田野，栗鋆，原一桐，杜若琛，李宵，王菲，王雅麗，邵宏元，王春芳*

(1. 山西醫(yī)科大學(xué)，太原 030001； 2. 山西省人民醫(yī)院，太原 030001)

抑郁癥是一種由多因素引起的情緒障礙，其病情復(fù)雜，以持續(xù)性悲傷、低自尊、社交退縮、興趣減低和低落心境等癥狀為特點，持續(xù)數(shù)周或以上。 壓力被認為是造成重癥抑郁的主要原因之一[1]。 大量研究表明，兒童時期經(jīng)歷與抑郁癥有著密切聯(lián)系[2]。 目前的治療主要基于單胺能系統(tǒng)調(diào)節(jié)，然而，仍約30%的抑郁癥患者對此治療有部分或完全抗性[3]。

然而，抑郁癥的分子調(diào)節(jié)機制至今仍不清楚，導(dǎo)致抑郁癥的臨床治療受到限制。 在抑郁癥的基礎(chǔ)研究中，抑郁模式小鼠是研究的基石，但是目前而言沒有一種能長期穩(wěn)定表達抑郁癥狀的小鼠[4]。 目前為止已經(jīng)有很多抑郁癥小鼠構(gòu)建模型，例如藥物誘導(dǎo)抑郁模型、慢性束縛模型、習(xí)得無助模型(learned helplessness model，LH)、慢性不可預(yù)知溫和刺激模型(chronic unpredictable wild stress，CUMS)、早期應(yīng)激模型(early life stress model，ELS)、社會挫敗模型(social defeat model)等[5-6]。 為了不影響藥物效果，物理刺激導(dǎo)致的抑郁模型是經(jīng)常使用的，其中CUMS是最常見的抑郁小鼠模型。 CUMS 小鼠是通過長時間向動物隨機施加溫和的無法預(yù)知的刺激，如限制活動、禁食禁水、冷水游泳、晝夜顛倒等刺激，可導(dǎo)致嚙齒動物產(chǎn)生抑郁行為[7-8]。 ELS 小鼠模擬一種早期生活壓力的動物模型，可以調(diào)節(jié)下丘腦-垂體-腎上腺軸(HPA 軸)，并影響成年期后續(xù)的腦功能和行為[9-10]。 然而，這兩種抑郁小鼠模型無法使小鼠長期穩(wěn)定表達抑郁癥狀[11]。

本文將綜合CUMS 小鼠與ELS 小鼠的構(gòu)建方法，從小鼠新出生開始給予與母體分離，并在其斷乳后給予噪聲、強光等一系列刺激來構(gòu)建長時程抑郁模型(long-term depression model，LTD)，為抑郁癥的基礎(chǔ)研究提供新型的模式小鼠。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物

2 月齡清潔級C57BL/6 小鼠45 只，雌雄比1 ∶1，體重21 ～27 g；清潔級C57BL/6 孕鼠15 只，13 ～14 d 孕齡，體重25 ～33 g；清潔級eGFP 轉(zhuǎn)基因小鼠1 只，2 月齡；清潔級eGFP 轉(zhuǎn)基因孕鼠1 只，13 ～14 d孕齡，體重25 ～33 g。 購于山西醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心【SCXK(晉)2015-0001】，飼養(yǎng)于山西醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心屏障環(huán)境中【SYXK(晉)2009-0004】。 實驗小鼠的飼養(yǎng)過程和其他實驗操作均符合實驗動物倫理學(xué)要求(審批號：IACUC2017-002)以及中華人民共和國《實驗動物管理條例》。

1.1.2 主要儀器和主要試劑

熒光顯微(OLYMPUS，日本)，石蠟切片機(Leica RM 2245，德國)，強迫游泳柱(自制)，懸尾盒(自制)，曠場反應(yīng)箱(自制)，高架十字迷宮(自制)，新物體識別(自制)。

1.2 方法

1.2.1 實驗?zāi)Ｐ椭苽?/p>

(1)長時程抑郁模型的制作

將剛出生的新生鼠與母鼠分離，每天分離兩次，每次持續(xù)2 h，持續(xù)14 d。 并在小鼠3 周齡后開始單籠飼養(yǎng)，并給予(1)噪音15 min，(2)傾斜鼠籠12 h，(3)連續(xù)光照或黑暗24 h，(4)夾尾1 min，(5)潮濕環(huán)境1 h，(6)搖晃鼠籠5 min，(7)限制活動30 min，(8)頻閃燈照射15 min，(9)束縛2 h，(10)空水瓶暴露1 h，每天給予1 種應(yīng)激，連續(xù)兩天不給予相同刺激，持續(xù)21 d。

(2)慢性溫和不可預(yù)知應(yīng)激模型的制作

將2 ～3 周齡小鼠單籠飼養(yǎng)，給予和早期長時程抑郁模型相同刺激，每天給予兩種應(yīng)激，連續(xù)兩天不給予相同刺激，持續(xù)21 d[12]。

(3)早期應(yīng)激模型的制作

將剛出生的新生鼠與母鼠分離，每天分離兩次，每次持續(xù)2 h，持續(xù)14 d。 待小鼠6 周齡時開始實驗[13]。

1.2.2 行為學(xué)實驗

(1)糖水偏好實驗

實驗分為適應(yīng)階段和實驗階段。 適應(yīng)階段：實驗前1 天將每籠小鼠配備兩瓶含有1%蔗糖水的水瓶，自由飲食飼養(yǎng)12 h，隨后將一瓶1%的蔗糖水替換成清水，繼續(xù)自由飲食12 h。 實驗階段：每籠小鼠隨機放置一瓶1%蔗糖水和一瓶清水，放置之前統(tǒng)計各自重量，清水和蔗糖水位置每8 h 更換1 次，自實驗開始24 h 后統(tǒng)計兩瓶水重量，糖水偏好率以蔗糖水溶液的消耗量(g)/總液體的消耗量(g) ×100%表示。

(2)強迫游泳實驗

將小鼠放入一個透明圓柱體中(高25 cm，直徑14 cm)，圓柱體中注入17 ～19 cm 高的溫水，使其自由游泳6 min。 統(tǒng)計小鼠在6 min 內(nèi)后4 min 保持漂浮狀態(tài)的累計時間。 每只小鼠試驗后需換水。

(3)懸尾實驗

將小鼠尾部1 cm 通過小夾子固定在一個高55 cm，寬60 cm 的長方體盒內(nèi)，讓其上下左右都難以接觸盒壁，并使其頭部朝下時離底部有20 ～25 cm，記錄其6 min 內(nèi)后4 min 累計不動的時間。

(4)曠場實驗

將小鼠放置于一個曠場反應(yīng)箱內(nèi)(長40 cm，寬40 cm，高40 cm)，將反應(yīng)箱底部分為16 小格，外周12 格聯(lián)合定義為周邊區(qū)，中間4 格聯(lián)合定義為中心區(qū)；記錄6 min 內(nèi)小鼠處于中心區(qū)累積時間。

(5)高架十字迷宮實驗

將小鼠放置于由兩條開放臂(長30 cm，寬6 cm)和兩條閉合臂(長30 cm，寬6 cm，高15 cm)組成，距離地面40 cm 的高架十字迷宮中央，并使小鼠頭部面向開放臂；記錄6 min 內(nèi)小鼠累積進入開放臂的時間。

(6)新物體識別實驗

實驗分為適應(yīng)階段和實驗階段。 適應(yīng)階段：實驗前1 天將小鼠放置在一個正方形反應(yīng)箱內(nèi)(長25 cm，寬25 cm)，持續(xù)10 min。 使小鼠充分熟悉環(huán)境；實驗階段：在反應(yīng)箱內(nèi)部場地軸對稱位置放置兩個相同的物體，將小鼠背朝物體放入，讓小鼠自由探索10 min；1 h 后，保持物體位置不變，用新物體更換其中一個舊物體，再次將小鼠背朝物體放入，讓小鼠自由探索10 min；小鼠鼻子距離物體1 cm 內(nèi)指向物體或鼻子觸及物體可視為探索行為。 記錄小鼠探索新物體以及舊物體次數(shù)，新物體識別概率視為新物體探索次數(shù)/總探索次數(shù)× 100%表示。

1.2.3 切片制備

麻醉小鼠后用生理鹽水和4%的多聚甲醛灌注小鼠，取出其腦組織，沖洗、脫水、浸蠟、石蠟包埋，以5 μm 的厚度切片，置于熒光顯微鏡下觀察海馬各區(qū)域神經(jīng)元。

1.3 統(tǒng)計學(xué)分析

所得數(shù)據(jù)均用SPSS 21.0 統(tǒng)計軟件處理，檢測結(jié)果采用平均值±標(biāo)準差(±s)表示，自殘概率比較采用卡方檢驗，不同時間行為學(xué)檢測采用重復(fù)測量方差分析，P＜0.05 表示差異具有顯著性，P＜0.01 表示差異極有顯著性。

2 結(jié)果

2.1 不同建模方式影響小鼠自殘概率

在構(gòu)建3 種不同抑郁小鼠模型過程中，部分小鼠會出現(xiàn)吞噬自己后肢、后肢腳趾或尾部的現(xiàn)象，LTD 小鼠自殘概率明顯升高(表1)，而CUMS 小鼠未出現(xiàn)自殘情況。

表1 各組小鼠自殘比例Table 1 Proportion of self-harm in mice of each group

2.2 長時程抑郁模型長時間影響小鼠抑郁樣行為

將三種抑郁小鼠分別造模結(jié)束后的1 d、10 d與20 d 進行了抑郁樣行為的測定(圖1A-C)。 與對照組相比，造模結(jié)束后1 d 3 組抑郁模型動物糖水偏好指數(shù)顯著性降低(P＜0.05)，10 d 時LTD 小鼠與CUMS 小鼠糖水偏好指數(shù)顯著性降低(P＜0.05)，20 d 后與對照組相比僅LTD 小鼠有顯著差異(P＜0.05)(圖1A)。 在強迫游泳實驗中，造模結(jié)束后1dLTD 小鼠與CUMS 小鼠與對照組相比靜止時間有極顯著差異(P＜0.01)，10 d 時LTD 小鼠與CUMS小鼠顯著性升高(P＜0.05)，20 d 時LTD 小鼠對比對照組仍顯著性升高(P＜0.05)(圖1B)。 在懸尾實驗中，僅10 d 與20 d 早期長時程抑郁組與對照組相比有顯著性差異(P＜0.05)(圖1C)。

2.3 長時程抑郁模型不會影響小鼠學(xué)習(xí)記憶能力與焦慮行為

為了探究新的造模方式是否會影響小鼠的焦慮行為和學(xué)習(xí)記憶能力，將LTD 小鼠與對照組的曠場試驗、高架十字迷宮試驗和新物體識別試驗進行對比(圖2A-C)，結(jié)果均無顯著性差異。

2.4 長時程抑郁模型影響小鼠海馬神經(jīng)元存活

為了探究早期長時程抑郁模型是否會影響小鼠海馬神經(jīng)元，構(gòu)建了一批eGFP 轉(zhuǎn)基因長時程抑郁模型小鼠，待其造模結(jié)束1 d、10 d 觀察其各區(qū)海馬神經(jīng)元(圖3)。 結(jié)果顯示LTD 小鼠CA1 區(qū)、CA3區(qū)海馬神經(jīng)元結(jié)構(gòu)明顯變薄，呈退行性改變。 而DG 區(qū)影響不明顯。

3 討論

圖1 不同抑郁小鼠抑郁樣行為持續(xù)時間(±s，n =8)Note.*P＜0.05，**P＜0.01，vs the control group in the same day.Figure 1 Duration of depression-like behavior in different depressed mice(±s，n =8)

圖2 LTD 對小鼠焦慮行為和學(xué)習(xí)記憶的影響Figure 2 Effect of LTD on anxiety behavior and learning and memory of mice

圖3 LTD 對eGFP 轉(zhuǎn)基因小鼠海馬CA1 區(qū)、CA3 區(qū)和DG 區(qū)神經(jīng)元的影響(× 200)Figure 3 Effect of LTD on neurons in hippocampal CA1，CA3 and DG regions of eGFP transgenic mice (× 200)

抑郁癥是現(xiàn)當(dāng)代最常見得精神障礙之一，擁有患病率高、復(fù)發(fā)率高、潛伏期長、自殺率高等特點。如何有效的防治抑郁癥是現(xiàn)當(dāng)代神經(jīng)精神醫(yī)學(xué)重要的研究方向之一。 隨著對抑郁癥的研究越來越深入，沒有可以長時間表現(xiàn)抑郁行為的模型的劣勢開始逐漸顯現(xiàn)。 為了模擬長期抑郁癥患者的臨床治療，人們只能選用Wistar Kyoto(WKY)大鼠等轉(zhuǎn)基因鼠作為模式動物，但其對藥物的耐受性限制了其廣泛應(yīng)用[14]。

壓力性生活事件以及生命早期的不良事件是抑郁癥的高危因素[15]。 長期暴露于壓力下會導(dǎo)致目標(biāo)導(dǎo)向的行為減少，并可能成比例地增加患抑郁癥的風(fēng)險[16]。 以此為理論基礎(chǔ)，CUMS 小鼠是經(jīng)典的抑郁模型之一，其病因和發(fā)病機制接近于人類抑郁癥，并已經(jīng)被證實能導(dǎo)致小鼠多方面的抑郁表現(xiàn)。 但CUMS 小鼠難以長時間維持抑郁狀態(tài)，不利于慢性抑郁癥的研究[11]。 早期不良事件會增加成年后行為障礙的風(fēng)險，包括神經(jīng)精神疾病，例如抑郁癥和精神病[17]。 在嚙齒動物和靈長類動物模型中，新生兒時期的不利環(huán)境容易導(dǎo)致個體調(diào)節(jié)行為異常以及壓力耐受性降低，這可能會導(dǎo)致成年后神經(jīng)生物學(xué)、生理學(xué)和情緒行為發(fā)生持續(xù)改變[18-21]。然而，ELS 小鼠在表達抑郁樣行為時穩(wěn)定性不夠，假陽性率高。 在此基礎(chǔ)上，本課題組綜合了CUMS 和ELS 造模方法，通過早期不良事件降低小鼠對壓力的耐受性，并通過慢性應(yīng)激事件激發(fā)小鼠的抑郁樣行為，誘導(dǎo)小鼠表現(xiàn)出長期穩(wěn)定的抑郁表現(xiàn)，提高模型的可靠性。

由上述實驗結(jié)果可知，對比CUMS 以及ELS 小鼠，LTD 小鼠在造模結(jié)束后20 d 依然表現(xiàn)出穩(wěn)定的抑郁狀態(tài)，可以有效模擬臨床慢性抑郁癥患者。 同時，LTD 模型并不會使小鼠表現(xiàn)出明顯的焦慮狀態(tài)，可能與慢性溫和刺激頻數(shù)減少有關(guān)。 同時，我們觀察到LTD 小鼠的海馬神經(jīng)元呈退行性病變，可能是LTD 小鼠能長久的表現(xiàn)出抑郁行為的原因之一。

有趣的是，我們觀察到LTD 小鼠與ELS 小鼠會出現(xiàn)不同程度自殘現(xiàn)象。 因為小鼠在開始慢性刺激前已經(jīng)單籠飼養(yǎng)，所以可以排除是其它小鼠所為。 這種現(xiàn)象往往容易出現(xiàn)在脊髓損傷后的小鼠模型，疼痛可能是脊髓損傷后小鼠自殘的原因[22]。我們認為，早期的母嬰分離以及后期壓力應(yīng)對不足可能是導(dǎo)致小鼠自殘的原因，但具體的機理還有待進一步研究。

綜上，我們認為LTD 小鼠對比其他抑郁小鼠在長時間表達抑郁狀態(tài)上有很大的優(yōu)勢，并可能是通過影響海馬神經(jīng)元退行性變化而導(dǎo)致小鼠的長期抑郁行為。