梁志毅 黃貴發(fā) 崔 婷 張 正 孫冬梅

（廣東一方制藥有限公司， 廣東省中藥配方顆粒企業(yè)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室， 廣東 佛山528244）

狗脊為蚌殼蕨科植物金毛狗脊Cibotium baronetz（L.） J.sm.干燥根莖，主要分布于浙江、江西、福建等地［1］。狗脊炮制方法歷史悠久，始見于《雷公炮炙論》：“細(xì)剉了，酒拌蒸”，自古以來其炮制品有砂燙狗脊、蒸狗脊、酒狗脊、鹽狗脊等。2015 年版《中國藥典》 收載了狗脊及燙狗脊2個炮制品種。燙狗脊為生狗脊片經(jīng)砂燙法，燙至鼓起，除去殘存絨毛，即得［2］。狗脊經(jīng)砂燙后質(zhì)地變得疏松，便于粉碎和煎出有效成分。狗脊具有補(bǔ)肝腎、強(qiáng)筋骨、舒經(jīng)絡(luò)、除濕痛的功效，經(jīng)砂燙炮制后，其補(bǔ)肝腎作用增強(qiáng)［3］。狗脊砂燙后，外觀性狀上表現(xiàn)為顏色明顯加深，同時原兒茶酸、5-羥甲基糠醛的含有量均有不同程度的升高，5-羥甲基糠醛有很好的抗氧化及保護(hù)心血管等作用［4］。據(jù)文獻(xiàn)報道，狗脊在燙制過程中發(fā)生了明顯的美拉德反應(yīng)，炮制過程中γ-吡喃酮和糠醛類成分增加的同時，糖和氨基酸類成分也有明顯的變化。狗脊的炮制過程，隨著化學(xué)成分的變化，其性、味均發(fā)生了相應(yīng)變化［5］。傳統(tǒng)對砂燙狗脊的性狀描述為“燙至表面略鼓起、棕褐色”，這存在較大的主觀性和不精確性，不利于飲片的質(zhì)量控制。

隨著中藥炮制技術(shù)的發(fā)展，新的技術(shù)不斷應(yīng)用于中藥炮制領(lǐng)域。微波的基本性質(zhì)通常呈現(xiàn)為穿透、反射、吸收，具有能量集中、穿透力強(qiáng)、選擇性高、加熱效率高等特點(diǎn)，可對非金屬物質(zhì)進(jìn)行加熱、干燥、脫水、滅菌、消毒，同時具有節(jié)能、省時、方便、衛(wèi)生等優(yōu)點(diǎn)［6］。近年來微波技術(shù)在中藥炮制中的應(yīng)用發(fā)展迅速，有研究者利用微波技術(shù)對雷公藤、莪術(shù)、山楂等多種中藥飲片炮制進(jìn)行了研究，結(jié)果顯示微波炮制品中化學(xué)成分的種類、含有量以及性狀上的變化與傳統(tǒng)炒制品接近［7-10］，且大大縮短了炮制時間，符合現(xiàn)代中藥加工節(jié)能高效的要求。

本研究以色度值L，a，b 量化狗脊炮制品粉末顏色，討論微波炮制過程中2 種指標(biāo)成分含有量與粉末顏色變化的關(guān)聯(lián)性，以期為狗脊微波炮制過程的監(jiān)測及炮制品的質(zhì)量評價提供依據(jù)。

1 材料

Waters e2695 高效液相色譜儀（美國Waters 公司）；KQ-500DE 數(shù)控超聲機(jī)清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）；ME204E 分析天平（萬分之一，瑞士Mettler Toledo 公司）；Sartorius-CP225D 分析天平（十萬分之一，上海精密科學(xué)儀器有限公司）；AR852B＋型紅外測溫儀（東莞萬創(chuàng)電子制品有限公司）；EG823MF3-NW 微波爐（美的集團(tuán)有限公司）；XDW-C260S 不銹鋼破碎機(jī)（濟(jì)南達(dá)微機(jī)械有限公司）；CANON EOS 77D 照相機(jī)（日本佳能株式會社）。

對照品原兒茶酸（批號110809-200604）、5-羥甲基糠醛（批號111626-201711） 均購自中國食品藥品檢定研究院。

狗脊藥材采自湖南湘西龍山冼洛鄉(xiāng)，經(jīng)廣東一方制藥有限公司魏梅主任中藥師鑒定為蚌殼蕨科植物金毛狗脊Cibotium baronetz（L.） J.sm.的干燥根莖。

2 方法與結(jié)果

2.1 狗脊炮制品制備

2.1.1 傳統(tǒng)砂燙炮制 根據(jù)2015 年版《中國藥典》 中方法，取生狗脊片，照砂燙法操作，將潔凈河砂置炒制容器內(nèi)，用武火加熱至滑利狀態(tài)時（紅外測溫儀測定溫度為200℃），投入生狗脊片，不斷翻動，砂燙至表面鼓起、顏色為棕褐色時，取出，篩去河砂，放涼，除去殘存絨毛。

2.1.2 微波炮制 取大小、厚薄均勻的狗脊飲片，適當(dāng)破碎，過3.0 cm 篩網(wǎng)。選取大小相同的狗脊碎塊，共15 份，每份約50 g，置于托盤內(nèi)，于500 W（中高火） 功率下進(jìn)行微波炮制，炮制時間分別 為2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28 min，同時采用紅外測溫儀測定樣品取出時的溫度。

2.2 含有量測定

2.2.1 色譜條件 安捷倫ZORBAX SB-C18色譜柱（4.6 mm×150 mm，5 μm）；流動相乙腈-1% 冰醋酸溶液（5∶95）；體積流量0.8 mL／min；柱溫30℃；檢測波長260 nm；進(jìn)樣量10 μL。理論塔板數(shù)按原兒茶酸計(jì)算，不低于3 000，色譜圖見圖1。

2.2.2 對照品溶液制備 取原兒茶酸對照品和5-羥甲基糠醛對照品適量，精密稱定，加甲醇-1%冰醋酸溶液（70∶30） 制成每1 mL 含100 μg 原兒茶酸、30 μg 5-羥甲基糠醛的混合對照品溶液。

2.2.3 供試品溶液制備 取藥材粉末（過3 號篩） 1 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入甲醇-1%冰醋酸溶液（70∶30） 25 mL，稱定質(zhì)量，超聲（250 W，40 kHz） 處理30 min，放冷，再稱定質(zhì)量，用甲醇-1%冰醋酸溶液（70∶30） 補(bǔ)足減失的質(zhì)量，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即得。

2.2.4 線性關(guān)系考察 分別精密量取“2.2.2”項(xiàng)下混合對照品溶液1、2、4、6、8、10 mL，置于10 mL 量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，分別吸取上述混合對照品溶液各10 μL，在“2.2.1” 項(xiàng)色譜條件下測定。以各成分峰面積為縱坐標(biāo)（Y），質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)（X） 進(jìn)行回歸，結(jié)果見表1，可知各成分在各自范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

表1 各成分線性關(guān)系Tab.1 Linear relationships of various constituents

2.2.5 精密度試驗(yàn) 分別精密吸取上述原兒茶酸和5-羥甲基糠醛混合對照品溶液10 μL，在“2.2.1” 項(xiàng)色譜條件下連續(xù)進(jìn)樣5 次，得原兒茶酸和5-羥甲基糠醛對照品溶液峰面積RSD 分別為0.178%、0.230%，表明儀器精密度良好。

2.2.6 穩(wěn)定性試驗(yàn)取燙狗脊粉末1 g，按“2.2.3” 項(xiàng)下方法制備供試品溶液。精密吸取供試品溶液10 μL，在“2.2.1” 項(xiàng)色譜條件下，分別于0、6、12、18、24、30、36 h 進(jìn)樣，得原兒茶酸和5-羥甲基糠醛含有量RSD 分別為0.343%、0.669%，表明供試品溶液在36 h 內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.2.7 重復(fù)性試驗(yàn) 取同一批號燙狗脊藥材，按“2.2.3” 項(xiàng)下方法平行制備供試品溶液6 份，在“2.2.1” 項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣，測得原兒茶酸和5-羥甲基糠醛的含有量 RSD 分別為 1.89%、1.61%，表明該方法重復(fù)性良好。

圖1 各成分HPLC 色譜圖Fig.1 HPLC chromatograms of various constituents

2.3 炮制品粉末色度值測定

2.3.1 色度值采集方法 取狗脊不同炮制品，粉碎，95%以上過4 號篩，無法過篩粉末與已過篩粉末混合。以國際照明委員會認(rèn)可的D65 光源作為光源［11］，白色作為背景，對炮制飲片粉末圖像進(jìn)行采集。

2.3.2 精密度試驗(yàn) 取同一燙狗脊飲片粉末，按“2.3.1” 項(xiàng)下方法測定，連續(xù)測量顏色6 次，結(jié)果測得值的RSD 為3.51%，表明該方法精密度良好。

2.3.3 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取同一燙狗脊飲片粉末，按“2.3.1” 項(xiàng)下方法測定，分別于1、4、6、8、12 h 測量其色度值，結(jié)果顯示測得值的RSD 為3.25%，表明供試品溶液在12 h 內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.3.4 重復(fù)性試驗(yàn) 按“2.3.1” 項(xiàng)下方法測定，分別制備6 份狗脊粉末，測量其色度值，結(jié)果顯示測得的RSD 為3.91%，表明該方法重復(fù)性良好。

2.4 樣品含有量測定 取狗脊不同炮制品粉末，以國際照明委員會認(rèn)可的D65 光源作為光源，白色作為背景，對炮制飲片粉末圖像進(jìn)行采集，采用Adobe Photoshop 6.0 軟件讀取飲片粉末的色度值（L、a、b），平行測定3 次，取平均值，測定結(jié)果見表2。

表2 狗脊微波炮制過程中指標(biāo)成分含有量及粉末色度值變化Tab.2 Changes of index composition content and powder color quantification value during microwave processing of C.baronetz

圖2 顯示，隨著微波炮制時間的延長，溫度逐漸升高，炮制4～16 min 過程中原兒茶酸的含有量逐漸升高，16 min 之后開始下降，可能由于原兒茶酸在炮制過程中存在雙向轉(zhuǎn)化：生品中原兒茶酸-3-O-糖苷受熱分解為原兒茶酸和糖，同時原兒茶酸受熱又分解為其他物質(zhì)［12-13］。

圖2 各成分隨溫度的變化Fig.2 Variation of various constituents with temperature

炮制4～8 min 過程中，溫度升高明顯，原兒茶酸的生成速率大于原兒茶酸分解速率，原兒茶酸含有量上升；炮制8～16 min 過程中，溫度變化較小，原兒茶酸的生成與分解逐漸達(dá)到動態(tài)平衡，此時原兒茶酸含有量最高；炮制16～24 min 過程中，燙狗脊表面鼓起裂開，游離水分減少，溫度迅速升高，原兒茶酸的生成速率小于原兒茶酸分解速率，原兒茶酸含有量下降。

燙狗脊中5-羥甲基糠醛是由果糖脫水而成［14］，而5-羥甲基糠醛具有一定的揮發(fā)性，炮制前期，生成速率大于揮發(fā)速率，含有量上升；14 min 后，隨著溫度升高，揮發(fā)速率大于生成速率，含有量下降。炮制過程中化學(xué)成分變化見表3。

結(jié)果表明狗脊微波炮制品在6～16 min 之內(nèi)表面鼓起或輕微裂開、外觀顏色呈淺棕褐色或棕褐色，原兒茶酸含有量不低于0.2 mg／g，飲片的性狀變化，指標(biāo)成分含有量均符合藥典要求，且與傳統(tǒng)砂燙制品接近。

表3 狗脊炮制過程中化學(xué)成分變化Tab.3 Change of chemical constituents in the processing of C.baronetz

2.5 關(guān)聯(lián)性分析 微波炮制過程中，燙狗脊表面微鼓起、棕褐色、產(chǎn)生刺激性氣味等現(xiàn)象與傳統(tǒng)砂燙炮制過程基本一致。隨著炮制時間延長，溫度逐漸升高，在6 min 時溫度達(dá)到151℃，開始出現(xiàn)狗脊炮制過程中特有的刺激性氣味；在10 min 時溫度達(dá)到197℃，金色絨毛開始脫落并出現(xiàn)灰色煙霧，隨著時間延長逐漸濃烈，此時微波爐內(nèi)壁有黑褐色附著物。由于狗脊含揮發(fā)油成分較高［15］，刺激性氣味可能是揮發(fā)油成分揮發(fā)產(chǎn)生，而黑褐色附著物則可能是狗脊絨毛焦屑隨揮發(fā)油成分揮發(fā)而成。

由于微波炮制16 min 后，燙狗脊表面鼓起裂開，溫度升高，水分減少，內(nèi)部開始灰化，且隨微波時間的延長，灰化程度逐漸嚴(yán)重，已不滿足炮制品的性狀要求。綜合考慮，選取16 min 內(nèi)的試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。采用SPSS 20.0 軟件分析微波炮制過程中狗脊各指標(biāo)成分含有量與色度值的關(guān)聯(lián)性，以原兒茶酸和5-羥甲基糠醛含有量為自變量（X），L，a和b為因變量（Y），進(jìn)行多元線性回歸，結(jié)果見表4。

表4 含有量與色度值相關(guān)分析Tab.4 Correlation analysis between the content of furfural and chromaticity value

相關(guān)性分析結(jié)果表明，原兒茶酸、5-羥甲基糠醛含有量與色度值a 有較強(qiáng)相關(guān)性（r＞0.8）；原兒茶酸、5-羥甲基糠醛含有量與色度值L 有一定的相關(guān)性（r＞0.7）。因此，色度值可作為狗脊微波炮制過程中監(jiān)測炮制品質(zhì)量評價的依據(jù)。

3 討論

微波炮制的原理是利用高頻電磁波以一定的高頻率振蕩穿透物品，使物品內(nèi)的極性分子被吸引共振，從而相互碰撞產(chǎn)生大量的熱量，并在藥材的內(nèi)外同時發(fā)生發(fā)熱過程，最終達(dá)到炮制的目的，這種新型炮制方法相較傳統(tǒng)砂燙法，具有更加節(jié)能、操作簡單、清潔、勞動強(qiáng)度小等優(yōu)點(diǎn)。研究發(fā)現(xiàn)，整塊狗脊并不適用于微波炮制，大小、薄厚等因素均會嚴(yán)重影響炮制的均勻性，故本研究在微波炮制時選用了先破碎，再篩選大小、薄厚均勻的狗脊碎塊進(jìn)行炮制。

傳統(tǒng)的飲片炮制主要通過操作者眼看、鼻聞、手捻等感官經(jīng)驗(yàn)判斷炮制終點(diǎn)，該方式存在較大的主觀性，易導(dǎo)致批間差異，適用性不高。1976 年，由CIE組織提出的LAB 色度空間理論，使樣品顏色可量化［16］。近年，該理論被引入中藥領(lǐng)域，為中藥飲片的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)提供新的方向。本研究采用照相機(jī)獲取狗脊炮制品的表觀顏色信息，通過Adobe Photoshop 6.0 軟件處理，使狗脊炮制品的外觀顏色量化。通過對炮制樣品進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析發(fā)現(xiàn)，不同時間炮制品間色度值和原兒茶酸、5-羥甲基糠醛含有量間具有一定的關(guān)聯(lián)性，代表明暗的L、代表燙狗脊特征顏色灰褐色的a 與5-羥甲基糠醛含有量均顯著相關(guān)。

有研究表明［17］，狗脊炮制過程中原兒茶酸和5-羥甲基糠醛含有量均先增加后減少，但5-羥甲基糠醛相較于原兒茶酸對溫度更加敏感。炮制過程中5-羥甲基糠醛含有量變化大于原兒茶酸，但目前大多數(shù)文獻(xiàn)和標(biāo)準(zhǔn)中僅以原兒茶酸含有量作為燙狗脊及其炮制品的質(zhì)量評價指標(biāo)。研究表明生脈散中的5-羥甲基糠醛成分具有抗氧化、保護(hù)肝組織、改善血液微循環(huán)等作用，其可能是“益氣生脈” 的物質(zhì)基礎(chǔ)［18］，但《中國藥典》 中，對葡萄糖注射液的質(zhì)量檢測時，5-羥甲基糠醛被當(dāng)作有害物質(zhì)加以限量控制，因此，需結(jié)合藥理學(xué)研究結(jié)果，綜合考量5-羥甲基糠醛的含有量用以評價燙狗脊的質(zhì)量。

本研究以原兒茶酸和5-羥甲基糠醛含有量為評價指標(biāo)，考察狗脊微波炮制過程中指標(biāo)成分含有量與粉末色度值的相關(guān)性，以期為其他中藥飲片的炮制提供參考。