許 女 魏莎莎 楊 光 陳旭峰 張 浩 王如福*

（1 山西農(nóng)業(yè)大學(xué) 食品科學(xué)與工程學(xué)院 山西太谷030801 2 山西農(nóng)業(yè)大學(xué) 實驗教學(xué)中心 山西太谷030801）

腸道是營養(yǎng)物質(zhì)消化吸收的主要場所， 同時腸道內(nèi)棲生著數(shù)量大、種類多的菌群，這些菌群在腸道特有的環(huán)境條件下發(fā)揮著調(diào)控宿主營養(yǎng)代謝和促進黏膜免疫系統(tǒng)成熟的雙重作用。 正常機體中的腸道菌群與人體及外界環(huán)境間保持著相對平衡的狀態(tài)，一旦有外來刺激，如食物過冷過熱、藥物、 外來菌等打破這種平衡， 由腸道菌群失調(diào)引發(fā)、 加重或者與腸道菌群失調(diào)有關(guān)的疾病便會產(chǎn)生[1]。 目前，已經(jīng)證明腸道菌群在人體的新陳代謝及免疫功能等方面具有舉足輕重的作用， 影響宿主的物質(zhì)能量代謝及與之相關(guān)疾病（例如肥胖、糖尿病脂肪肝等）的發(fā)生和發(fā)展過程[2]。

乳酸菌能在腸道內(nèi)定植，維護腸道菌群平衡，并刺激腸黏膜免疫組織， 是對腸道黏膜免疫有重要影響的有益微生物。 鼠李糖乳桿菌LGGs，最初是在上世紀80年代， 由兩位美國科學(xué)家Gorbach和Goldin 從健康人的腸道中分離而得， 近年來，大量的動物實驗和人體臨床實驗證明LGG 能夠耐受動物消化道環(huán)境， 并能夠在人和動物腸道內(nèi)定植，起到調(diào)節(jié)腸道菌群、預(yù)防和治療腹瀉、排除毒素、提高機體免疫力和預(yù)防齲齒等作用，是重要的益生菌[3]。

本文主要研究了鼠李糖乳桿菌（Lactobacillus rhamnosus）DHC32 對正常小鼠腸道菌群和腸道黏膜免疫的影響，為精確闡明乳酸菌、腸道菌群和宿主黏膜免疫間相互作用及機制積累基礎(chǔ)研究。

1 材料與方法

1.1 主要材料與試劑

鼠李糖乳桿菌DHC 32， 山西農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院生物工程實驗室保存；LBS 培養(yǎng)基、BBL 培養(yǎng)基、GAM 培養(yǎng)基、 伊紅美藍培養(yǎng)基，均購自青島海博生物技術(shù)有限公司；LgG 和SIgA測定試劑盒， 購自南京建成生物工程研究所；總RNA 提取試劑盒，購自天根生化科技（北京）有限公司；TaKaRa RR036A 反轉(zhuǎn)錄試劑盒、TaKaRa SYBR Premix Ex TaqTM II，購自寶生物工程（大連）有限公司。

1.2 主要儀器與設(shè)備

CFX96 熒光定量PCR 儀，美國BioRad 公司；Thermo 酶標儀，芬蘭Thermo Electron 公司；電泳成套設(shè)備，美國Bio-rad 公司；凝膠成像系統(tǒng)，美國Alpha Innotech 公司；臺式高速冷凍離心機，美國Sigam 公司；UItimate 3000 液相色譜儀，德國賽默飛公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 受試菌液的制備 將試驗菌株鼠李糖乳桿菌 DHC 按3%的接種量接于MRS 液體培養(yǎng)基中，37 ℃靜置培養(yǎng)24 h，8 000 r/min，離心10 min，棄掉上清液， 加入無菌生理鹽水將菌體細胞洗滌2 次，之后調(diào)OD 值，使菌液濃度為108CFU/mL 和1010CFU/mL。

1.3.2 動物實驗 本試驗采用鼠李糖乳桿菌DHC 32 干預(yù)健康小鼠， 選用BALB/c 小鼠（SPF級）30 只，隨機分成3 組，每組10 只。 每組小鼠均連續(xù)灌胃30 d。30 d 后采用頸部脫臼法處死小鼠。

1.3.3 糞便菌群、pH、水分和有機酸測定

1.3.3.1 糞便菌群的測定 無菌收集新鮮糞便測定其活菌數(shù)。 乳桿菌采用LBS 培養(yǎng)基，37 ℃好氧，48 h； 雙歧桿菌采用BBL 瓊脂培養(yǎng)基，37 ℃厭氧，48 h； 擬桿菌采用GAM 培養(yǎng)基，37 ℃厭氧，48 h；腸桿菌采用伊紅美藍瓊脂，37 ℃好氧培養(yǎng)48 h 后計數(shù)。

1.3.3.2 糞便pH 和水分含量測定 收集大鼠新鮮糞便，測定其pH 和水分含量。 糞便pH 值的測定方法： 取2 g 新鮮糞便溶于20 mL 水中， 用pH計測定其pH 值。 糞便含水量的測定方法：將新鮮糞便置于80 ℃的烘箱中，烘干至恒重。

糞便含水量=（烘干前的糞便總質(zhì)量－烘干后的糞便總質(zhì)量）/烘干前的糞便總質(zhì)量×100%

1.3.3.3 糞便有機酸含量的測定 收集大鼠新鮮糞便，測定其有機酸含量。取0.5 g 新鮮糞便，加入1 mL 蒸餾水混勻用去離子水浸泡3 h→抽濾→12 000 r/min 離心10 min→取上清液于0.22 μm微孔濾膜濾樣→進樣檢測。

色譜條件：液相色譜儀UItimate 3000；色譜柱選擇Agilent ZORBAX-C18 4.6 mm×150 mm，5 μm； 流動相為pH=2.7 的20 mmol/L NaH2PO4；進樣量20 μL；流動速度0.8 mL/min；紫外檢測波長210 nm；柱溫30 ℃。

1.3.4 糞便菌群營養(yǎng)代謝率及相關(guān)酶活的測定在MRS 培養(yǎng)基（pH 6.2）中加入1%糞便菌懸液和5%的淀粉，混勻后置于37 ℃厭氧培養(yǎng)24 h，按照文獻[4]中報道的方法測定糞便菌群代謝淀粉、油脂及蛋白質(zhì)的能力。

將5 mL 糞便菌懸液超聲破碎10 min，隨后在10 000 r/min 條件下離心10 min，以去除樣品中的不可溶性成分，收集上清液（粗酶液）按照文獻[4]中報道的方法進行酶活測定。

1.3.5 小鼠血清LgG 和腸黏膜SIgA 的測定 采用ELSIA 試劑盒對小鼠血清IGG 和腸黏膜SIgA進行測定。

1.3.6 小鼠腸道中細胞因子、 抑菌蛋白及黏蛋白的mRNA 表達 取出腸道組織， 進行Q-PCR 方法分析腸道中細胞因子TNF-α、MyD88、IL-22、IL-23、IL-17A 及腸道內(nèi)抑菌蛋白Reg IIIγ、黏蛋白MUC1、MUC2 mRNA 水平的變化，引物序列見表1。

表1 實時定量PCR 引物Table 1 Primers used for quantitative real-time PCR

2 結(jié)果與討論

2.1 鼠李糖乳桿菌DHC32 對小鼠糞便氨、 水分含量和pH 值的影響

由圖1 可知，與對照組相比，灌胃鼠李糖乳桿菌DHC32 的小鼠糞便中氨含量和pH 值顯著降低，水分含量顯著升高，且與劑量呈正相關(guān)。 鼠李糖乳桿菌DHC32 進入腸道后，定植繁殖，產(chǎn)生短鏈脂肪酸等酸性物質(zhì)，降低腸道內(nèi)的pH 值，可以抑制有害菌的生長，降低糞便中的氨含量。有些腐生菌在結(jié)腸中pH 較高的環(huán)境下代謝很活躍，可能產(chǎn)生一些致癌物質(zhì)， 而降低結(jié)腸pH 值就有利于抑制這些腐生菌的生長增殖， 能預(yù)防、 治療腸炎、結(jié)腸癌等腸道疾病[5]。糞便中水分含量升高，證明了鼠李糖乳桿菌DHC32 的通便作用。

圖1 鼠李糖乳桿菌DHC32 對小鼠糞便氨、水分含量和pH 值的影響Fig.1 Effect of Lactobacillus rhamnosus DHC32 on ammonia， moisture and pH value in feces of mice

2.2 鼠李糖乳桿菌DHC32 對小鼠糞便菌群和短鏈脂肪酸的影響

大量研究表明，益生菌可以調(diào)節(jié)腸道菌群，穩(wěn)定腸道微生態(tài)，通過粘附、競爭排斥、占位和產(chǎn)生抑制物等作用使一些致病菌（埃希氏菌、空腸彎曲桿菌、腸球菌等）難于接近腸黏膜上的附著位點，隨糞便被宿主清除于體外， 從而在腸道中保持著菌群優(yōu)勢，并對腸道局部免疫產(chǎn)生重要的影響[6]。

圖2 鼠李糖乳桿菌DHC32 對小鼠糞便菌群數(shù)量的影響Fig.2 Effect of Lactobacillus rhamnosus DHC32 on microbial population in feces of mice

由圖2 可知，鼠李糖乳桿菌DHC32 對改善小鼠腸道菌群有顯著性效果。 與對照組相比， 灌胃DHC32 的小鼠糞便中乳桿菌和雙歧桿菌的數(shù)量顯著升高，擬桿菌和腸桿菌的數(shù)量顯著降低，且與劑量呈正相關(guān)性。 鼠李糖乳桿菌DHC32 進入腸道后，一方面能夠快速在腸道內(nèi)定植，使有益菌增加，有害菌減少；另一方面可能是通過增強機體部分免疫細胞的功能從而促進了雙歧桿菌等有益菌的生長。

由圖3 可知， 灌胃低劑量和高劑量鼠李糖乳桿菌DHC32 均能顯著提高小鼠糞便中乙酸、丙酸、丁酸的含量。短鏈脂肪酸是由小腸內(nèi)不被消化吸收的復(fù)雜碳水化合物進入大腸后由厭氧微生物發(fā)酵而產(chǎn)生的，其中乙酸、丙酸和丁酸所占比例高達85%。 腸道中乳酸菌和雙歧桿菌等有益菌的增加，增加腸道內(nèi)短鏈脂肪酸的含量，降低結(jié)腸及糞便的pH。短鏈脂肪酸SCFAs 具有調(diào)節(jié)腸道免疫功能以及降低腸道通透性等重要的生理功能， 并且是腸道上皮細胞以及肝臟能量的重要來源之一[7]。乳酸的產(chǎn)生能促進腸道蠕動， 減少營養(yǎng)物質(zhì)在小腸內(nèi)留存的時間，提高營養(yǎng)物質(zhì)的轉(zhuǎn)運速度。丁酸對很多突變物質(zhì)具有抑制活性， 是腸道中強的抗癌物質(zhì)。丁酸是結(jié)腸細胞首選的能源物質(zhì)，并與細胞凋亡和細胞分化的調(diào)控有關(guān)[8]。

圖3 鼠李糖乳桿菌DHC32 對小鼠糞便短鏈脂肪酸的影響Fig.3 Effect of Lactobacillus rhamnosus DHC32 on short chain fatty acid content in feces of mice

2.3 鼠李糖乳桿菌DHC32 對小鼠糞便菌群營養(yǎng)代謝的影響

研究發(fā)現(xiàn)腸道菌群主要通過參與宿主體內(nèi)糖、蛋白質(zhì)和脂肪等營養(yǎng)大分子物質(zhì)的代謝，影響宿主對于營養(yǎng)物質(zhì)的消化、代謝和吸收，進而調(diào)控宿主的營養(yǎng)水平、 健康狀況、 免疫和腸腦神經(jīng)系統(tǒng)。 小鼠糞便菌懸液中的菌群在營養(yǎng)肉湯中的營養(yǎng)代謝能力結(jié)果如圖4 所示，結(jié)果表明，與對照組相比，灌胃鼠李糖乳桿菌DHC32 的小鼠糞便菌群的代謝淀粉、油脂及蛋白質(zhì)的能力顯著提升，但是高、低劑量組之間無顯著差異。 腸道菌群最重要的代謝功能就是通過糖酵解途徑、 磷酸戊糖途徑和糖類厭氧分解途徑等進行糖類的代謝。 腸道組織是食物來源氨基酸的主要場所， 這些氨基酸的代謝產(chǎn)物如谷胱甘肽和多胺等生物活性物質(zhì)， 對維持腸黏膜完整性和腸道功能都具有重要意義[9]。腸道微生物可通過直接作用于腸道中的脂質(zhì)， 或者間接改變膽固醇或其衍生物如膽鹽等過程， 影響脂類的代謝[10]。

圖4 鼠李糖乳桿菌DHC 32 對小鼠糞便菌群營養(yǎng)代謝率的影響Fig.4 Effect of Lactobacillus rhamnosus DHC32 on fecal bacterial metabolic capacity of mice

腸道微生物可以通過調(diào)節(jié)酶的活性和酶量來影響消化道中營養(yǎng)物質(zhì)的消化、吸收與代謝。為進一步分析鼠李糖乳桿菌DHC32 對小鼠腸道菌群代謝功能的影響， 本文針對腸道菌群中物質(zhì)代謝相關(guān)酶的活性進行了分析，結(jié)果如圖5 所示。與對照組相比，灌胃鼠李糖乳桿菌DHC32 的小鼠糞便菌群中α-葡萄糖苷酶、酯酶和氨肽酶的活性顯著提高，但乳酸脫氫酶的活性變化不明顯。以上結(jié)果表明鼠李糖乳桿菌DHC32 通過改變腸道菌整體的代謝酶活性，從而改變機體對食物的消化能力，促進腸道細胞對營養(yǎng)物質(zhì)的吸收。

圖5 鼠李糖乳桿菌DHC 32 對小鼠糞便菌群代謝相關(guān)酶活性的影響Fig.5 Effect of Lactobacillus rhamnosus DHC32 on activities of metabolism-related enzymes of fecal bacterial in mice

2.4 鼠李糖乳桿菌DHC32 對小鼠血清LgG 和腸黏膜SIgA 的影響

IgG 在血清抗體總量中所占的比例達到75%以上，是血清中主要的抗體，在體液免疫中發(fā)揮著主要免疫作用。 腸道黏膜免疫系統(tǒng)的一個重要的功能是分泌SIgA 抗體。SIgA 可以阻止具有潛在威脅的抗原蛋白入侵機體， 同時阻斷致病菌對腸道黏膜的進一步傷害。許多研究都證明，益生菌株可以有效地提高SIgA 的分泌量，并且調(diào)節(jié)由炎癥細胞所產(chǎn)生的細胞因子的含量， 進而有效地抑制炎癥的發(fā)生，同時也降低了機體自發(fā)性免疫過剩，即過敏反應(yīng)的發(fā)生[11]。此外，SIgA 還能預(yù)防致病菌和非致病菌向腸道外移位， 從而維持腸道內(nèi)的正常菌群的生長。

如圖6 所示，鼠李糖乳桿菌DHC32 可以顯著提高小鼠血清LgG 和腸黏膜SIgA 的含量。說明益生乳酸菌鼠李糖乳桿菌DHC32 對宿主的體液免疫和腸黏膜局部免疫具有調(diào)節(jié)功能。 張和平等[12]研究了L.casei Zhang 對小鼠血清及腸黏膜的影響， 結(jié)果表明益生乳酸菌可以顯著增加小鼠血清LgG 質(zhì)量濃度和小鼠腸黏膜SIgA 質(zhì)量濃度，任貴強等[13]對益生菌MG2-1 調(diào)節(jié)小鼠機體免疫的研究也得出相似結(jié)論。

圖6 鼠李糖乳桿菌DHC 32 對小鼠血清LgG 和腸黏膜SIgA 的影響Fig.6 Effect of Lactobacillus rhamnosus DHC32 on serum LgG and intestinal SIgA of mice

2.5 鼠李糖乳桿菌DHC32 對小鼠腸道細胞因子和抗菌蛋白、粘附蛋白基因表達的影響

與對照組相比， 灌胃鼠李糖乳桿菌DHC 32小鼠腸道中My D88、IL-23 及IL-22 的量顯著增多。有研究證實，天然免疫中起重要作用的髓樣分化因子My D88 以及細胞因子IL-23 及IL-22，有研究表明，IL-23/IL-22 適度表達對維持腸道免疫功能及損傷修復(fù)起著重要作用， 但過度表達則能夠破壞腸道免疫功能繼而加劇腸道炎癥反應(yīng)[14]。圖7 結(jié)果顯示，干預(yù)組小鼠腸道中的促炎因子IL-17A 及TNF-α 表達水平與對照組無顯著差異，說明適量的乳酸菌的定植并未誘導(dǎo)機體產(chǎn)生炎癥反應(yīng)。但是有報道稱乳酸菌的某些菌株：鼠李糖乳桿菌（ATCC. 53103）、植物乳桿菌（VTT）、乳酸球菌（ARH74）， 雙歧桿菌動物亞種是腫瘤壞死因子（TNF-α）的強有力的誘導(dǎo)劑，以增強免疫。 本文推理在正常腸道環(huán)境下鼠李糖乳桿菌 DHC 32 可能通過適當刺激腸道上皮先天免疫反應(yīng)增強機體免疫機能， 而非直接抑制炎癥產(chǎn)生以維護腸道健康。

圖7 鼠李糖乳桿菌DHC 32 對小鼠腸道免疫相關(guān)細胞因子表達的影響Fig.7 Effect of Lactobacillus rhamnosus DHC32 on gene expression of intestinal immunoregulatory cytokines of mice

腸道上皮是機體內(nèi)最大的黏膜屏障， 其產(chǎn)生的抑菌因子胰島再生源蛋白Reg IIIγ 是腸道先天黏膜免疫中重要成分[15]。 圖8 結(jié)果顯示，鼠李糖乳桿菌DHC 32 定植腸道后， 顯著促進了Reg IIIγ的表達。 Reg IIIγ 為一種可以直接殺菌的C 型凝集素，研究發(fā)現(xiàn)[16]My D88 及IL-23/IL-22 等因子的產(chǎn)生對Reg IIIγ 的表達起促進作用。 健康腸道內(nèi)Reg IIIγ 具有較強的殺菌能力， 在防止共生菌和致病菌穿透腸道屏障及炎癥性腸?。↖nflammatory Bowel Disease，IBD）發(fā)病機制中發(fā)揮重要作用。 鼠李糖乳桿菌DHC 32 可通過與腸道上皮相互作用調(diào)控抑菌蛋白Reg IIIγ 的表達， 進而穩(wěn)定腸道內(nèi)環(huán)境及加強免疫防御，從而促進腸道健康，但是具體分子機制尚不清楚。

圖8 鼠李糖乳桿菌DHC 32 對小鼠腸道MUC1、MUC2 及RegIIIγ 表達的影響Fig.8 Effect of Lactobacillus rhamnosus DHC32 on gene expression of intestinal MUC1，MUC2 and RegIIIγ of mice

益生乳酸菌除了通過產(chǎn)生一些代謝產(chǎn)物、競爭性占位等機制抑制腸道中多種病原菌的增殖降低腸道感染率外，還通過粘附定植到腸道，增加其與腸上皮細胞間的相互作用， 促進杯狀細胞分泌黏蛋白，加速黏蛋白周轉(zhuǎn)率，穩(wěn)固黏膜屏障功能，增強宿主的免疫機能而改善動物的腸道健康。 黏蛋白是黏液層的主要組分， 其中MUC1 和MUC2是腸道組織中兩種最主要的黏蛋白。 MUC1 是膜結(jié)合型，主要參與腸道先天性免疫，通過與致病菌表面成分特異性結(jié)合有效阻止其入侵機體；MUC2是分泌型黏蛋白， 通過參與形成黏稠的凝膠型網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)進而形成物理性屏障，抵御致病菌入侵[17]。本文研究了鼠李糖乳桿菌DHC 32 對小鼠腸道MUC1、MUC2 基因表達的影響，結(jié)果顯示，鼠李糖乳桿菌DHC 32 干預(yù)組小鼠腸道中MUC1、MUC2基因表達量顯著提高，且與劑量呈正相關(guān)性。研究認為， 細菌表面的脂多糖及代謝產(chǎn)物能夠改變黏蛋白的合成和分泌[18]。 乳酸菌對其影響主要分兩個方面：1）通過改變腸道部分微生物數(shù)量影響?zhàn)さ鞍妆磉_[19]；2）通過粘附素粘附于腸黏蛋白，直接提高黏蛋白mRNA 表達水平[20]。Smirnov A 等[18]和Cui H 等[21]研究發(fā)現(xiàn)，乳酸菌制劑能夠顯著提高肉仔雞空腸黏蛋白mRNA 表達水平及黏蛋白數(shù)量，證實其能夠改變黏蛋白分泌動力學(xué)特性。 Li 等[22]分離出高粘附雞源發(fā)酵乳桿菌， 且在體內(nèi)試驗發(fā)現(xiàn)該菌株能夠顯著增加空腸杯狀細胞密度和空腸、回腸MUC2 的mRNA 水平。