馬春華 馬金 王琳 瑪依努爾·尼牙孜

子宮頸癌是一種惡性婦科腫瘤，在全世界范圍內(nèi)每年約有50萬人新確診為子宮頸癌，同時約有30萬人死于子宮頸癌，9%的女性腫瘤患者的死因是子宮頸癌，子宮頸癌已成為對世界婦女健康構(gòu)成威脅的惡性腫瘤[1]。每個國家子宮頸癌發(fā)病率不盡相同，每年新確診病例中80%發(fā)生在發(fā)展中國家[2]。子宮頸癌是非洲、中美洲、南亞和中亞婦女因腫瘤死亡的最主要原因[3]。在中國，子宮頸癌的發(fā)生也不容樂觀，每年新確診宮頸癌病例約為13萬人，占全球?qū)m頸癌新發(fā)病例的28.8%，每年因?qū)m頸癌死亡的人數(shù)約5萬人[4]，子宮頸癌在中國婦女惡性腫瘤中排第一位。宮頸癌是可預防、可早發(fā)現(xiàn)、早期可治愈的腫瘤，因癌前病變持續(xù)時間長，通過篩查可發(fā)現(xiàn)癌前病變和早期浸潤癌，可有效地降低宮頸癌發(fā)病率和因病致死率。本文就P16/Ki-67免疫細胞學雙染能否在宮頸癌篩查中有效篩查和分流患者進行討論。

對象與方法

1.對象：2017年9月到2018年3月在本院門診及住院自愿行宮頸防癌篩查的婦女，HC-2 HPV檢測結(jié)果陽性，同時行宮頸細胞學檢查，后進一步行組織病理檢查明確診斷的婦女59例，年齡21～60歲，平均年齡(44.3±9.5)歲。納入標準包括自愿行宮頸癌篩查并且(1)HC-2 HPV檢測結(jié)果陽性；(2)有宮頸細胞學檢查結(jié)果；(3)有病理檢測結(jié)果。排除標準包括(1)既往有宮頸癌或者宮頸局部不明腫瘤史；(2)目前正在妊娠或者妊娠終止3個月內(nèi)及哺乳期婦女；(3)宮頸發(fā)育異常如雙宮頸、先天性子宮缺如者；(4)具有宮頸局部切除史或放療、化療者；(5)手術(shù)切除子宮者，剩余液基細胞不符合樣本制作過程；(6)樣本結(jié)果不符合判定標準及樣本信息不全的標本。

2.HC-2 HPV DNA基因分型檢測(第二代反向點雜交捕獲技術(shù))：用Digene公司圓錐形采樣刷，采集宮頸脫落細胞放在Digene樣本保存液中儲存。按照Digene公司提供的專用檢測試劑盒說明進行，HPV的結(jié)果以RLU/CO比值≥1.0界定為陽性。

3.宮頸液基薄層細胞學檢查(TCT)：采用超薄液基細胞檢測系統(tǒng)，制成單層細胞涂片。由2名婦科細胞病理學專業(yè)醫(yī)生嚴格執(zhí)行雙閱片，細胞學結(jié)果分為(1)良性反應性細胞改變(NILM)；(2)宮頸未明確診斷意義的非典型鱗狀上皮細胞(ASC包括ASC-US、ASC-H)；(3)低級別宮頸鱗狀上皮內(nèi)病變(LSIL)；(4)高級別宮頸鱗狀上皮內(nèi)病變(HSIL)；(5)宮頸鱗狀細胞癌(SCC)；(6)未明確診斷意義的非典型腺細胞(AGUS)和腺癌(ACC)。

4.陰道鏡檢查及宮頸活檢：按照納入標準為TBS提示ASC以上和(或)高危型HPV陽性者。對入組的研究對象行陰道鏡檢查，包括醋酸實驗和碘實驗。由病理科專業(yè)醫(yī)生閱片判讀，將病理診斷結(jié)果作為診斷實驗的金標準。

5.P16/Ki-67免疫細胞化學雙染檢測(CINTEC PLUS)：CINtec? PLUS細胞學實驗是一種免疫細胞化學測定方法，用于同時定性檢測宮頸細胞學制片中的P16INK4a和Ki-67蛋白。陽性結(jié)果為至少檢測到一個雙染細胞，獨立的細胞或在細胞群中，如果一個或多個宮頸上皮細胞在同一個細胞中同時存在特異性棕色細胞漿免疫染色和特異性紅色細胞核免疫染色，便可視為CINtec PLUS細胞學檢測結(jié)果陽性

6.統(tǒng)計學處理：應用SPSS17.0軟件包對數(shù)據(jù)進行處理及統(tǒng)計學分析。以宮頸標本組織學結(jié)果為金標準，計算診斷實驗靈敏度、特異度、總符合率、陽性預測值、陰性預測值，對定性資料用卡方檢驗，對兩種檢測方法比較用一致性時用Kappa檢驗，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

靈敏度=真陽性人數(shù)/(真陽性人數(shù)+假陰性人數(shù))×100%；特異度=真陰性人數(shù)/(真陰性人數(shù)+假陽性人數(shù)))×100%；總符合率=(真陽性人數(shù)+真陰性人數(shù))/(病例總數(shù))×100%；陽性預測值=真陽性例數(shù)/(真陽性例數(shù)+假陽性例數(shù))×100%；陰性預測值=真陰性例數(shù)/(真陰性例數(shù)+假陰性例數(shù))×100%

結(jié)果

1.P16/Ki-67細胞學雙染的結(jié)果：59例婦女病理組織中，未見病變組織5例(8.5%,5/59)，慢性宮頸炎19例(32.2%,19/59)，CIN Ⅰ10例(16.9%,10/59)、CIN Ⅱ及CIN Ⅲ 共23 例(39.0%,23/59)，宮頸癌2例(3.4%,2/59)。檢測P16/Ki-67細胞雙染結(jié)果P16/Ki-67示34例為陽性，25例為陰性，見表1。

表1 P16/Ki-67細胞學雙染檢測方法結(jié)果情況

2.病理組織學結(jié)果與P16/Ki-67細胞學雙染結(jié)果比較：細胞學雙染陽性中病理組織學診斷為CIN Ⅱ及以上(包括CIN Ⅱ、CIN Ⅲ及宮頸癌)宮頸病變?yōu)?3例，診斷為CIN Ⅰ及炎癥為11例，細胞學雙染在診斷CIN Ⅱ及以上宮頸病變的靈敏度(陽性符合率)為92.0%，特異度(陰性符合率)為67.6%，總體符合率為78.0%，陽性預測值為67.6%，陰性預測值為92.0%。細胞學雙染陽性結(jié)果在診斷CIN Ⅱ及以上宮頸病變與陰性結(jié)果(CIN Ⅰ及炎癥)比較差異有統(tǒng)計學意義，說明細胞學雙染陽性其病理診斷更有可能為CIN Ⅱ及以上宮頸病變，其與病理診斷的一致性較高(Kappa=0.569，P<0.05)。見表2。

表2 病理組織學結(jié)果與細胞學雙染的結(jié)果比較

P16/Ki-67細胞學雙染在宮頸不同組織病理結(jié)果中陽性率不同，其中炎癥為37.5%(9/23)，CIN Ⅰ為20%(2/10)，CIN Ⅱ和CIN Ⅲ為91.3%(21/23)宮頸癌為100%(2/2)。由此可見，P16/Ki-67細胞學雙染陽性率隨宮頸組織病理學診斷分級升級呈上升趨勢。見表3。

表3 不同組織病理分級中細胞學雙染陽性率[例(%)]

討論

子宮頸癌是女性生殖道高發(fā)惡性腫瘤之一，在病變發(fā)生的最初階段通常無特殊癥狀，早期診斷及治療宮頸癌前病變是阻斷宮頸癌發(fā)生發(fā)展的有效手段。目前，常見宮頸癌篩查方案有三種，即(1)宮頸細胞學篩查；(2)HPV檢測；(3)VIA/VIL4、HPV+TCT，宮頸癌的最佳篩查方案就是既能發(fā)現(xiàn)有高危風險的婦女，又能排除不具有風險的正常婦女，既避免漏診又避免誤診，只有當二者平衡后宮頸癌篩查方案才能稱之為最優(yōu)方案。

目前，最常見及應用最廣的篩查技術(shù)就是TCT和HPV檢測技術(shù)。TCT檢查假陰性率高，易導致漏診。子宮頸癌假陽性結(jié)果也常見，細胞學篩查最多的病理診斷就是ASC-US，ASC-US并不是一個確定的診斷，但它又囊括了宮頸各級別組織病理學結(jié)果，ASC-US通常在顯微鏡下觀察結(jié)果為細胞散在、量較少，具有表層或中層鱗狀細胞的大小和形狀，細胞核面積為正常中層鱗狀細胞核的2.5倍，細胞核輕度深染或染色不規(guī)則。ASC-US不是一種單獨的存在形式，而是一個分類，包含與HPV感染相關(guān)的細胞學改變和類似于這些改變但與HPV感染不相關(guān)的細胞學變化。造成細胞學結(jié)果為ASC-US的原因有以下7點[5]，即(1)成熟細胞胞質(zhì)；(2)細胞形態(tài)不典型；(3)形態(tài)不規(guī)則的萎縮細胞；(4)角化不全的宮頸鱗狀細胞；(5)炎性修復細胞；(6)化生細胞；(7)HPV感染的反應細胞以及細胞量少無法確定診斷不能歸為正?；虿徽！Ｔ斐葾SC-US的原因很多，但需要找到與HPV感染有關(guān)的細胞學的改變，才能達到篩查的真正目的。研究發(fā)現(xiàn)，在對細胞學檢查結(jié)果為ASC-US婦女中進行病理組織學檢查，超過50%的為炎癥的檢查結(jié)果并不是宮頸癌前病變或更高級別病變[6]。ASC-US診斷在各細胞病理學專家之間診斷的重復性較低，美國國立癌癥研究所發(fā)起的多中心隨機臨床試驗中，其診斷的重復性僅32.4%[7-9]。ASC-US中究竟有多少是真正患有宮頸病變的婦女，還有多少是可能發(fā)展成為宮頸病變的高危婦女，這就需要尋找一個有效的分流手段，將這些婦女從眾多ASC-US婦女中尋找出來，而且這個分流手段必須是靈敏度和特異度均衡的方法。在這種情況下，可以選擇靈敏度和特異度均不高的重復細胞學檢測，也可以是靈敏度高、特異度低的HPV作為分流檢測。本研究采用P16/Ki-67細胞學雙染檢測對ASC-US及HPV檢測中的陽性結(jié)果進行研究，從而提高宮頸上皮內(nèi)瘤變和宮頸癌的檢出率，減少宮頸癌的發(fā)生風險。

細胞學結(jié)果為ASC-US時，在電子陰道鏡下病理組織檢查結(jié)果從正常組織學改變到宮頸癌前病變及宮頸癌均有分布[10]。研究顯示，ASC-US中可以有20%左右的CIN Ⅰ以及5%左右的的CIN Ⅱ，更有CIN Ⅲ及宮頸癌的發(fā)生[11]。本研究以病理組織學結(jié)果為金標準，驗證細胞學雙染的宮頸癌篩查應用的可行性及檢測結(jié)果的可靠性。共收集符合要求的宮頸液基細胞學為ASC-US及以上剩余標本59例，P16/Ki-67細胞雙染檢測靈敏度(陽性符合率)為92%，特異度(陰性符合率)為67.6%，總體符合率為78.0% 與組織病理學結(jié)果符合率高(Kappa=0.569，P<0.05)，P16/Ki-67細胞學雙染陽性結(jié)果在診斷CIN Ⅱ及以上宮頸高級別病變與陰性結(jié)果比較，差異有統(tǒng)計學意義，說明P16/Ki-67細胞學雙染陽性其病理診斷更有可能為CIN Ⅱ及以上宮頸高級別病變。本研究中P16/Ki-67細胞學雙染陽性率隨宮頸組織病理學診斷升級有上升趨勢。更好的說明P16/Ki-67細胞學雙染陽性能夠診斷高級別宮頸病變，為分流ASC-US提供依據(jù)。

一項入組婦女大于27 000人的多國、多個醫(yī)療中心協(xié)同參與的前瞻性研究[12]中，試驗期間對所有婦女進行傳統(tǒng)的巴氏涂片細胞學檢測、P16/Ki-67雙染(CINtec PLUS)及HC2 HPV檢測，并以活檢確認CIN Ⅱ及以上宮頸病變?yōu)闄z測終點。該研究證實，相比傳統(tǒng)細胞學，CINtec PLUS檢測在不影響特異性的前提下，對CIN Ⅱ及以上宮頸病變的敏感性提高18%(86.7% vs 68.5%)；對于HPV陽性婦女的分流，相比傳統(tǒng)細胞學，CINtec PLUS雙染檢測對CINⅢ的敏感性提高17%(88% vs 71%)。在575例細胞學檢測為ASC-US的患者中，18例患者經(jīng)活檢證實為CIN Ⅰ以上，CINtec PLUS雙染的靈敏度為94%，特異性為78%，與本研究的靈敏度結(jié)果相接近(92%)，但本研究特異度(67.6%)低于文獻報道的78%，這可能與本研究并非在正常人群中進行，而是在本院門診及住院患者HC-2陽性患者中進行有關(guān)。本研究中ASC-US/ASC-H共49例，其中細胞學雙染陽性為25例，陰性為24例，病理組織診斷為CIN Ⅱ和CIN Ⅲ的為18例，CIN Ⅰ及宮頸炎癥為31例，對ASC-US/ASC-H進行P16/Ki-67細胞學雙染分流，P16/Ki-67細胞學雙染陽性能夠更好診斷CINⅡ及以上的宮頸病變，差異具有統(tǒng)計學意義，P16/Ki-67細胞學雙染檢測與病理檢測的一致性較好，P16/Ki-67細胞學雙染檢測的靈敏度為88.9%，特異度為71.0% 總體符合率為77.6%，本組數(shù)據(jù)與PALMS研究中的數(shù)據(jù)結(jié)果相符，說明在TCT 檢查為ASC-US、ASC-H中進行P16/Ki-67細胞學雙染陽性能夠預測其病理結(jié)果。Kisser 等[13]總結(jié)文獻得出的結(jié)論，發(fā)現(xiàn)在ASC-US患者中，同時進行P16/Ki-67細胞學雙染檢測及HR-HPV檢測預測宮頸高級別病變的靈敏度分別為92%、97%，特異度分別為81%、44%；在不降低靈敏度同時，P16/Ki-67細胞學雙染檢測的特異性更高；同時鑒于P16/Ki-67細胞學雙染的陽性診斷結(jié)果的重復性較好。這意味著與HPV檢測相比較，P16/Ki-67細胞學雙染檢測在分流ASC-US中將大大減少轉(zhuǎn)診陰道鏡的人數(shù)，尤其是在年輕人群中其分流診斷的意義更大，P16/Ki-67細胞學雙染有望成為對ASC-US分流的重要輔助手段。

中國宮頸癌發(fā)病情況：經(jīng)濟發(fā)展上，東部優(yōu)于西部，南部優(yōu)于北部，宮頸癌在經(jīng)濟發(fā)展較為落后地區(qū)高發(fā)。地理位置上，山區(qū)高于平原，醫(yī)療水平不同表現(xiàn)出不同地區(qū)不同特點，每年新發(fā)病例及病死率各地區(qū)也不同。當按照宮頸癌篩查新指南無法切實可行時，需要探討適合中國不同地區(qū)的篩查策略。目前，篩查已從群體篩查管理走向精準分層篩查和個體化處理。新疆作為宮頸癌高發(fā)區(qū)，患病率和死亡率均較高，HPV感染率不高[14]。因此，對HPV檢測為高危型別HPV感染者進行P16/Ki-67細胞學雙染可以明確是否有高級別宮頸病變存在，可有效減少陰道鏡檢測帶來的創(chuàng)傷，避免了嚴密隨訪中患者焦慮情緒，同時也可對同一份樣本進行重復檢測，減少重復取樣給患者帶來的經(jīng)濟負擔。因此，P16/Ki-67細胞學雙染在HPV檢測后患者的分流管理中是一種有效的方案。

本研究是對P16/Ki-67進行免疫細胞化學染色，采用宮頸脫落細胞，取樣無創(chuàng)傷，同一份樣本可行TCT、HPV及CINtec PLUS檢測，降低耗材成本，減少患者經(jīng)濟費用；經(jīng)過TCT制片系統(tǒng)制片后可以直接固定用于免疫細胞化學檢測，與組織病理學標本相比少了固定、脫水、浸蠟、包埋等步驟，染色時省去組織病理標本的脫蠟和水化過程，其原理同免疫組織化學一樣，應用的是抗原抗體相結(jié)合，結(jié)果更直觀、客觀可靠。希望在將來能夠進行系統(tǒng)分析，通過長期前瞻性研究，探討適用于臨床的宮頸癌篩查、癌前病變分流方案。