馬雯芳 王美琪 姜建萍 張凱惠 韋明妹 陳 暉

（廣西中醫(yī)藥大學藥學院， 廣西 南寧530001）

中藥的質(zhì)量評價是中藥現(xiàn)代研究的重要部分之一，由于中藥成分體系復雜，單一的質(zhì)量評價方法具有一定的劣勢。中藥譜效學將藥材的化學成分和藥效相聯(lián)系，具有全面性和立體性的優(yōu)勢，是中藥質(zhì)量評價的重要研究方法［1-3］。在中藥譜效學領(lǐng)域，譜效關(guān)系的復雜性使得多元線性回歸等傳統(tǒng)的建模方法無法滿足其不可控的非線性關(guān)系，較難得到理想的預測結(jié)果。人工神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)的黑箱模型對非線性關(guān)系的建模有較大的優(yōu)勢，為譜效模型的建立提供了更加科學準確的方法［4］，可用于反映中藥成分與藥效相關(guān)性中內(nèi)在的、綜合的、多層次的隱含性信息，以模糊的非線性觀點進行比較，可對中藥的內(nèi)在質(zhì)量做出更加真實的評價［5］，已成為中藥質(zhì)量綜合評價研究的熱門技術(shù)［6-7］。

滇桂艾納香為菊科植物假東風草Blumea riparia（Bl.） DC.的干燥全草，又名管牙（壯語）［8］，在廣西民間已有較長的應用歷史。根據(jù)文獻報道，滇桂艾納香毒性低［9］，有較好的止血作用，其70%乙醇提取物有最佳的止血效應［10］，含有原兒茶酸、咖啡酸、芹菜素、木犀草素［11-12］等成分，是發(fā)揮止血作用的物質(zhì)基礎(chǔ)，其通過多種渠道發(fā)揮止血作用，對在體子宮平滑肌的收縮頻率及收縮力有增強作用，與其產(chǎn)后止血的作用有較大聯(lián)系。目前關(guān)于滇桂艾納香藥效物質(zhì)基礎(chǔ)的相關(guān)報道較少，藥材的質(zhì)量評價體系亦較單一。本研究建立不同產(chǎn)地滇桂艾納香70%乙醇提取物的指紋圖譜，同時獲得對應批次藥材的藥效信息，采用BP 人工神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)建立譜效關(guān)系數(shù)學模型，綜合評價滇桂艾納香藥材質(zhì)量，以期為滇桂艾納香藥材及其相關(guān)制劑的標準提高奠定基礎(chǔ)。

1 材料

1.1 實驗動物 健康SD 大鼠，SPF 級，雌性，體質(zhì)量180～220 g，由廣西醫(yī)科大學實驗動物中心提供，實驗動物生產(chǎn)許可證號SCXK（桂） 2009-0002。所有動物于通風、清潔、安靜、溫濕度適宜的環(huán)境下飼養(yǎng)，分籠飼養(yǎng)1 周后使用。

1.2 藥物與試劑 滇桂艾納香藥材信息見表1，由廣西中醫(yī)藥大學中藥鑒定教研室田慧教授鑒定為菊科艾納香屬植物滇桂艾納香Blumea riparia（Bl.）DC.的全草。所有批次藥材均經(jīng)干燥處理后粉碎，過24目篩，備用。

表1 樣品信息Tab.1 Information of samples

對照品綠原酸（批號110753-201716）、蘆丁（批號100080-201409）、原兒茶酸（批號110809-201205）、咖啡酸（批號110885-200102） 均購自中國食品藥品檢定研究院；甲醇、乙腈為色譜純（美國Fisher 公司）；華法林鈉（俄羅斯Orion 集團公司）；云南白藥（云南白藥集團股份有限公司）。水合氯醛（國藥集團化學試劑有限公司）；含枸櫞酸采血管（山東奧塞特醫(yī)療器械有限公司）；95%乙醇為食用級；其他試劑為分析純；水為超純水。

1.3 儀器 Agilent 1260 高效液相色譜儀（高壓四元泵，在線真空脫氣機，標準自動進樣器，智能化柱溫箱，DAD 檢測器）、Agilent 1260 series 色譜工作站（美國安捷倫科技公司）；TGL-16B 高速臺式離心機（上海安亭科學儀器廠）；BP211D 電子分析天平（德國賽多利斯公司）；DP5 系列超純水儀（法國密里博公司）；Sysmex AC1500 全自動血凝儀（日本東亞儀器有限公司）。

2 方法與結(jié)果

2.1 指紋圖譜構(gòu)建

2.1.1 色譜條件 Inertsil ODS-3 色譜柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流動相乙腈（A） -0.2% 磷酸（B），梯度洗脫（0～25 min，10%～15% A；25～40 min，15%～23% A；40～60 min，23%～34% A；60～80 min，34%～80% A）；進樣量10 μL；柱溫25℃；體積流量1.0 mL／min；檢測波長0～8 min，230 nm；9～27 min，326 nm；28～80 min，360 nm。

2.1.2 供試品溶液制備 滇桂艾納香藥材粉碎后過24目篩，取藥材粉末2 g，精密稱定，精密加入70%乙醇20 mL，稱定質(zhì)量，回流提取1 h，放至室溫，再次稱定質(zhì)量，以70% 乙醇補足減失的質(zhì)量，濾過，取續(xù)濾液離心10 min（13 000 r／min），備用。

2.1.3 對照品溶液制備 分別稱取原兒茶酸0.48 mg、綠原酸7.8 mg、咖啡酸0.56 mg、蘆丁1.2 mg 于10 mL 量瓶中，加70% 乙醇至刻度，即得。

2.1.4 指紋圖譜建立 稱取20 批滇桂艾納香藥材粉末，按“2.1.2” 項下方法制備供試品溶液，在“2.1.1” 項色譜條件下分別進樣，記錄色譜圖，利用“中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)（2012版） ” 生成滇桂艾納香藥材指紋圖譜的共有模式并標定共有的特征峰，得到13個共有峰，2 號峰為參照峰S，經(jīng)指認，圖譜中2 號峰為原兒茶酸、3 號峰為綠原酸、5 號峰為咖啡酸、6 號峰為蘆丁。指紋圖譜見圖1，共有模式圖譜見圖2，混合對照品色譜圖見圖3。

圖1 20 批樣品HPLC 指紋圖譜Fig.1 HPLC fingerprints of twenty batches of samples

圖2 滇桂艾納香共有模式指紋圖譜Fig.2 Common pattern fingerprint of Blumea riparia（Bl.） DC.

2.2 止血活性測定

2.2.1 醇提液制備 稱取各批次滇桂艾納香藥材525 g，加入14 倍量70%乙醇，浸泡0.5 h，回流提取1 h 后過濾，藥渣加入10 倍量70%乙醇，回流提取1 h，合并2 次所得提取液，濃縮至733 mL，得到濃度為0.716 g 生藥／mL 的藥液，備用。

圖3 各成分HPLC 色譜圖Fig.3 HPLC chromatograms of various constituents

2.2.2 動物分組與給藥 取體質(zhì)量180～220 g SD大鼠（雌性） 230 只，隨機分為23組，每組10只，分別為空白組、模型組、陽性組、20組滇桂艾納香給藥組?？瞻捉M和模型組灌胃純水（2 mL／100 g）；陽性組灌胃0.067 g／mL 云南白藥藥液（0.677 g 生藥／kg）；滇桂艾納香給藥組灌胃不同批次滇桂艾納香藥液（14.32 g 生藥／kg），每天1 次，連續(xù)7 d。末次給藥2 h 后，除空白組外，各組大鼠灌服華法林藥液（50 mg／kg），造成華法林化模型。

2.2.3 指標檢測 末次給藥后停食，次晨采集指標，大鼠注射10%水合氯醛溶液（350 mg／kg） 麻醉，腹主動脈穿刺取血4.5 mL，注入枸櫞酸鈉抗凝劑比例1∶9的離心管中，混勻，以3 000 r／min離心10 min，分離血漿，于3 h 內(nèi)用全自動血凝儀檢測凝血酶原時間（PT）、活化部分凝血活酶時間（APTT）、凝血酶時間（TT），對比模型組與給藥組的指標變化情況，考察滇桂艾納香對華法林化大鼠PT、APTT、TT 變化的影響，結(jié)果見表2。

表2 不同產(chǎn)地樣品對華法林化大鼠凝血功能的影響（， n＝10）Tab.2 Effects of samples from different growing areas on coagulant activity of warfarin-treated rats（，n＝10）

表2 不同產(chǎn)地樣品對華法林化大鼠凝血功能的影響（， n＝10）Tab.2 Effects of samples from different growing areas on coagulant activity of warfarin-treated rats（，n＝10）

注：與模型組比較，*P ＜0.05，** P ＜0.01；與空白組比較，＃＃P＜0.01。

2.3 灰色關(guān)聯(lián)度分析 將不同產(chǎn)地滇桂艾納香的止血藥效指標（PT、APTT、TT） 作為母序列，將藥材指紋圖譜共有峰峰面積為子序列，輸入MATLAB R2014b 軟件，對兩者的灰色關(guān)聯(lián)度進行分析［13-14］。

根據(jù)研究需要，采用初始值法，以第一列數(shù)據(jù)為參照值，即新數(shù)據(jù)＝原數(shù)據(jù)／參照值，得到無量綱化的數(shù)列。將無量綱化后的結(jié)果按公式Δi（k） ＝︱y（k） -xi（k） ︱計算，得到子序列與母序列的絕對差值，再計算兩極最大差值和最小差值。經(jīng)計算得各序列的兩極最大差值和最小差值。將計算所得各序列極差值帶入公式，其中分辨系數(shù)ρ 取值為0.5，可得到20 批不同產(chǎn)地滇桂艾納香藥材指紋圖譜中13個共有峰與3個止血藥效指標（PT、APTT、PT） 間的關(guān)聯(lián)系數(shù)。將計算所得的關(guān)聯(lián)度系數(shù)帶入公式γi＝（k），k＝1，2，∧，n，計算13個共有峰與3個止血藥效指標結(jié)果之間的關(guān)聯(lián)度，并得到其關(guān)聯(lián)序，對滇桂艾納香藥材指紋圖譜13個共有峰與其止血藥效的關(guān)聯(lián)程度進行評價，篩選用于建立譜效模型的共有峰。結(jié)果見表3。結(jié)果表明，滇桂艾納香指紋圖譜13個共有峰與3個藥效指標的相關(guān)系數(shù)均大于0.740，均與藥效具有較密切的相關(guān)性。

表3 20 批樣品指紋圖譜共有峰與止血藥效指標灰色關(guān)聯(lián)度結(jié)果Tab.3 Results of grey correlation analysis between common peaks in fingerprint and hemostatic effect of twenty batches of samples

2.4 止血作用譜效關(guān)系建立

2.4.1 應用MATLAB 建立譜效關(guān)系模型 研究中共有20組實驗數(shù)據(jù)，每組數(shù)據(jù)包括13個共有峰和3個（PT、APTT、TT） 藥效學數(shù)據(jù)，將數(shù)據(jù)分為2 部分，其中15組為訓練數(shù)據(jù)，5組為驗證數(shù)據(jù)［15］。

采用MATLAB R2014b 軟件，將15 批樣品的共有峰面積作為輸入，3個藥效分別作為輸出，分別建立共有峰-PT 藥效、共有峰-APTT 藥效和共有峰-TT 藥效3個模型。共有峰-PT 藥效和共有峰-APTT 藥效模型采用13×4×1 網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)，共有峰-TT藥效模型采用13×3×1 結(jié)構(gòu)，分別建立譜效關(guān)系模型。隱含層、輸出層分別采用正切S型、線性神經(jīng)元，隱含層轉(zhuǎn)換函數(shù)采用tansig 函數(shù)，輸出層采用purelin 函 數(shù)，學習算法選 擇 learngdm。運 用Function Approximation Network 進行訓練，參數(shù)設(shè)置為訓練次數(shù)200，誤差限0.01，步長0.1。所有模型均采用同樣參數(shù)，將15組數(shù)據(jù)分別輸入各模型進行訓練。采用峰面積和3 項藥效數(shù)據(jù)歸一化后的數(shù)值作為訓練向量，得到訓練結(jié)果。各模型網(wǎng)絡(luò)均可在訓練次數(shù)以內(nèi)達到精度要求，且用時極少，表明已通過標準數(shù)據(jù)訓練得到譜效模型，需通過將測試數(shù)據(jù)與標準數(shù)據(jù)比較對模型進行驗證。

2.4.2 譜效關(guān)系模型的驗證與預測分析 將5 批樣品數(shù)據(jù)中的峰信息輸入所得的神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)模型，對3個藥效學指標的結(jié)果進行預測，并將預測值與實測值進行比較，結(jié)果見表4。結(jié)果顯示，運用神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)模型預測綜合藥效值，其相對誤差的絕對值均小于或等于13.60%，大部分數(shù)值的相對誤差小于7%，表明神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)模型預測具有較高的精度，較好的泛化能力，可用于止血藥效的預測，性能良好。

表4 BP 人工神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)模型對藥效的預測值及預測誤差Tab.4 Prediction value and prediction error of BP artificial neural network model for pharmacodynamics

3 討論

本研究采用整體動物模型，因動物模型是給藥后動物經(jīng)吸收代謝后才發(fā)揮藥效，實驗結(jié)果更接近于人服藥后的藥物體內(nèi)過程，實驗結(jié)果準確度更高，所以項目采用整體動物模型開展相關(guān)藥效實驗。實驗考察了采用華法林造模對大鼠凝血系統(tǒng)的影響，此模型的作用機制主要是影響凝血因子的合成，通過抑制外源性凝血途徑，引起凝血機制障礙導致出血［16］，本實驗選用該模型，觀察華法林對凝血四項的影響，結(jié)果表明，華法林化大鼠的PT、APTT、TT 均得到一定程度的延長，F(xiàn)IB 值同時降低，造模效果較好。

實驗以滇桂艾納香對凝血系統(tǒng)的影響為指標，對其止血效果進行研究。預實驗中考察了滇桂艾納香對華法林化大鼠凝血四項（PT、APTT、TT、FIB） 的影響，結(jié)果表明，所有給藥組PT、APTT、TT 均有不同程度的縮短，與模型組比較有顯著性差異，給藥組大鼠FIB 與模型組比較有升高趨勢，但趨勢較不明顯，結(jié)果差異無統(tǒng)計學意義。綜合各項藥效指標，選擇藥效較顯著的PT、APTT、TT作為藥效學評價指標。

灰色關(guān)聯(lián)分析法在中藥譜效關(guān)系研究中的應用十分廣泛，是解決多指紋峰與藥效直接相關(guān)分析問題的重要方法之一，具有更好的準確性和代表性［17-18］。本研究中，13 號特征峰對藥效的關(guān)聯(lián)度均達到0.9 以上，與藥效作用關(guān)聯(lián)度達到0.8 以上的有8個特征峰，與藥效作用關(guān)聯(lián)度達到0.7 以上的有4個特征峰，特征峰與藥效的相關(guān)系數(shù)均大于0.740。中藥、民族藥是多成分、多靶點協(xié)同發(fā)揮藥效，指紋圖譜建立的13個特征峰，原兒茶酸、綠原酸、咖啡酸、蘆丁以及某些未確定結(jié)構(gòu)的化合物是滇桂艾納香止血活性的基礎(chǔ)，與其止血藥效均呈正相關(guān)，對其發(fā)揮止血作用均有貢獻，與藥效相關(guān)性較為密切。但各成分間的協(xié)同作用對藥效的影響有待開展進一步研究。

研究通過15 批樣品的共有峰和藥效信息的訓練，建立BP 人工神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)譜效模型，模型能利用化學成分信息對相應的藥效進行預測，5 批供試品的APTT、TT 預測結(jié)果相對誤差均小于6.7%，預測值與實際值誤差較小，表明采用人工神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)模型來建立滇桂艾納香止血譜效關(guān)系是可行的。但PT 相對誤差較大，預測的5 批藥材有2 批相對誤差大于10%，分別達到1.60%、13.60%，模型驗證的研究體現(xiàn)出實際值與預測值之間的一定差異，可能是由于樣本量較小，輸入信息量較少，導致不同藥效輸出的預測值準確率有一定的差異，可以通過增大樣本量對模型進行進一步訓練以提高模型的穩(wěn)健性。

在實際應用中，只需要輸入相同條件下獲得的指紋圖譜峰信息，即可通過數(shù)學模型得到預測的藥效結(jié)果，在一定程度上解決了化學成分與藥效斷層的問題，以期對藥材進行更為合理的質(zhì)量評價。