楊 帥 哈立洋 李阿溶 尹可歡 顧 健

（西南民族大學 藥學院， 四川 成都610041）

美洲大蠊Periplaneta Americana L.俗名蟑螂，屬蜚蠊科［1］。作為藥物使用歷史悠久，最早期記載于《神農(nóng)本草經(jīng)》，其性寒，味咸、有辛辣味，小毒，具有散瘀、消積、解毒等功效?，F(xiàn)代藥理研究顯示，美洲大蠊具有抗腫瘤、改善血液循環(huán)、促進組織修復、增強免疫、保護肝臟功能等作用［2-4］。利用美洲大蠊的不同提取物，建立急性免疫性肝損傷小鼠模型，表明美洲大蠊能夠有效治療肝損傷，課題組前期實驗結(jié)果表明，美洲大蠊75%乙醇提取物對刀豆蛋白A 誘導的急性免疫性肝損傷有一定的保護作用，但其用藥劑量及調(diào)節(jié)淋巴細胞作用尚不明確，因此本實驗通過對比美洲大蠊醇提物高、中、低3個劑量對刀豆蛋白A 誘導的急性免疫性肝損傷的保護作用，探究用藥劑量對免疫性肝損傷的治療作用，同時研究3個劑量組對T 淋巴細胞中CD4、CD8 細胞亞群的調(diào)節(jié)作用。

1 材料

1.1 動物 SPF 級，雄性KM 小鼠60 只，體質(zhì)量18～25 g，合格證號0042449，生產(chǎn)許可證號SCXK（川） 2015-030，購自成都達碩實驗動物有限公司，室溫（23±2）℃，濕度50%～60%。SPF 級動物房適應性飼養(yǎng)1 周。

1.2 藥物與試劑 美洲大蠊（四川好醫(yī)生藥業(yè)提供，批號ML-20170327），經(jīng)西南民族大學藥學院顧健教授鑒定為正品；刀豆蛋白A（美國Sigma 公司，批號ab15323）；聯(lián)苯雙酯（萬邦德制藥集團股份有限公司，批號A0-2j171108）；AST 檢測試劑盒（南京建成生物工程研究所，批號20180828）；ALT 檢測試劑盒（南京建成生物工程研究所，批號20180825）；MDA 檢測試劑盒（南京建成生物工程研究所，批號20180827）；SOD 檢測試劑盒（南京建成生物工程研究所，批號20180827）；無水乙醇（AR 級，規(guī)格2.5 L／桶，批號GB678-90，江蘇海興化工有限公司）。

1.3 儀器 全自動生化分析儀（江西特康科技有限公司）；722 可見分光光度計（上海佑科儀器儀表有限公司生產(chǎn)）；全自動封閉式組織脫水機（常州市中威電子儀器有限公司）；病理組織漂烘儀（常州市中威電子儀器有限公司）；數(shù)碼三目攝像顯微鏡（麥克奧迪實業(yè)集團有限公司）；超聲波細胞粉碎機（寧波新芝生物科技股份有限公司）；熒光定量PCR 儀（美國應用生物系統(tǒng)公司）。

2 方法

2.1 藥物制備 將蟲體研磨成粉，干燥通風保存。取干燥蟲粉500 g，加入5 倍量體積的石油醚，超聲脫脂2 次，30 min／次，蒸發(fā)干燥，加入15 倍量體積的75% 乙醇，超聲提取3 次，30 min／次，提取液合并濃縮干燥即得美洲大蠊醇提物，冷藏保存，現(xiàn)用現(xiàn)配。

2.2 造模及給藥 將60 只小鼠隨機分為6組，空白組、模型組、聯(lián)苯雙酯組（200 mg／kg） 及美洲大蠊醇提物高、中、低劑量組（90、60、30 mg／kg），每組10 只。張鵬［5］、甘 平［6］、石林琳［7］等研究美洲 大蠊醇提物 為100、200 mg／kg，因此為探究更適宜給藥濃度，本次實驗醇提物組設置低于上述濃度的高中低3個劑量組（90、60、30 mg／kg），為后續(xù)綜合各梯度濃度探究更準確的量效關系提供實驗依據(jù)?？瞻捉M和模型組給予同體積的純凈水灌胃，其他各組小鼠按照對應給藥劑量灌胃給藥，1 次／d，連續(xù)給藥7 d；末次給藥2 h 后，除空白組外，各組小鼠均尾靜脈注射20 mg／kg 刀豆蛋白A 進行造模。造模結(jié)束的各組小鼠，均禁食不禁水，10 h 后，稱定小鼠體質(zhì)量。

2.3 血清ALT、AST 水平及肝脾指數(shù)的測定 造模10 h 后麻醉，眼球取血，分離血清。檢測ALT、AST 水平。頸椎脫臼處死小鼠，取肝臟、脾臟稱定質(zhì)量，肝臟系數(shù)＝（肝臟質(zhì)量／體質(zhì)量） ×100%，脾臟系數(shù)＝（脾臟質(zhì)量／體質(zhì)量） ×100%。

2.4 肝臟組織中MDA、SOD 水平測定 造模10 h 后麻醉，小鼠脫頸處理，剪取部分肝臟組織，冰浴中用生理鹽水制成10%肝勻漿，離心，取上清液檢測SOD、MDA 水平。

2.5 HE 染色觀察肝臟組織病理 取肝左葉同一部位組織，中性甲醛固定，常規(guī)制備切片，HE 染色，光鏡下觀察拍照。小葉增生（＜5%、5%～33%、33%～67%、＞67%） 分別記為0、1、2、3 分數(shù)；炎癥浸潤（無病灶、＜2個病灶／視野、2～4個病灶／視野、＞4個病灶／視野） 分別記為0、1、2、3 分數(shù)；點狀壞死（無、少見、多見） 分別記為0、1、2 分數(shù)。

2.6 免疫組化檢測淋巴細胞CD4、CD8 取肝臟組織，進行石蠟切片微波修復抗原染色與熱抗原修復，使用DAB 顯色，最后完成圖像采集。

2.7 統(tǒng)計學分析 應用SPSS 18.0 軟件進行分析，血清及肝組織的檢測數(shù)據(jù)計量資料以（） 表示，符合正態(tài)分布且方差齊性資料采用獨立樣本t檢驗；病理學分級評分等級資料采用Ridit 檢驗。以P≤＜0.05 表示差異有統(tǒng)計學意義。

3 結(jié)果

3.1 美洲大蠊醇提物對刀豆蛋白A 致急性免疫性肝損傷小鼠肝、脾系數(shù)的影響 與空白組比較，刀豆蛋白A 致急性肝損傷模型組小鼠肝、脾系數(shù)升高，肝脾腫大；與模型組比較，美洲大蠊醇提物組、聯(lián)苯雙酯組均能降低肝、脾系數(shù)（P＜0.05，P＜0.01），改善肝脾組織腫脹程度，見表1。

3.2 美洲大蠊醇提物對小鼠血清ALT、AST 水平的影響 與空白組相比，刀豆蛋白A 致急性肝損傷模型組小鼠血清ALT、AST 水平上升；與模型組比較，美洲大蠊醇提物均能降低ALT、AST 水平（P＜0.05，P＜0.01），見表2。

表1 美洲大蠊醇提物對刀豆蛋白A 致急性肝損傷小鼠臟器系數(shù)的影響（， n＝10）

表1 美洲大蠊醇提物對刀豆蛋白A 致急性肝損傷小鼠臟器系數(shù)的影響（， n＝10）

注：與模型組比較，*P＜0.05，**P＜0.01。

表2 美洲大蠊醇提物對刀豆蛋白A 致急性肝損傷小鼠血清AST、ALT 水平影響（， n＝10）

表2 美洲大蠊醇提物對刀豆蛋白A 致急性肝損傷小鼠血清AST、ALT 水平影響（， n＝10）

注：與模型組比較，*P＜0.05，**P＜0.01。

3.3 美洲大蠊醇提物對刀豆蛋白A 致急性肝損傷小鼠肝組織SOD、MDA 水平的影響 與空白組相比，刀豆蛋白A致急性肝損傷模型組小鼠肝組織MDA 水平明顯上升，肝組織SOD 水平下降（P＜0.01）；美洲大蠊醇提物高、中劑量組可升高肝組織SOD 水平，降低MDA 水平（P＜0.05，P＜0.01），見表3。

表3 美洲大蠊醇提物對刀豆蛋白A 致急性肝損傷小鼠肝組織SOD、MDA 水平影響（， n＝10）

表3 美洲大蠊醇提物對刀豆蛋白A 致急性肝損傷小鼠肝組織SOD、MDA 水平影響（， n＝10）

注：與模型組比較，*P＜0.05，**P＜0.01。

3.4 美洲大蠊醇提物對刀豆蛋白A 致急性肝損傷小鼠肝臟組織損傷的影響 正常組肝臟被膜及門管區(qū)完整，肝細胞分葉明顯，形態(tài)正常，未見病理變化；模型組肝臟被膜完整，肝細胞分葉不明顯，肝索排列較為紊亂，肝細胞片狀壞死、出血，肝細胞胞質(zhì)出現(xiàn)大量空泡變性，有少量肝細胞空泡變性，伴少量炎性細胞；給藥組被膜及門管區(qū)完整，肝細胞壞死、出血情況得到改善，空泡變性減輕，炎細胞浸潤得到改善。見圖1、表4。

圖1 各組肝組織病理切片圖（HE，×400）

表4 各組肝組織病理分級（n＝10）

3.5 美洲大蠊醇提物對刀豆蛋白A 致急性肝損傷小鼠肝組織淋巴細胞CD4、CD8 的影響 模型組小鼠肝組織CD4、CD8 的陽性細胞IOD 呈上升趨勢，尤其是CD8 陽性細胞的上升幅度更大；與模型組比較，美洲大蠊醇提物清晰可見CD4、CD8 的陽性細胞IOD 下降（P＜0.01），說明美洲大蠊醇提物治療刀豆蛋白A 誘導的免疫性肝損傷機制，可能是通過調(diào)節(jié)CD4、CD8 的陽性細胞數(shù)量，改善免疫功能紊亂，從而保護肝臟。見表5、圖2～3。

4 討論

肝損傷是臨床上的常見病，各種物理和化學因素均可導致急、慢性肝損傷。肝損傷后，固有的免疫細胞分泌促纖維化因子，如TGF-β、血小板來源生長因子（PDGF）、IL-13 和IL-4 等，導致肝纖維化，并逐漸發(fā)展成肝小葉結(jié)構(gòu)的破壞及結(jié)節(jié)形成，最終演變成肝硬化或肝癌。因此，控制或逆轉(zhuǎn)肝損傷具有重要意義。實驗依據(jù)操作簡便，具有肝臟特異性等特點［8-9］，所測指標模型組與空白組比較均有顯著性差異，說明造模成功。

表5 美洲大蠊醇提物對刀豆蛋白A 致急性肝損傷小鼠T 淋巴細胞亞群的影響（， n＝10）

表5 美洲大蠊醇提物對刀豆蛋白A 致急性肝損傷小鼠T 淋巴細胞亞群的影響（， n＝10）

注：與模型組比較，**P＜0.01。

圖2 CD4 的免疫組化圖（IHC，×100）

圖3 CD8 的免疫組化圖（IHC，×100）

血清AST、ALT 可以反映肝細胞受損程度以及線粒體損傷的情況，根據(jù)肝組織中MDA、SOD 水平變化，能夠推測出機體細胞受氧自由基攻擊以及減少細胞和組織損傷的程度［9-11］。美洲大蠊醇提物調(diào)節(jié)T 淋巴細胞方面，尚無相關報道，機體維持正常的免疫功能狀態(tài)有賴于T 淋巴細胞亞群維持一定的比例，因此本次實驗探究美洲大蠊醇提物對T 淋巴細胞亞群的調(diào)節(jié)作用。與空白組比較，模型組CD4 和CD8 細胞亞群的數(shù)量上升，CD8 細胞亞群趨勢更為顯著，強陽性細胞數(shù)目增多；與模型組比較，美洲大蠊醇提物下調(diào)CD4 和CD8 細胞亞群的數(shù)量，改善細胞陽性程度，調(diào)節(jié)T 淋巴細胞亞群，使其達到一個相互平衡的狀態(tài)，減輕對肝細胞的毒性，改善免疫功能紊亂，阻斷肝損傷從急性向慢性的進一步發(fā)展。

本研究顯示，美洲大蠊醇提物均可以不同程度的降低肝脾系數(shù)和血清ALT、AST 水平，降低肝臟組織中的MDA水平，升高SOD 水平，美洲大蠊醇提物高劑量組效果優(yōu)于醇提物中劑量組及醇提物低劑量組，美洲大蠊醇提物能抑制肝臟和脾臟的免疫反應，減輕肝臟細胞損傷，以及抗脂質(zhì)過氧化反應和清除肝內(nèi)自由基。同時，美洲大蠊醇提物調(diào)節(jié)T 淋巴細胞亞群，使其達到一個相互平衡的狀態(tài)，減輕對肝細胞的毒性，改善免疫功能紊亂，抑制急性免疫性肝損傷向慢性免疫性肝損傷的進一步發(fā)展，從而保護肝臟。