朱華，郭亞茜，杜曉鵬，李卓，蘇磊，秦川

(衛(wèi)健委人類疾病比較醫(yī)學重點實驗室，中國醫(yī)學科學院醫(yī)學實驗動物研究所，北京協(xié)和醫(yī)學院比較醫(yī)學中心，北京 100021)

代謝組學是通過分析細胞或組織受遺傳、環(huán)境等因素影響產(chǎn)生的小分子代謝物的變化規(guī)律，識別不同病理生理同狀態(tài)下的差異代謝產(chǎn)物，進而推測正?；蚣膊r機體代謝的生理病理機制[1-2]。 冠心病作為一種常見的心血管疾病，由于基因與基因、基因與環(huán)境的相互作用導致存在大量特征性代謝產(chǎn)物及相關(guān)代謝通路，其病理生理機制與代謝性密切相關(guān)[3-4]。 對冠心病患者及相關(guān)動模型的糞便、血液等進行代謝組學分析，了解其發(fā)生、發(fā)展進程中伴隨的小分子物質(zhì)的生物學變化，發(fā)現(xiàn)可能相關(guān)的代謝標志物，研究其病理機制，對冠心病早期篩查、診斷、疾病進展監(jiān)測、治療效果評估和預(yù)后評價等各個方面都具有重要意義[5-6]。 目前主要的代謝組技術(shù)平臺主要有氣相色譜-質(zhì)譜(GC+MS)，液相色譜-質(zhì)譜(liquid chromatography-mass spectrometry，LC-MS)等。 其中LC-MS 具有靈敏度高、分離效率高、數(shù)據(jù)庫完整易于分析等優(yōu)點[7-8]。 LC-MS 法主要檢測非揮發(fā)性的低分子化合物，樣品用量少，可同時檢測幾百種化合物，目前己被廣泛用于心血管疾病、胃腸道疾病、糖尿病、腫瘤等多種疾病及藥理、毒理、營養(yǎng)等方面的研究。 課題組在前期工作中已成功建立冠心病菌群人源化小鼠模型，本研究在此基礎(chǔ)上，通過LC-MS 對模型小鼠進行血漿的非靶向代謝組學研究，從代謝組學角度探討腸道菌群與冠心病發(fā)生、發(fā)展的關(guān)系，尋找其可能存在的新干預(yù)靶點。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動物模型

實驗使用的動物為課題組自己繁育的無菌C57BL/6J 小鼠，雌性，飼養(yǎng)于無菌隔離器，實驗動物使用許可證號【SYXK(京)2018-0019】。 飼養(yǎng)條件：溫度21 ～25℃，濕度40% ～70%，光照周期明暗比12h：12h。 實驗獲得中國醫(yī)學科學院醫(yī)學實驗動物研究所實驗動物使用與管理委員會(IACUC)批準，批準號ZH17001。 模型建立方法見參考文獻[9]。

1.1.2 主要試劑與儀器

分析用甲醇，純凈水、乙腈、甲酸均為Thermo 公司產(chǎn)品。 主要儀器：質(zhì)譜儀(Thermo，QE HF-X)，色譜儀(Thermo，Vanquish UHPLC)，色譜柱(Thermo，Accucore HILIC column)，低溫離心機(Thermo，ST16R)，真空冷凍干燥機(Labogene ，Scan Speed 40)。

1.2 方法

1.2.1 樣品采集及處理

在糞菌移植6 周、10 周后每組分別安樂7 只動物，小鼠眼眶取血，肝素抗凝，1500 rpm/min 離心10 min，分離血漿，無菌管分裝后，-80℃保存待測。檢測時取100 μL 血漿樣本置于EP 管中，加400 μL 80%甲醇水溶液，漩渦震蕩，室溫靜置60 min 后4℃15 000 rpm/min 離心20 min。 取上清于1.5 mL 離心管中真空冷凍干燥。 殘留物用100 μL 復(fù)溶劑溶解，漩渦震蕩，4℃15 000 rpm/min 離心15 min 取上清100 μL 進行LC-MS 分析。 從處理好樣本中取等量上清100 μL 混勻做質(zhì)控。 選擇實驗樣本的空白基質(zhì)作為空白樣本，處理方法與樣本相同。

1.2.2 數(shù)據(jù)處理

將下機原始數(shù)據(jù)導入CD 搜庫軟件做保留時間、質(zhì)荷比等參數(shù)的初步篩選。 然后對樣品根據(jù)保留時間偏差0.2 min、質(zhì)量偏差5 ppm 進行峰對齊，以提高鑒定準確度。 隨后根據(jù)設(shè)置的質(zhì)量偏差5 ppm、信號強度偏差30%、信噪比3、最小強度100 000、加和離子等參數(shù)進行峰提取，對峰面積進行定量，整合目標離子預(yù)測化合物的分子式并與mzCloud 數(shù)據(jù)庫進行比對。 空白樣本用于去除背景離子，質(zhì)控樣本用于定量結(jié)果進行歸一化，最終得到數(shù)據(jù)鑒定和定量結(jié)果。

1.3 統(tǒng)計學分析

數(shù)據(jù)分析使用SPSS 22.0 統(tǒng)計軟件。 統(tǒng)計結(jié)果用平均值±標準差(±s)形式表示，組間差異使用One-way ANOVA 檢驗，P＜0.05 為差異具有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 分析方法驗證

QC 樣本的作用在于測試加樣前儀器狀態(tài)，評價實驗過程中色譜-質(zhì)譜系統(tǒng)的穩(wěn)定性。 QC 樣本相關(guān)性數(shù)值越接近于1 表示測試方法穩(wěn)定性越好，數(shù)據(jù)質(zhì)量越高。 在正負離子2 個模式下，QC 樣本相關(guān)性最小值為0.976，表明此次檢測方法穩(wěn)定，數(shù)據(jù)可信(圖1)。 通過偏最小二乘法判別分析(PLSDA)獲得模型評價參數(shù)(R2，Q2)，R2 和Q2 值越接近1，表示模型越穩(wěn)定可靠；若R2 和Q2 小于0.5，則表示模型可靠性較差。 實驗得到的模型相關(guān)評價參數(shù)為：6 周時R2=0.66，Q2=0.71(圖2A)，10周時R2=0.60，Q2=0.97(圖2B)，說明模型構(gòu)建穩(wěn)定，數(shù)據(jù)可靠。

2.2 總樣本主成分(PCA)分析

對采集到的數(shù)據(jù)進行PCA 分析，可以看到實驗組、對照組在正負離子分析模式中均被明顯的分開(圖3)，說明兩組動物間代謝存在明顯的差異。 而每個組內(nèi)不同時間節(jié)點則聚合的較好，說明在組內(nèi)不同時間的代謝方面模型是穩(wěn)定的(圖3)。

2.3 差異代謝產(chǎn)物的篩選與鑒定

本實驗使用PLS-DA 模型第一主成分的變量投影重要度(Variable Importance in the Projection，VIP)值結(jié)合t-testP值獲得差異性表達代謝物。 設(shè)置閾值為VIP ＞1.0，差異倍數(shù)FC ＞2.0 或FC ＜0.5 且Pvalue ＜0.05，在建模6 周時正離子模式篩選出差異代謝產(chǎn)物476 個，其中上調(diào)223 個，下調(diào)253 個。 10 周時正離子模式篩選出差異代謝產(chǎn)物475 個，其中上調(diào)193 個，下調(diào)282 個。 6 周負離子模式篩選出差異代謝產(chǎn)物344 個，其中上調(diào)152 個，下調(diào)192 個。 10 周負離子模式篩選出差異代謝產(chǎn)物330 個，其中上調(diào)104 個，下調(diào)226 個(表1)。

在HMDB 數(shù)據(jù)庫中找出對應(yīng)的可能內(nèi)源性物質(zhì)，再在PeakView 軟件中找出這些可能物質(zhì)相應(yīng)的一級和二級質(zhì)譜圖，通過與數(shù)據(jù)庫(HMDB，METLIN，MassBank 和KEGG)中的一級和二級質(zhì)譜圖進行比對，最終通過標準品確認30 個在2 個時間點均存在的差異代謝物。 其中L-肉毒堿、苯丙酮酸、1-萘酚、2-萘酚在模型組顯著升高(表2)。

2.4 代謝通路分析

為進一步研究這30 種差異代謝物與冠心病之間的關(guān)系，本研究通過MetPA 3.0 進行代謝通路分析來確定與差異代謝物最為相關(guān)的代謝通路。 最終發(fā)現(xiàn)次級膽汁酸代謝通路(影響因子0.33)、甘氨酸、絲氨酸和蘇氨酸代謝途徑(影響因子0.31)這2個在建模6 周、10 周2 個時間點都發(fā)生改變的代謝通路(圖4)。 且這兩條代謝通路均為下調(diào)(圖5)。

3 討論

本研究基于LC-MS 技術(shù)對冠心病人源菌群小鼠的血漿進行了非靶向代謝組學研究。 在建模6周、10 周2 個時間節(jié)點的R2 和Q2 值分別為0.66、0.71 和0.60、0.97，說明代謝模型構(gòu)建成功，有良好的預(yù)測能力。 在PCA 分析中，CON 組和CAD 組在正負離子模式下均被明顯的區(qū)分開，而在組內(nèi)不同階段則聚合的較好，說明兩組動物間的小分子物質(zhì)代謝存在明顯差異，但在組內(nèi)代謝方面是穩(wěn)定的。

通過多元統(tǒng)計數(shù)據(jù)分析，鑒定出包括L-肉毒堿、苯丙酮酸、1-萘酚、2-萘酚在內(nèi)的30 種在2 個時間節(jié)點都具有顯著差異性的代謝物。 這些代謝物主要包括苯和其取代的衍生物、核苷酸類、類固醇和類固醇衍生物類、羧酸及其衍生物類、胺類等。肉毒堿類代謝物在冠心病患者與對照人群中的差異幾乎在所有有關(guān)冠心病代謝組學研究都被報道過。 L-肉毒堿是一種來源于甲硫氮酸和賴氨酸生物合成的季銨化合物，在能量代謝，特別是脂肪酸分解代謝中發(fā)揮重要作用，它可以輔助轉(zhuǎn)移長鏈脂肪酸通過線粒體內(nèi)膜進入基質(zhì)，通過促進其β-氧化為心肌細胞提供所需能量[10-12]。 L-肉毒堿減少會導致脂肪代謝異常，血脂升高，加速動脈粥樣硬化進程，促進冠心病的發(fā)生發(fā)展[13-14]。 本研究中也發(fā)現(xiàn)在不同時間節(jié)點模型組動物L-肉毒堿水平的顯著降低。 與上述報道相符。

圖1 QC 樣本相關(guān)性分析結(jié)果Figure 1 Results of QC sample correlation analysis

圖2 模型評價參數(shù)Note. A，Positive ion mode； B，Negative ion mode.Figure 2 Evaluation parameters of metabolic model

圖3 總樣品PCA 分析Note. A，Positive ion mode； B，Negative ion mode.Figure 3 PCA of the QC samples

表2 特征性差異代謝產(chǎn)物Table 2 Characteristic differential metabolites

為進一步研究這30 種代謝物和冠心病之間的關(guān)系，通過代謝通路分析確定了與所選代謝物最為相關(guān)的代謝通路。 最終發(fā)現(xiàn)次級膽汁酸代謝、甘氨酸、絲氨酸和蘇氨酸代謝這2 個通路在6 周、10 周2個時間點都呈現(xiàn)下調(diào)趨勢。 甘氨酸、絲氨酸和蘇氨酸代謝途徑主要是促進磷酸肌酸和ATP 合成：甘氨酸是內(nèi)源性抗氧化劑還原性谷胱甘肽的組成氨基酸，在谷氨酸-半胱氨酸連接酶的催化下，消耗ATP產(chǎn)生γ-谷氨酸半胱氨酸，然后在谷胱甘肽合成酶催化下，與甘氨酸結(jié)合合成谷胱甘肽。 蘇氨酸主要通過蘇氨酸脫水酶、蘇氨酸脫氫酶、蘇氨酸醛縮酶催化轉(zhuǎn)變?yōu)槠渌镔|(zhì)。 處于氨基酸代謝中間位置的絲氨酸則主要通過增加NADPH 的合成，消除氧自由基的毒害作用，在維持細胞的存活中起重要作用[15-17]。 模型動物這條代謝通路下調(diào)，能量代謝降低，氧自由基、肉毒堿、丙酮類有害代謝產(chǎn)物增加。這與冠心病患者缺血缺氧使三羧酸循環(huán)(TCA)受抑制，能量供應(yīng)不足的病理生理機制是吻合的。

膽汁酸不僅是參與脂類消化吸收的重要物質(zhì)，也是調(diào)控糖脂和能量代謝的關(guān)鍵信號分子[18]。 膽汁酸以膽固醇為原料在肝臟中合成，通過腸肝循環(huán)在腸道中代謝。 膽汁酸與腸道菌群之間存在著相互作用的關(guān)系。 腸道菌群可促進食物中營養(yǎng)物質(zhì)的吸收，并產(chǎn)生大量代謝物通過相應(yīng)的受體間接調(diào)控宿主代謝[19]。 膽汁酸的腸道調(diào)控，主要是通過激活腸道FXR 核受體實現(xiàn)。 膽汁酸代謝通路下調(diào)使膽固醇代謝減慢，血脂升高[20]。 這與模型組移植志愿者的臨床癥狀、小鼠模型體重增長趨勢及血脂變化情況相符。

圖4 不同時間節(jié)點的共同差異代謝通路Note. A，6 weeks after modeling. B，10 weeks after modeling.Figure 4 Common differential metabolic pathways at different time nodes

圖5 冠心病人源菌群小鼠差異代謝通路Note. A，Bile acid metabolism pathway. B，Glycine，serine and threonine metabolism pathway.Figure 5 Differential metabolic pathways in mice with coronary heart disease

本研究應(yīng)用代謝組學技術(shù)對冠心病人源菌群小鼠的特征性代謝產(chǎn)物及相關(guān)代謝通路進行研究分析，發(fā)現(xiàn)了與冠心病患者類似的改變，為冠心病病理機制、早期診斷、治療效果評估等的研究提供了基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。 但代謝組學技術(shù)可檢測出大量差異性代謝產(chǎn)物，如何有效篩選出與疾病明確相關(guān)的特征性代謝物質(zhì)仍是需要解決的問題。 這些不足希望可以通過進一步提高完善代謝組學檢測分析技術(shù)來解決。