張 超 姚成增 蔣梅先* 關(guān)敬樹

（1.上海市寶山區(qū)中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院心內(nèi)科， 上海201999； 2.上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬曙光醫(yī)院心內(nèi)科， 上海200021）

在前期研究中發(fā)現(xiàn)，活心方加載治療冠心病心絞痛有確切的臨床療效，并能提高患者的左室射血分數(shù)（LVEF），改善血流動力學(xué)指標，縮小急性心梗大鼠的梗死面積，從而改善心梗后大鼠的心功能［1-2］。本文目的是通過結(jié)扎冠狀動脈前降支的方法構(gòu)建雄性SD 大鼠急性心梗模型，觀察活心方干預(yù)對心梗模型鼠梗死邊緣區(qū)缺血心肌血管密度及其陽性面積比值、血管新生相關(guān)因子及其受體表達以及血清血管內(nèi)皮生長因子（VEGF） 表達等的影響，進一步重點探明活心方治療冠心病的作用機制。

1 材料

1.1 動物 雄性SD 大鼠107 只，體質(zhì)量200～250 g，購自上海西普爾-必凱實驗動物有限公司，生產(chǎn)許可證號SCXK（滬） 2003-0002。

1.2 藥物 血竭小復(fù)方由血竭、降香、三七等3 味藥按1∶1∶2的比例共研末，加入到由生理鹽水及羧甲基纖維素鈉配制的0.5%羧甲基纖維素鈉混懸劑中，制成含生藥量為0.016 2 g／mL 的血竭小復(fù)方混懸劑?；钚姆胶S芪、桂枝、象貝母、血竭等9 味中藥，其中血竭等3 味藥研末后制成含生藥量為0.032 4 g／mL 血竭小復(fù)方混懸劑，其余黃芪等制成含生藥量為1.656 g／mL 的水煎劑；將上述2 制劑等體積混合，最終配制成含生藥量為0.844 g／mL 的活心方水劑。上述藥物由上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬曙光醫(yī)院藥劑科制備提供，4℃冰箱保存?zhèn)溆谩Ｘ悘?fù)濟（珠海億勝生物制藥有限公司，批號20070106）；肝素鈉注射液（上海市第一生化藥業(yè)有限公司，批號060601）。

1.3 試劑 CD34 免疫組化試劑盒（武漢博士德生物工程有限公司，BA0532）；VEGF ELISA 試劑盒（上海奇康生物科技有限公司，RRV00）；VEGF 免疫組化試劑盒（美國Santa Cruz 公司，Sc-7269）；bFGF 免疫組化試劑盒（美國Chemicon 公司，AB1458）；Flt-1 免疫組化試劑盒（美國Lab Vision 公司，Rb-9049-p1）；Flk-1 免疫組化試劑盒（美國Santa Cruz 公司，Sc-6251）。

1.4 儀器 DW2000型小動物呼吸機（上海嘉鵬科技有限公司）；OLYMPUS BX60 光學(xué)顯微鏡（日本Olympus 公司）；MIQS 醫(yī)學(xué)圖像分析系統(tǒng)、醫(yī)學(xué)圖像分析軟件（上海求為生物科技有限公司）；OLYMPUS BH2 顯微鏡（日本Olympus公司）；LKB V型超薄切片機（瑞典LKB 公司）；NIKON 4500 數(shù)碼相機（日本Nikon 公司）；DYNEX OPSYS MR 酶標儀（美國Dynex 公司）。

2 方法

2.1 造模及分組 大鼠實驗前適應(yīng)性飼養(yǎng)1 周。隨機分為假手術(shù)組、模型組、貝復(fù)濟組、血竭小復(fù)方組和活心方組。除假手術(shù)組大鼠外，其余大鼠均參照相關(guān)文獻［3-4］，用鹽酸氯胺酮（80 mg／kg） 腹腔麻醉，氣管插管后接人工呼吸機輔助呼吸（呼吸頻率為90 次／分，潮氣量為4～6 mL）。術(shù)前75%酒精消毒后，在左胸第4～5 肋骨間作橫切口，從左側(cè)第4 肋間鈍性分離打開胸腔，輕輕擠壓胸腔，暴露心臟，剪開心包，在肺動脈圓錐與左心耳交界稍下1～2 mm處用無創(chuàng)性縫線結(jié)扎左側(cè)冠狀動脈前降支，開胸前后即時記錄Ⅱ?qū)?lián)心電圖。以結(jié)扎部位以下心肌變白且搏動減弱，并且心電圖出現(xiàn)ST 段弓背向上明顯抬高為造模成功，然后逐層縫合胸壁，待其恢復(fù)自主呼吸，拔除插管。造模當(dāng)天始每天注射青霉素3 d 預(yù)防感染。假手術(shù)組在開胸后不結(jié)扎左冠狀動脈前降支，而僅在相應(yīng)部位用無線縫針空穿1次即縫合胸壁，其余步驟與模型動物處理相同。

2.2 給藥 參照相關(guān)文獻［5］，根據(jù)“人和動物按體表面積折算的等效劑量比值表” 折算給藥劑量。血竭小復(fù)方組及活心方組大鼠在心梗造模后第2 天開始藥物干預(yù)，分別給予血竭小復(fù)方混懸液（生藥量0.162 g／kg） 和活心方水劑（生藥量8.44 g／kg），1 次／d，灌胃給藥8 周。貝復(fù)濟組大鼠于開胸結(jié)扎冠脈后立即在結(jié)扎處周圍予貝復(fù)濟噴灑3 次（125 IU／次），術(shù)后開始每日皮下注射肝素1 次（1 250 U／kg），共5 d；在心梗造模后第2 天開始每天用等體積生理鹽水灌胃，共8 周。假手術(shù)組及模型組大鼠在造模后第2 天開始每天用等體積生理鹽水灌胃，共8 周。

2.3 取材 干預(yù)8 周后，各組大鼠右心房取血5 mL 后，立即用生理鹽水右心房灌注，10%福爾馬林溶液固定心臟，剪去主動脈弓、右心室、心房、心耳等，在左心室乳頭肌水平橫切面切取心肌組織（包括梗死區(qū)、梗死邊緣區(qū)、健存區(qū)），10%福爾馬林液中保存，經(jīng)常規(guī)脫水、透明、石蠟包埋、切片，待作梗死邊緣區(qū)心肌血管密度及其陽性面積比值、血管新生相關(guān)因子及其受體的表達等指標檢測。

2.4 觀察指標與檢測方法

2.4.1 缺血心肌血管密度（MVD） 及其陽性面積比值檢測 ①心肌組織CD34 免疫組化鏈霉菌抗生物素蛋白-過氧化物酶連結(jié)（SP） 法染色梗死邊緣區(qū)心肌組織切片，以細胞內(nèi)出現(xiàn)棕黃色顆粒沉著為陽性反應(yīng)。經(jīng)MIQS 醫(yī)學(xué)圖像分析系統(tǒng)處理，計算梗死邊緣區(qū)顯示有CD34 陽性染色的血管數(shù)目，每張切片隨機觀察3個視野（×250），取均數(shù)，再根據(jù)測量窗面積（0.034 mm2） 即可算出每平方毫米的血管數(shù)目即心肌血管密度；并測定陽性區(qū)域面積，計算血管陽性面積比值＝（SP 染色陽性區(qū)域面積／測窗面積） ×100%。②取免疫組化染色切片，通過顯微鏡、圖像采集卡、數(shù)碼相機進行圖像采集，格式為標準的位圖（BMP）文件格式；物鏡倍數(shù)為250 倍，電壓為3.05 V，電流為2.72 A；測量距離采用顯微鏡專用校正微尺進行標定（計算機自動計算得到比例因子后存儲備用）；采用軟件去除圖像中的紫藍色背景，用鼠標先后選擇陰性區(qū)域（處理后該區(qū)域用藍色表示） 和棕黃色或棕褐色的陽性區(qū)域（處理后該區(qū)域用紅色表示）；測量方式采用全視場測量，測量結(jié)果取陽性區(qū)域面積的平均值。

2.4.2 血管新生相關(guān)因子及其受體檢測 ①血清VEGF水平測定。在2%戊巴比妥鈉麻醉下，右心房所取血5 mL，以3 000 r／min 離心10 min，分離血清，采用酶聯(lián)免疫吸附法（ELISA） 測定大鼠血清VEGF 水平。②心肌VEGF、bFGF、Flt-1 及Flk-1 表達測定。采用免疫組織化SP 法染色梗死邊緣區(qū)心肌組織切片，檢測VEGF、bFGF、血管內(nèi)皮生長因子受體1（Flt-1） 及血管內(nèi)皮生長因子受體2（Flk-1）的表達。以細胞內(nèi)出現(xiàn)棕黃色顆粒沉著為陽性反應(yīng)。應(yīng)用MIQS 醫(yī)學(xué)圖像分析系統(tǒng)計算缺血心肌每個視野（×250） 中的陽性區(qū)域面積和光密度值，隨機測定3個視野，取其均值作為樣本的測定值，計算心肌血管新生相關(guān)因子及受體的免疫組化陽性指數(shù)（陽性面積×光密度值）。③取免疫組化染色切片，通過顯微鏡、圖像采集卡、數(shù)碼相機進行圖像采集，格式為標準的位圖（BMP） 文件格式；物鏡倍數(shù)為250 倍，電壓為3.33 V，電流為2.00 A；測量距離采用顯微鏡專用校正微尺進行標定（計算機自動計算得到比例因子后存儲備用）；采用軟件去除圖像中的紫藍色背景，用鼠標先后選擇陰性區(qū)域（處理后該區(qū)域用藍色表示） 和棕黃色或棕褐色的陽性區(qū)域（處理后該區(qū)域用紅色表示）；測量方式采用全視場測量，測量結(jié)果取陽性區(qū)域面積和陽性比率以及光密度值的平均值。

2.5 統(tǒng)計學(xué)分析 應(yīng)用SPSS 19.0 版本軟件進行統(tǒng)計分析，指標檢測結(jié)果以（） 表示，多組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較方差齊時采用LSD 法，方差不齊時采用Dunnett's T3 法。檢驗水準α＝0.05。

3 結(jié)果

實驗共用去雄性SD 大鼠107 只，其中假手術(shù)組12 只，造模95 只，造模后存活48 只，隨機分為模型組、貝復(fù)濟組、血竭小復(fù)方組和活心方組，每組12 只；故60 只大鼠進入后續(xù)實驗。最終各組分別成功獲取大鼠血清標本11份，并對各組先入組的8 只大鼠留取了心肌組織標本。

3.1 各實驗組大鼠缺血心肌血管密度及其陽性面積比值比較 ①心肌血管密度，與假手術(shù)組大鼠相比，模型組大鼠缺血心肌血管密度增加（P＜0.05）；與模型組大鼠相比，貝復(fù)濟組、血竭小復(fù)方組（P＜0.05） 及活心方組（P＜0.01）大鼠心肌血管密度增加；各用藥組間比較顯示，活心 方組較貝復(fù)濟組（P＜0.01） 及血竭小復(fù)方組（P＜0.05）心肌血管密度增加。②心肌血管陽性面積比值，與假手術(shù)組大鼠相比，模型組大鼠心肌血管陽性面積比值有增大的趨勢，差異無統(tǒng)計學(xué)意義；與模型組大鼠相比，貝復(fù)濟組、血竭小復(fù)方組（P＜0.05） 及活心方組（P＜0.01）大鼠心肌血管陽性面積比值均增大；各用藥組間比較，活心方組較貝復(fù)濟組心肌血管陽性面積比值增大（P＜0.05），兩中藥組間比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義。見表1。

表1 活心方對心肌梗死大鼠心肌血管密度及其陽性面積比值的影響（， n＝8）

表1 活心方對心肌梗死大鼠心肌血管密度及其陽性面積比值的影響（， n＝8）

注：與假手術(shù)組比較，*P＜0.05；與模型組比較，＃P＜0.05，＃＃P＜0.01；與貝復(fù)濟組比較，ΔP ＜0.05，ΔΔ P ＜0.01；與血竭小復(fù)方組比較，▲P＜0.05。

3.2 各實驗組大鼠血清VEGF 水平比較 與假手術(shù)組大鼠相比，模型組大鼠血清VEGF 水平升高（P＜0.05）；與模型組大鼠相比，活心方組大鼠血清VEGF 水平升高（P＜0.01），其他兩用藥組差異無統(tǒng)計學(xué)意義；各用藥組間比較，活心方組較貝復(fù)濟組血清 VEGF 水平升高（P＜0.05），兩中藥組間比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義。見表2。

表2 活心方對心肌梗死大鼠血清VEGF 水平的影響（，n＝11）

表2 活心方對心肌梗死大鼠血清VEGF 水平的影響（，n＝11）

注：與假手術(shù)組比較，*P＜0.05；與模型組比較，＃＃P＜0.01；與貝復(fù)濟組比較，ΔP＜0.05。

3.3 各實驗組大鼠缺血心肌VEGF、bFGF、Flt-1 及Flk-1表達比較 免疫組化結(jié)果顯示，①與假手術(shù)組大鼠相比，模型組大鼠心肌VEGF（P＜0.05）、bFGF、Flt-1 及Flk-1（P＜0.01） 表達均增加；②與模型組大鼠相比，各用藥組大鼠心肌VEGF、bFGF 表達均增加（P＜0.01），貝復(fù)濟組（P＜0.05） 及活心方組、血竭小復(fù)方組（P＜0.01） 大鼠心肌Flt-1 表達增加，活心方組大鼠心肌Flk-1 表達增加（P＜0.01）。③各用藥組間比較，活心方組心肌VEGF 表達較貝復(fù)濟組（P＜0.01） 及血竭小復(fù)方組（P＜0.05） 增加，活心方組心肌bFGF 表達較貝復(fù)濟組及血竭小復(fù)方組均增加（P＜0.01），活心方組大鼠心肌Flk-1 表達較貝復(fù)濟組及血竭小復(fù)方組大鼠增加（P＜0.05）。見表3。

4 討論

現(xiàn)今對于冠心病的治療中，冠狀動脈血運重建使許多患者的臨床癥狀得以改善，高?；颊叩纳媛实玫教岣?。但是，一些冠狀動脈彌漫性病變的患者卻因種種原因而無法進行血運重建治療，部分患者則面臨術(shù)后再狹窄或晚期血栓等諸多問題。治療性血管新生成為一種潛在的替代療法，即通過刺激缺血心肌小血管生長和側(cè)支循環(huán)的形成，實現(xiàn)心肌缺血區(qū)的自我搭橋，這無論對急性心肌梗死患者還是對相當(dāng)數(shù)量的彌漫性冠脈病變、無條件接受傳統(tǒng)血運重建治療的患者來說，都是一種極具吸引力和有前途的治療模式［6-7］。本研究通過結(jié)扎冠狀動脈前降支的方法構(gòu)建大鼠急性心梗模型，觀察活心方干預(yù)對梗死邊緣區(qū)缺血心肌血管新生等的影響。已知，貝復(fù)濟能促進血管新生，可增加側(cè)支循環(huán)的建立，肝素能提高其活力［8-9］，故將貝復(fù)濟選作本研究的陽性對照藥物。

表3 活心方對心肌梗死大鼠心肌VEGF、bFGF、Flt-1 及Flk-1 表達的影響（， n＝8）

表3 活心方對心肌梗死大鼠心肌VEGF、bFGF、Flt-1 及Flk-1 表達的影響（， n＝8）

注：與假手術(shù)組比較，*P＜0.05，**P＜0.01；與模型組比較，＃P＜0.05，＃＃P＜0.01；與貝復(fù)濟組比較，ΔP＜0.05，ΔΔP＜0.01；與血竭小復(fù)方組比較，▲P＜0.05，▲▲P＜0.01。

4.1 活心方對缺血心肌血管密度及其陽性面積比值的影響 正常成年大鼠很少見到心肌毛細血管的生長，但當(dāng)心肌缺血缺氧時，冠脈新生血管形成，側(cè)支循環(huán)建立，以提高心肌組織灌注，保證缺血心肌血供，維持心臟功能。本研究觀察到模型組大鼠心肌血管密度較假手術(shù)組增加，提示心梗大鼠存在缺血心肌血管新生。心肌血管密度及其陽性面積比值均能較客觀地反映缺血心肌中毛細血管的數(shù)量和面積，是缺血心肌血管新生情況直接、可靠的觀察指標［10］。CD34 在早期和成熟的血管內(nèi)皮細胞上表達，是一種強大的泛內(nèi)皮細胞標記物［11］，故本研究通過檢測缺血心肌血管內(nèi)皮細胞CD34 表達情況，計算心肌血管密度及其陽性面積比值，以反映大鼠缺血心肌血管新生情況。

本研究結(jié)果顯示，活心方及血竭小復(fù)方干預(yù)均能不同程度地提高模型鼠缺血心肌血管密度及其陽性面積比值，且以活心方的作用優(yōu)于貝復(fù)濟，提示活心方和血竭小復(fù)方均能促進缺血心肌血管新生，改善心肌血流灌注；進一步拆方研究發(fā)現(xiàn)，在增加缺血心肌血管密度方面，活心方較血竭小復(fù)方作用更為顯著。

4.2 活心方對心梗大鼠血清、心肌VEGF 水平及其受體和bFGF 表達的影響 心肌缺血缺氧是引起心肌血管新生的主要因素，該過程中涉及到諸多細胞生長因子，其中以VEGF 和bFGF 最為重要，起著核心作用。VEGF 為內(nèi)皮細胞特異性的促有絲分裂因子，可以誘導(dǎo)內(nèi)皮細胞增殖、遷移，并抑制其凋亡，在調(diào)節(jié)血管和淋巴管新生中起重要作用。通過作用于相應(yīng)的受體，VEGF 高度特異地誘導(dǎo)血管內(nèi)皮細胞的有絲分裂，直接刺激血管生成；此外，VEGF可使微血管的通透性增加，導(dǎo)致血漿蛋白等漏出，進入細胞外基質(zhì)，纖維蛋白成分在血管外凝結(jié)，為血管內(nèi)皮細胞的增殖、遷移及新血管形成提供基質(zhì)支架［12-13］。目前已知VEGF 有3 種特異性絡(luò)氨酸激酶受體：Flt-1、Flk-1 及Flt-4。其中Flt-1、Flk-1 表達于血管內(nèi)皮細胞（Flt-4 表達于淋巴管內(nèi)皮細胞），故VEGF 通過作用于Flt-1 及Flk-1 而發(fā)揮促血管新生作用，而Flk-1 更是VEGF 促有絲分裂、促血管新生和滲透性改變的主要受體，對VEGF 生物活性的發(fā)揮起著至關(guān)重要的作用［14-15］。bFGF 是強效內(nèi)皮細胞有絲分裂原，bFGF 和VEGF 在促進血管新生中存在著明顯的協(xié)同作用，對促血管內(nèi)皮細胞增殖和遷移、促蛋白激酶釋放以降解基底膜及促內(nèi)皮細胞形成管腔等起著重要作用［16］。

本研究觀察到模型組大鼠存在缺血心肌VEGF、bFGF、Flt-1 及Flk-1 表達增加及血清VEGF 水平升高，提示心梗后大鼠由于心肌缺血缺氧，導(dǎo)致血管新生相關(guān)因子及其受體表達增加，從而促進缺血心肌血管新生?；钚姆礁深A(yù)可使模型鼠缺血心肌VEGF、bFGF、Flk-1 表達增加及血清VEGF 水平升高，且優(yōu)于貝復(fù)濟及血竭小復(fù)方；對心肌Flt-1 表達的影響在三種干預(yù)藥物顯示了類似的作用，而兩中藥組顯示了更好的趨勢。結(jié)果說明本研究干預(yù)藥物可能通過促進缺血心肌VEGF、bFGF、Flt-1 及Flk-1 的表達，并提高血清VEGF 水平，促進缺血心肌的血管新生，以恢復(fù)缺血心肌血液供應(yīng)，拯救瀕臨凋亡的心肌細胞，從而減少梗死面積，改善心功能。其中以活心方作用更為顯著。

冠心病心絞痛屬于祖國醫(yī)學(xué)之“胸痹” 范疇，其病機屬本虛標實，本虛為陰陽氣血的虧虛，以氣虛陽虛者為多見；標實為痰濁、血瘀、寒凝、氣滯交互為患?；钚姆綖槿珖嗅t(yī)嚴世蕓教授治療冠心病心絞痛的經(jīng)驗方，該方以生黃芪、桂枝、象貝母等益氣通陽、化痰軟堅，三七、血竭、降香等活血化瘀止痛，用以治療冠心病心絞痛有著良好的臨床療效。本研究證實了活心方干預(yù)急性心梗大鼠能顯著提高其梗死邊緣區(qū)缺血心肌血管密度及其陽性面積比值，其藥效作用可能與增加缺血心肌VEGF 及其受體和bFGF 表達，并升高血清VEGF 水平有關(guān)。研究結(jié)果顯示兼有益氣活血、化痰軟堅功效的活心方較單純活血化瘀的血竭小復(fù)方有著更強的促血管新生作用，表明益氣活血、化痰軟堅的治則更符合冠心病本虛標實病機，可以帶來更好的臨床療效。