嚴(yán)麗萍 龔千鋒* 溫 柔 李 潮 于 歡* 袁小平

（1.江西中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院， 江西 南昌330004； 2.江西樟樹天齊堂中藥飲片有限公司， 江西 樟樹336000）

夏天無系罌粟科植物伏生紫堇Corydalis decumbens（Thunb.） Pers.的干燥塊莖，別名伏地延胡索、無柄紫堇、土元胡、夏無蹤、一粒金丹［1］，以江西余江產(chǎn)質(zhì)量為佳；具有活血通絡(luò)、行氣止痛的功效［2］；臨床主要用于中風(fēng)偏癱、跌撲損傷、風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、骨神經(jīng)痛、風(fēng)濕麻痹、腰腿疼痛［3］等。夏天無的主要成分為生物堿，包括原阿片堿、鹽酸巴馬汀、延胡索乙素、比枯枯靈堿、四氫藥根堿、紫堇堿等。藥理研究表明，夏天無在心血管、神經(jīng)系統(tǒng)等方面有很好的療效。

傳統(tǒng)中藥材一般具有不同的商品等級，“看貨評級，分檔議價” 是檢測中藥材質(zhì)量的經(jīng)驗方法。但目前市場上絕大多數(shù)藥材以“統(tǒng)貨統(tǒng)價” 進(jìn)行交易。從近5 年樟樹藥材走勢來看，夏天無呈上升趨勢，因此，確定其等級標(biāo)準(zhǔn)對在中藥材流通中發(fā)揮作用。目前，夏天無并無其相關(guān)等級標(biāo)準(zhǔn)，其與延胡索是同科屬系罌粟科紫堇屬，傳統(tǒng)功效及其性狀相似。根據(jù)《標(biāo)準(zhǔn)》 中規(guī)定將延胡索分為2個等級，一等每50 g 45 粒以內(nèi)，二等每50 g 45 粒以外。結(jié)合現(xiàn)有15 批次夏天無大小情況，將夏天無分為3個等級，分別為大選、統(tǒng)貨、小選，劃分依據(jù)為大選每20 g 30 粒內(nèi)，直徑4～7 cm；統(tǒng)貨每20 g 30～60 粒，直徑1～7 cm；小選每20 g 60 粒外，直徑0～1 cm。本研究將夏天無分為大選、統(tǒng)貨、小選，以原阿片堿、鹽酸巴馬汀、延胡索乙素、比枯枯靈堿、四氫藥根堿、紫堇堿6 種生物堿含有量為控制指標(biāo)，結(jié)合指紋圖譜及化學(xué)模式分析對不同等級樣品進(jìn)行比較。

1 材料

1.1 儀器 Waters e2695型高效液相色譜儀（Empower 色譜工作站，美 國Waters 公 司）；AE240 電子分析天平（十萬分之一，梅特勒-托利多儀器上海有限公司）；GZX-9076MBE型電熱鼓風(fēng)干燥箱（上海博迅實業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠）；SHZ-D（Ⅲ） 循環(huán)水式真空泵（鞏義市英峪予華儀器廠）；中藥粉碎機（長沙旭朗粉碎機械有限公司）；5 號標(biāo)準(zhǔn)篩（紹興市上虞張興紗篩廠）；KQ-5200B 超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）；水相和有機相過濾膜（上海市新亞凈化器件廠）。

1.2 試劑與藥物 夏天無藥材分別采自余江縣錦江鎮(zhèn)、馬荃嵩山村、江西都昌、江西湖口縣、上高、鄱陽縣、萬載白良等夏天無種植基地，經(jīng)江西中醫(yī)藥大學(xué)龔千鋒教授鑒定為正品，信息見表1。原阿片堿（批號BCTG-0414）、鹽酸巴馬?。ㄅ朆CTG-0234）、延胡索乙素（批號BCTG-0235）、四氫藥根堿（批號BCTG-0261）、紫堇堿（批號BCTG-0263） 均購于江西本草天工生物技術(shù)有限公司；比枯枯靈堿（批號20056-201611，南昌貝塔生物科技有限公司）；分析純冰醋酸、三乙胺、色譜純乙腈、分析純甲醇（西隴科學(xué)股份有限公司）；水為娃哈哈純凈水。

表1 樣品信息Tab.1 Information of samples

2 方法與結(jié)果

2.1 波長選擇 用UltiMate 3000 DAD 檢測器對原阿片堿、鹽酸巴馬汀、延胡索乙素、比枯枯靈堿、四氫藥根堿、紫堇堿在200～400 nm 波段進(jìn)行掃描，當(dāng)檢測波長為289 nm 時，6 種待測成分均有較大紫外吸收，響應(yīng)高且分離效果良好，故選用289 nm 為檢測波長。

2.2 色譜條件 Diamonsil-C18色譜柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動相乙腈（A） -水溶液（B，每1 000 mL 含三乙胺5 mL，用冰醋酸調(diào)pH ＝9.99），梯度程序洗脫，程序見表2；檢測波長289 nm；體積流量1.0 mL／min；柱溫25℃；進(jìn)樣量10 μL。在此色譜條件下，各成分得到很好的分離，保留時間與對照品一致。色譜圖見圖1。

表2 梯度洗脫程序Tab.2 Gradient elution programs

圖1 各成分HPLC 色譜圖Fig.1 HPLC chromatograms of various constituents

2.3 對照品溶液制備 精密稱取原阿片堿530 μg、鹽酸巴馬汀403 μg、延胡索乙素478 μg、比枯枯靈堿313 μg、四氫藥根堿410 μg、紫堇堿327 μg，置于10 mL 量瓶中，加甲醇定容，配制成質(zhì)量濃度分別為 530、403、478、313、410、327 μg／mL的對照品溶液。

2.4 供試品溶液制備

2.4.1 鮮品前處理 將鮮夏天無用搶水洗凈，后放置在陽光下曬干或陰涼通風(fēng)處陰干，備用。

2.4.2 供試品溶液 稱取夏天無細(xì)粉（過5 號篩），精密稱定1 g，置于具塞錐形瓶中，精密加入50% 甲醇50 mL，稱定質(zhì)量，超聲（200 W、40 kHz）提取30 min，放冷，再稱定質(zhì)量，用50%甲醇溶液補足減失的質(zhì)量，搖勻，過0.22 μm 微孔濾膜，取續(xù)濾液，即得。

2.5 方法學(xué)考察

2.5.1 系統(tǒng)適應(yīng)性試驗 取“2.3” 項下對照品溶液，在“2.2” 項色譜條件下進(jìn)樣，記錄色譜圖，見圖1。

2.5.2 線性關(guān)系考察 精密吸取“2.3” 項下對照品溶液適量至5 mL 量瓶中，甲醇定容，配制不同質(zhì)量濃度的對照品溶液，在“2.2” 項色譜條件下進(jìn)樣10 μL，以峰面積為縱坐標(biāo)（Y），各對照品質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)（X） 進(jìn)行線性回歸，結(jié)果見表3。

2.5.3 精密度試驗 精密稱取同一批次夏天無粉末（S1 統(tǒng)貨） 1 g，按“2.4” 項下方法制備供試品溶液，在“2.2” 項色譜條件下連續(xù)自動進(jìn)樣10 μL，共6 次，記錄色譜圖，以5 號峰（原阿片堿） 的保留時間和峰面積為參照，測得各共有峰的相對峰面積和相對保留時間RSD 均小于3%，表明儀器精密性良好。

表3 各成分線性關(guān)系Tab.3 Linear relationships of various constituents

2.5.4 重復(fù)性試驗 精密稱取同一批號夏天無粉末（S1 統(tǒng)貨） 1 g，6 份，按“2.4” 項下方法制備供試品溶液，在“2.2” 項色譜條件下進(jìn)樣，以5 號峰（原阿片堿） 的保留時間和峰面積為參照，測得各共有峰的相對峰面積和相對保留時間RSD均小于3%，表明該方法重復(fù)性良好。

2.5.5 穩(wěn)定性試驗 取同一批夏天無供試品溶液，分別于室溫條件下放置0、2、4、6、12、24、48 h，在“2.2” 項色譜條件下進(jìn)樣，以5 號峰（原阿片堿） 的保留時間和峰面積為參照，測得各共有峰的相對峰面積和相對保留時間RSD 均小于3%，表明該供試品溶液在48 h 內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.5.6 加樣回收率試驗 精密稱取同一批次已知含有量的夏天無粉末6 份，每份約1.0 g，分別精密加入原阿片堿等6 種對照品，加入量分別為供試品含有量的80%、100%、120%，按“2.4” 項下方法制備供試品溶液，在“2.2” 項色譜條件下進(jìn)樣，記錄各對照品峰面積并計算回收率，結(jié)果顯示原阿片堿、鹽酸巴馬汀、延胡索乙素、比枯枯靈堿、四氫藥根堿、紫堇堿的回收率分別為97.54%、97.85%、97.31%、97.61%、97.78%、98.23%；RSD 分別為1.21%、0.76%、1.26%、1.93%、1.52%、1.24%。

2.5.7 樣品含有量測定 取夏天無樣品，分別按“2.4” 項下方法制備供試品溶液，在“2.2” 項色譜條件下進(jìn)樣，測定原阿片堿等6 種成分的含有量，結(jié)果見表4?？芍?，不同批次不同等級夏天無中6 種生物堿含有量均有差別；同產(chǎn)地不同等級樣品，生物堿含有量也具有差異；直觀分析，原阿片堿、鹽酸巴馬汀、延胡索鹽酸含有量大選和統(tǒng)貨均大于小選；約43% 樣品大選含有量最高，小選最低；此外，小選的比枯枯靈堿含有量幾乎高于其他等級樣品，夏天無等級劃分在質(zhì)量控制和臨床上具有一定的意義。

表4 各成分含有量測定結(jié)果（mg／g）Tab.4 Results of content determination of various constituents（mg／g）

3 結(jié)果與分析

3.1 指紋圖譜建立 取上述14個產(chǎn)地大選、統(tǒng)貨、小選夏天無粉末，按“2.4” 項下方法制備供試品溶液，在 “2.2” 項色譜條件下，分別取10 μL 進(jìn)樣，記錄指紋圖譜，將14個產(chǎn)地3個等級的夏天無指紋圖譜數(shù)據(jù)導(dǎo)入“中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)”（2012 版） 軟件，以S1 樣品色譜圖為參照，詳細(xì)比較了所有批次樣品的HPLC色譜圖，共確定12個特征共有峰，確定了6 號峰為鹽酸巴馬汀、7 號峰為紫堇堿、9 號峰為四氫藥根堿、10 號峰為比枯枯靈堿、11 號峰為原阿片堿，12 號峰為延胡索乙素。見圖2～3。

圖2 42 批樣品HPLC 指紋圖譜Fig.2 HPLC fingerprints of forty-two batches of samples

圖3 夏天無對照指紋圖譜Fig.3 HPLC reference spectrum of C.decumbens

3.2 相似度分析 采用“中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)”（2012 版） 軟件，以夏天無對照指紋圖譜為參照，計算相似度，結(jié)果見表1?？芍?，14個產(chǎn)地3個等級夏天無藥材與對照指紋圖譜的相似度均大于0.94，表明同產(chǎn)地不同等級夏天無藥材在成分組成上無太大差別。

3.3 化學(xué)模式識別 采集14 批次3 等級夏天無6成分定量數(shù)據(jù)，利用SIMCA 14.1 軟件對夏天無中6 種主要指標(biāo)性成分進(jìn)行分析［4-5］。將42 批次夏天無樣品6 種特征成分導(dǎo)入SIMCA 14.1 軟件中進(jìn)行主成分分析分析，圖4 表明，3個等級未能很好的區(qū)分。為了更好地考察化學(xué)模式識別方法能否將不同等級完全區(qū)分，進(jìn)一步采用0PLS-DA 法對樣品進(jìn)行分析，由圖4B 可以看出，大選與小選可以很好的分開，為夏天無的等級劃分提供可靠依據(jù)。

4 討論

4.1 供試品制備方法選擇 本研究考察了同一批次的夏天無粉末的回流提取和超聲提取，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，兩者含有量差異不大，加熱回流法，試劑和能源耗費大、時間長、過程較復(fù)雜，且加熱有些成分易分解；而超聲提取法，時間短、操作簡單，因此選擇超聲提取法。

4.2 流動相選擇 考察了乙腈-三乙胺醋酸溶液（每1 000 mL 含三乙胺8 ml、冰醋酸30 mL）、乙腈-三乙胺醋酸溶液（每1 000 mL 含三乙胺5 mL、冰醋酸2 mL）、乙 腈-三乙胺醋酸溶液（每1 000 mL含三乙胺5 mL、用冰醋酸調(diào)pH 9.99）、乙腈-0.1% 磷酸溶液、乙腈-0.2% 磷酸溶液、乙腈-0.6%磷酸溶液6個流動相系統(tǒng)。結(jié)果單純用磷酸的分離度不理想，且pH 對峰型、分離度、保留時間和峰面積影響大。流動相中的堿性物質(zhì)含有量要固定不變，同時此條件下的pH 值需精確到千分之一，兩者之一未達(dá)到要求，其峰的分離度不理想。夏天無主要含有生物堿類成分，在酸性或者堿性條件下可以達(dá)到分離，此研究堿性條件下進(jìn)行。

4.3 波長選擇 使用二極管陣列檢測器對樣品進(jìn)行200～400 nm 的全波段掃描，并對各波長下的色譜圖進(jìn)行分析比較。結(jié)果表明各成分在289 nm 處均有較好吸收，且分離良好，特征峰明顯且峰形較好。

圖4 夏天無6 種指標(biāo)性成分化學(xué)模式識別圖Fig.4 Chemical patterns of six constituents in C.decumbens

4.4 6 種指標(biāo)性成分確定 夏天無中主要含生物堿成分，原阿片堿含有量最高［6-7］，其具有鎮(zhèn)痛、解痙、改善微血管循環(huán)、抗血小板聚集、擴血管等作用［8］；鹽酸巴馬汀具有抗心律失常、抑制癌細(xì)胞增長的藥理作用［9］；延胡索乙素具有鎮(zhèn)痛和鎮(zhèn)靜催眠［10］、抗心律失常［11］、降血壓、鈣拮抗等作用，且不良反應(yīng)較少，對持續(xù)性、慢性鈍痛有極佳鎮(zhèn)痛效果四氫藥根堿具有抗炎抗病毒抗心律失常作用；去氫紫堇堿有明顯的抗心肌缺氧缺血［12］、抗炎［13］、抗腫瘤［14-15］、抑制血小板聚集［16］、改善循環(huán)、降低耗氧量、保護(hù)心腦血管等作用。

隨著中藥材規(guī)?；N植、機械化加工，市場上絕大多數(shù)藥材以統(tǒng)貨的形式流通?！稑?biāo)準(zhǔn)》 試行，但未得到普及，原因一是現(xiàn)代中藥材商品流通很難和《標(biāo)準(zhǔn)》 達(dá)到統(tǒng)一，原因二是《標(biāo)準(zhǔn)》 的建立只局限于性狀，而未深入到內(nèi)在成分指標(biāo)的考察。近幾年，夏天無市場價呈增長趨勢，等級劃分具有一定實際意義。現(xiàn)行藥典僅對原阿片堿和鹽酸巴馬亭2 種成分進(jìn)行質(zhì)量控制，較為單一，研究發(fā)現(xiàn)，夏天無樣品中有毒成分比枯枯靈堿含有量較高，為保證臨床用藥安全，制定質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)時應(yīng)考慮其因素。