而加快了癌細(xì)胞的增殖和分化，使得腫瘤細(xì)胞數(shù)量持續(xù)升高。本研究結(jié)果還顯示，miR-1269a表達(dá)與腫瘤TNM分期、組織分化程度及腫瘤浸潤(rùn)深度有關(guān)。研究表明[4]，抑制miR-1269a表達(dá)可抑制細(xì)胞生長(zhǎng)，降低細(xì)胞分化的速度。同時(shí)miR-1269a可上調(diào)Cyclin D1表達(dá)，抑制Rb的磷酸化，抑制腫瘤細(xì)胞的分化功能，使得腫瘤分化程度降低，TNM分期升高，腫瘤惡性程度進(jìn)一步升高[12]。亦有研究發(fā)現(xiàn)，miR-1269a可上調(diào)TGF-β表達(dá)，而TGF-β誘導(dǎo)上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化，或通過(guò)PI3K誘導(dǎo)Akt激活腫瘤細(xì)胞的侵襲和浸潤(rùn)[13]。

SOX6是具有多種功能的轉(zhuǎn)化因子，在腫瘤的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要作用，如SOX6可抑制上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化、抑制腫瘤細(xì)胞的增殖和侵襲等[14]。SOX6在腎透明細(xì)胞癌、膀胱癌及骨肉瘤中均呈低表達(dá)狀態(tài)，并與腫瘤的預(yù)后相關(guān)。有研究表明，SOX6在食管癌中呈低表達(dá)狀態(tài)，其通過(guò)上調(diào)p53和p21同時(shí)下調(diào)Cyclin D1/CDK4、Cyclin A和β-catenin的表達(dá)，從而抑制食管癌的進(jìn)展[15]。而SOX家族的其他成員，如SOX2、SOX4和SOX9，已在多種腫瘤疾病中被認(rèn)定為腫瘤抑制因子[16]。本研究結(jié)果顯示，食管癌組織中SOX6相對(duì)表達(dá)量低于癌旁正常組織，機(jī)制可能為SOX6是miR-1269a的靶基因，miR-1269a表達(dá)上調(diào)時(shí)導(dǎo)致SOX6表達(dá)下降[17]。本研究結(jié)果還顯示，食管癌組織中SOX6的相對(duì)表達(dá)量與腫瘤TNM分期、組織分化程度和腫瘤浸潤(rùn)深度有關(guān)。其原因可能為SOX6通過(guò)抑制胰腺β細(xì)胞中的Cyclin D1或激活紅細(xì)胞中SOCS3的轉(zhuǎn)錄來(lái)抑制腫瘤細(xì)胞的分化，使得腫瘤惡性程度增加，臨床分期升高[18]，并且SOX6發(fā)揮其抑癌基因的作用[19]，抑制腫瘤細(xì)胞的增殖，停滯了腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)周期，因此，當(dāng)食管癌中SOX6表達(dá)下調(diào)時(shí)，會(huì)使腫瘤細(xì)胞的分化程度降低，腫瘤細(xì)胞的浸潤(rùn)深度增加，進(jìn)一步增加了腫瘤的惡性程度。

本研究結(jié)果還顯示，SOX6與miR-1269a表達(dá)呈負(fù)相關(guān)。SOX6是miR-1269a下游的靶基因，miR-1269a是SOX6重要的調(diào)控者[20]，且miR-1269a抑制SOX6的表達(dá)。因此，在食管癌中二者存在相輔相成、相互制約的作用，在疾病的發(fā)生發(fā)展過(guò)程中共同發(fā)揮重要作用。

綜上所述，食管癌組織中miR-1269a表達(dá)上調(diào)，SOX6表達(dá)下調(diào)，與腫瘤TNM分期、組織分化程度及腫瘤浸潤(rùn)深度有關(guān)；二者聯(lián)合檢測(cè)有助于食管癌病情判斷。