李平麗，吳驍，楊建成

(1. 沈陽農(nóng)業(yè)大學(xué)畜牧獸醫(yī)學(xué)院，沈陽 110866； 2. 遼寧何氏醫(yī)學(xué)院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心，沈陽 110163)

宮內(nèi)生長受限(IUGR)是妊娠期最常見的營養(yǎng)缺乏性疾病。 其圍產(chǎn)兒死亡率為正常兒6 ～10 倍，IUGR 可導(dǎo)致早產(chǎn)，子代低出生體重和小于胎齡兒的發(fā)生[1]。 胎兒接收到的營養(yǎng)供給與母體息息相關(guān)，當(dāng)各種原因?qū)е履阁w攝入的營養(yǎng)受到限制時(shí)，隨之到達(dá)胎兒的營養(yǎng)也會相應(yīng)減少，引發(fā)胎兒生長受到限制[2]。 IUGR 是國內(nèi)外發(fā)育的主要研究熱點(diǎn)之一，但目前尚無明確藥物或方法解決。 ?；撬?Taurine)是一種條件性必需氨基酸，可以維持細(xì)胞膜穩(wěn)定，增強(qiáng)機(jī)體抗氧化能力，提高人類和動(dòng)物繁殖性能等[3]。 ?；撬嵋呀?jīng)被當(dāng)做飼料添加劑廣泛應(yīng)用于動(dòng)物生產(chǎn)中，在維持動(dòng)物機(jī)體的正常生理功能以及增強(qiáng)機(jī)體生產(chǎn)性能等方面都發(fā)揮著重要的調(diào)節(jié)作用[4]。 ?；撬釋μ杭靶律鷥荷L發(fā)育以及中樞神經(jīng)系統(tǒng)具有重要作用，圍產(chǎn)期補(bǔ)充?；撬峥梢詼p少胎兒生長受限的孕婦懷孕期間由于牛磺酸缺乏引起的新生兒出生體重降低等并發(fā)癥的發(fā)生率。 因此，我們推測?；撬峥赡芫哂懈纳颇阁w營養(yǎng)的作用。 本文擬采用低蛋白飲食制備IUGR 模型，考察?；撬釋υ惺蟮挠绊?，揭示牛磺酸改善IUGR 的機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

SD 大鼠60 只，SPF 級，其中雄性20 只，雌性40只，所有的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物均為8 周齡，體重200 ～250 g，購置遼寧長生生物技術(shù)有限公司【SCXK(遼)2015-0001】，飼養(yǎng)于沈陽綠谷生物技術(shù)產(chǎn)業(yè)有限公司動(dòng)物實(shí)驗(yàn)室【SYXK(遼)2015-0007】。 雌雄2 ∶1合籠飼養(yǎng)，第二天清晨取各組實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的陰道分泌物并用顯微鏡進(jìn)行觀察，當(dāng)發(fā)現(xiàn)精子時(shí)記為該實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的孕1 d，顯微鏡觀察以后，將同一時(shí)間發(fā)現(xiàn)陰道分泌物中有精子的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組，不限飲水，飼料均由沈陽茂華生物科技有限公司【SCXK(遼)2017-0001】提供。 室溫控制在20 ～25 ℃，濕度40% ～70%，12 h 晝夜交替照明。 所有操作均符合沈陽綠谷生物技術(shù)產(chǎn)業(yè)有限公司的實(shí)驗(yàn)倫理要求(審批號：IACUC 2015007)。

1.1.2 試劑和儀器

?；撬?純度＞99%)，購自潛江永安藥業(yè)股份有限公司(批號：SXP17013068)。 生長激素(GH)、胰島素(INS)、胰島素生長因子(IGF-1)、三碘甲狀腺原氨酸(T3)、甲狀腺素(T4)(均購自伊萊特生物科技股份 有 限 公 司，批 號 分 別 為：AK0018FEB26010、AK0018FEB26018、AK0018FEB26008、AK0018FEB25021、AK0018FEB250171)。 50 × TAE Buffer、1 × TE Buffer批號：C615KA3D123KA4804)，購于上海生工生物工程股份有限公司；RNA 提取試劑TRIzol(批號：Q5322)，購于沈陽海靈興業(yè)商貿(mào)有限公司；DL 2000 DNA Maker(批號：A2510)、PrimeScript RT reagent Kit with gDNA Eraser(批號：AAK4802)、Free-water(批號：AHF2302A)、SYBR Premix Ex Taq II(批號：A5602)，購于沈陽海靈興業(yè)商貿(mào)有限公司。

酶標(biāo)儀(Infinite M200 PRO，TECAN 公司)；HE120 型水平式電泳槽(上海天能科技有限公司)；DHP-9162 型生化培養(yǎng)箱(上海一恒科技有限公司)； 高 速 冷 凍 離 心 機(jī)( AllegraX - 22 型，BECKMANCOMLT 公司)；GelDoc XR 凝膠成像系統(tǒng)、S1000PCR 擴(kuò)增儀、iQ5 熒光定量基因擴(kuò)增儀(Bio-Rad，美國)。

1.2 方法

1.2.1 實(shí)驗(yàn)處理

取健康SD 系大鼠雌雄2 ∶l 合籠飼養(yǎng)，按妊娠順序隨機(jī)抽取孕鼠分為正常飼料組(C)、低蛋白飼料組(M)、低蛋白飼料+?；撬峤M(MT)，正常飼料+?；撬峤M(T)。 動(dòng)物模型建立參照文獻(xiàn)[5]并加以改進(jìn)，采取全程低蛋白飲食法建立IUGR 模型。 自受孕第1 ～21 天，C 組大鼠予標(biāo)準(zhǔn)飼料(能量比例構(gòu)成：蛋白質(zhì)20%、碳水化合物60%、脂肪4%，其他16%)，IUGR 組和MT 組予低蛋白飼料(能量比例構(gòu)成：蛋白質(zhì)8%、碳水化合物60%、脂肪4%，其他28%)；MT、T 組自受孕第12 天起口服添加?；撬?00 mg/(kg·d)至第21 天。 整個(gè)飼養(yǎng)過程中采取自由攝食，飲水充足。 孕第21 天，取胎鼠，稱重、記錄出生只數(shù)，胎鼠畸胎數(shù)，取孕鼠血液、肝，Elisa 方法檢測孕鼠血清生長激素(GH)、胰島素生長因子1(IGF-1)、胰島素(INS)、甲狀腺素(T3 和T4)水平。肝立即置于-80 ℃冰箱，凍存待檢。 提取組織RNA時(shí)，按RNA 提取試劑盒說明書提取。 確定總RNA樣本質(zhì)量和濃度，以500 ng 總RNA 為范本，按反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書合成互補(bǔ)脫氧核糖核酸(complementarydeoxyribonucleicacid，cDNA)。 q-PCR的反應(yīng)體系20 μL：SYBR Green I RCR buffer 10 μL，上下游引物各0.8 μL，cDNA 模板2 μL，ddH2O 6.4 μL，每個(gè)樣本均做3 個(gè)復(fù)孔。 反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性2 min，95 ℃30 sec，引物退火溫度55 ℃45 sec，72 ℃45 sec，共40 個(gè)循環(huán)。 根據(jù)2-△△Ct對基因表達(dá)進(jìn)行相對定量分析。

1.2.2 目的及內(nèi)參引物設(shè)計(jì)

NCBI 網(wǎng)站搜索GenBank 中已有的大鼠GHR、IGF-1、IGFBP-1 和IGFBP-3 基因序列設(shè)計(jì)相應(yīng)引物，以GAPDH 為內(nèi)參基因，引物由上海生物工程股份有限公司合成。 (見表1)

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

使用SPSS17. 0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)，使用Graphpad Prism 5 軟件作圖。 兩組數(shù)據(jù)之間差異性用t檢驗(yàn)的方法進(jìn)行分析，使用單因素方差分析多組數(shù)據(jù)之間的差異性，最終的計(jì)量數(shù)據(jù)采用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示(±s)。P＜0.05 表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組新生仔鼠數(shù)量、體重、死胎、畸形和IUGR發(fā)生率的測定結(jié)果

通過表2 各組數(shù)據(jù)可以表明IUGR 造模是否成功。 如表2 所示，與C 組相比，M 組新生仔鼠平均數(shù)量顯著減少(P＜0.05)，平均體重極顯著下降(P＜0.01)，死胎率分別為16.42%(P＜0.01)，畸形率為1.50%(P＜0.05)。 與M 組相比，MT 組新生仔鼠平均數(shù)量增加，但無顯著性差異(P＞0.05)，平均體重顯著升高(P＜0.05)，死胎率和畸形率均降低顯著(P＜0.05)。 MT 和T 組均無死胎和畸形胎；IUGR 以低于空白胎鼠平均體重2 個(gè)標(biāo)準(zhǔn)差為標(biāo)準(zhǔn)，計(jì)算IUGR 發(fā)生率[1-2]。 與C 組相比，M 組IUGR 發(fā)生率顯著增加，與M 組相比，MT 組IUGR 發(fā)生率減少。 實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明給懷孕的母鼠補(bǔ)充牛磺酸可以明顯降低新生仔鼠的死胎率與畸形率。 T 組與空白組比較，胎鼠平均體重顯著增加，IUGR 發(fā)生率則明顯減少，表明牛磺酸對正常營養(yǎng)出生胎鼠生長有促進(jìn)作用。 (見表2)

表1 PCR 引物序列Table 1 PCR primer sequence

表2 新生仔鼠數(shù)量、體重、死胎、畸形和IUGR 發(fā)生率測定結(jié)果Table 2 Number，weight，stillbirth，malformation and incidence of IUGR of newborn rats in each group

2.2 各組孕鼠妊娠期體重增長

妊娠期1 ～7 d，各組孕鼠體重均增加，各組增重?zé)o差異。 第7 ～14 天，M 組增重略低，但差異不顯著(P＞0.05)，MT 組與M 組差異顯著(P＜0.05)，第14 ～21 天，M 組增重與C 組相比極顯著(P＜0.01)，MT 組增重與M 組相比差異極顯著(P＜0.01)，T 組與對照組相比增長迅速(P＜0.01)。(見表3)

2.3 各組孕鼠妊娠期末血液變化

妊娠期末，M 組血清中GH、INS 和T4 濃度與C組相比均降低，其中GH 和T4 降低顯著(P＜0.05)，INS 降低極顯著(P＜0.01)。 MT 組血清中GH、IGF-1、T3 濃度與M 組均有升高趨勢，INS、T4升高顯著(P＜0.05)。 T 組GH、IGF-1、T3 濃度與C組相比均升高，GH 升高極顯著(P＜0.01)，IGF-1、T3 升高顯著(P＜0.05)。 (見表4)

2.4 各組孕鼠肝生長激素受體(GHR)、胰島素生長因子1(IGF-1)、胰島素生長因子結(jié)合蛋白1(IGFBP-1)和胰島素生長因子結(jié)合蛋白3(IGFBP-3)mRNA 表達(dá)水平變化

妊娠期末，M 組大鼠肝GHR、IGF-1、IGFBP-3 mRNA 表達(dá)量降低，IGFBP-3 下降顯著(P＜0.05)，IGFBP-1 表達(dá)明顯升高(P＜0.01)。 MT 組GHR、IGF-1、IGFBP-3mRNA 與M 組比較均升高，但GHR 升高不顯著(P＞0.05)。 與C 組相比，T 組GHR、IGF-1、IGFBP-3mRNA 均 升 高，IGFBP-3 升 高 極顯 著(P＜0.01)IGFBP-1 表達(dá)下降(P＜0.05)。 (見圖1)

3 討論

IUGR 的發(fā)生與母體攝入的營養(yǎng)有關(guān)密切關(guān)系，各種引起母體攝入營養(yǎng)受限的因素都有可能導(dǎo)致IUGR 的發(fā)生，進(jìn)而導(dǎo)致圍產(chǎn)期胎兒高發(fā)病率與高死亡率[7]。 本實(shí)驗(yàn)采用低蛋白營養(yǎng)制備IUGR 模型，出生胎鼠數(shù)量、體重、死胎、畸形方面結(jié)果顯示，模型制備成立，?；撬釤o論對低營養(yǎng)或者正常營養(yǎng)的胎鼠，均有促進(jìn)生長作用。

表3 各組孕鼠體重增長情況比較(g)Table 3 Comparison of weight growth of pregnant rats in each group (g)

表4 各組孕鼠妊娠期末血液學(xué)參數(shù)比較Table 4 Comparison of hematological parameters at the end of pregnancy in each group of pregnant rats

圖1 孕鼠肝GHR、IGF-1、IGFBP-1 和IGFBP-3 mRNA 相對表量Note. NS meansP＞0.05.n=10.Figure 1 Relative expression of GHR，IGF-1，IGFBP-1 and IGFBP-3 mRNA in liver of pregnant rats

母體內(nèi)分泌激素通過調(diào)節(jié)代謝而影響胎兒的生長發(fā)育，胚胎的生長發(fā)育主要受內(nèi)分泌生長軸的調(diào)控，其中GH/IGF-1軸是動(dòng)物實(shí)現(xiàn)營養(yǎng)代謝及促進(jìn)生長的關(guān)鍵[8]。 本試驗(yàn)，由于妊娠期營養(yǎng)物質(zhì)較低，營養(yǎng)受限母體血液中GH 和INS 濃度顯著下降，子代發(fā)生IUGR，與Berends 等人的實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致[9-13]。 母體在孕期時(shí)如果營養(yǎng)受到限制，則將直接影響到出生子鼠。 例如飼料中的蛋白質(zhì)水平無法滿足正常的需要，那么母體中的血液胰島素水平將會急劇的降低，進(jìn)而加快脂肪分解，母體的血糖也會隨之升高。 低濃度的INS、IGF-1 通過調(diào)節(jié)母體的代謝，加強(qiáng)其組織蛋白質(zhì)的分解效率，最終導(dǎo)致新生仔鼠體重下降以及發(fā)育遲緩等一系列并發(fā)癥的出現(xiàn)[14]。 甲狀腺激素分泌不足可導(dǎo)致胎兒神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育障礙，嚴(yán)重者可出現(xiàn)呆小癥[15]。 臨床數(shù)據(jù)顯示，妊娠不良結(jié)局的發(fā)生與甲減關(guān)系密切[16-17]。IUGR 臍血T4 水平較正常組顯著下降，IUGR 孕婦體內(nèi)存在甲狀腺功能減低的現(xiàn)象，提示上述結(jié)果可能與胰島素分泌不足影響甲狀腺素的代謝有關(guān)[18]。本實(shí)驗(yàn)中結(jié)果顯示牛磺酸能夠提高IUGR 孕鼠INS、T4 水平。 綜上我們推測，補(bǔ)充牛磺酸提高出生重，除了影響GH/IGF 軸外，也可能與增加胰島素分泌有關(guān)。

營養(yǎng)受到限制，母體可通過調(diào)節(jié)其體內(nèi)生長軸相關(guān)素與其受體基因的表達(dá)而影響動(dòng)物的生長，肝中GHR、IGF-1 等是內(nèi)分泌生長軸的重要組成部分，是肝代謝變化的重要調(diào)節(jié)因子[19-20]。 此外，營養(yǎng)攝入低不僅會抑制肝細(xì)胞GHR 和IGF-1 基因的表達(dá)還會降低血液中IGF-1 水平。 楊美霞[16]發(fā)現(xiàn)低營養(yǎng)妊娠母羊肝IGF-1 基因表達(dá)量極顯著低于自由采食。 GHR 的減少抑制了IGF-1 的生成，母體血中IGF-I 濃度降低。 當(dāng)然，這也與營養(yǎng)受限后胰島素濃度降低有關(guān)。 IGF-1 可以通過其結(jié)合蛋白調(diào)節(jié)自身的生物活性，IGF-1 主要有IGFBP-1 和IGFBP-3 兩種結(jié)合蛋白，其表達(dá)與營養(yǎng)調(diào)控有關(guān)，在循環(huán)血液中，IGF-1 的活性受IGFBP-1 影響，主要是抑制其活性，而IGF-1 的輸作用主要由IGFBP-3 完成[21]。 在本實(shí)驗(yàn)中，IUGR 組GHR、IGF-1 的mRNA 表達(dá)量均降低，IUGR 孕鼠IGFBP-1 的mRNA 水平顯著升高，而IGFBP-3 mRNA 水平顯著降低，表明營養(yǎng)不良大鼠體內(nèi)存在GH/IGF-l 系統(tǒng)紊亂。 補(bǔ)充牛磺酸組的IGF-1/IGFBP-3 mRNA 水平明顯升高，T 組IGFBP-3極顯著升高，表明?；撬峥梢詮闹苯雍烷g接兩方面發(fā)揮作用。 它不僅可以直接促進(jìn)IGF-1 的表達(dá)，還可以通過調(diào)節(jié)IGF 結(jié)合蛋白的表達(dá)間接發(fā)揮作用，通過一系列途徑發(fā)揮改善IGF-1 的生物學(xué)活性的作用。 補(bǔ)充牛磺酸組還可降低IGFBP-1 水平，間接增加游離IGF-1 水平及活性，提示?；撬峥赏ㄟ^糾GH/IGF-1 系統(tǒng)的功能紊亂，達(dá)到改善孕鼠營養(yǎng)的作用。

綜上所述，本次實(shí)驗(yàn)營養(yǎng)不良大鼠循環(huán)內(nèi)甲狀腺、GH/IGF-1 軸紊亂，而?；撬峥杉m正GH/IGF-1系統(tǒng)功能紊亂，改善胎兒生長作用。 但因GH/IGF-1系統(tǒng)與胎兒體內(nèi)激素水平并無定論，所以，關(guān)于?；撬釋UGR 的作用，仍需進(jìn)一步研究。

致謝：感謝國家自然科學(xué)基金的資助。