駱杰爐 梁 儉 梁文能

（廣州中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院 藥學(xué)部， 廣東 廣州510405）

氧化應(yīng)激是心肌缺血后導(dǎo)致病情惡化的關(guān)鍵因素之一，心肌在缺血供氧不足的情況下，由于側(cè)支循環(huán)再灌注，在恢復(fù)供氧的過(guò)程中產(chǎn)生大量氧自由基，超出細(xì)胞清除氧化物的能力，從而導(dǎo)致心肌組織進(jìn)一步損傷和凋亡［1］。有研究表明，核受體TR3（Thyroid-steroid receptor 3，TR3） 的胞內(nèi)定位與氧化應(yīng)激對(duì)細(xì)胞的損傷有著密切關(guān)系，TR3 從細(xì)胞核移位至線粒體是促進(jìn)心肌細(xì)胞凋亡的重要機(jī)制［2-3］。

紅花Carthamus tinctorius L.屬于菊科植物，作為藥材最早見(jiàn)于東漢張仲景的《金匾要略》，記載其有活血化瘀、行氣通脈的功效［4］。紅花色素是藥材紅花的主要活性成分，包含有多種水溶性查爾酮成分，其中紅花黃色素A 占比最高，目前已提取制作成單一成分的注射液在臨床上主要用于治療穩(wěn)定型心絞痛等心血管疾病，具有顯著的療效［5］。研究表明，紅花黃色素A 能夠抑制缺氧再灌注過(guò)程中產(chǎn)生的氧自由基的水平，降低氧化應(yīng)激對(duì)心肌細(xì)胞的損傷，但其具體作用機(jī)制尚未完全明確［6］。本研究以H2O2模擬氧自由基對(duì)H9c2 心肌細(xì)胞的氧化應(yīng)激損傷，研究紅花黃色素A 對(duì)TR3 的胞內(nèi)定位及凋亡信號(hào)通路的影響［7］，進(jìn)一步闡明紅花黃色素A 保護(hù)缺血心肌的作用機(jī)制。

1 材料

1.1 藥物與試劑 紅花黃素A（批號(hào)111637-201812，純度＞99.0%）、4′，6-二脒基-2-苯基吲哚（4′，6-diamidino-2-phenylindole，DAPI，批號(hào)023K1925）、TritonX-100（批號(hào)118K0177） 購(gòu)自美國(guó)Sigma 公司；CCK-8 試劑盒（批號(hào)KTC011001購(gòu)自日本Dojindo Lab 公司；高糖DMEM 培養(yǎng)基（批號(hào)966185）、特級(jí)胎牛血 清（FBS，批號(hào)1315148） 購(gòu)自美國(guó)Gibco 公司；BCA 蛋白定量試劑盒（批號(hào)P0019）、丙二醛（Malondialdehyde，MDA，批號(hào)S0131）、超氧化物歧化酶（Superoxide Dismutase，SOD，批號(hào)S0101） 檢測(cè)試劑盒購(gòu)自碧云天生物技術(shù)研究所；AnnexinV-FITC／7-AAD 細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒（批號(hào)BD556547） 購(gòu)自美國(guó)BD公司；線粒體／細(xì)胞核提取試劑盒（批號(hào)KGA828）購(gòu)于南京凱基生物科技發(fā)展有限公司；Bcl-2（稀釋度1∶1 000，批號(hào)15071）、Bax（稀釋度1∶1 000，批號(hào)2772）、TR3 核受體（稀釋度1∶1 000，批號(hào)3960）、cl caspase-9（稀釋度1∶1 000，批號(hào)9504）、β-actin（稀釋度1∶1 000，批號(hào)4967） 兔抗鼠一抗、HRP 偶聯(lián)羊抗兔二抗（稀釋度1∶5 000，批號(hào)7074）、線粒體綠色熒光探針（MitoTracker? Green FM） 購(gòu)自美國(guó)Cell Signaling Technology 公司；Alexa Fluor 594（紅色熒光，稀釋度1∶400，批號(hào)A00131） 羊抗兔二抗購(gòu)自美國(guó)Invitrogen 公司。

1.2 細(xì)胞株 鼠源性心肌細(xì)胞株H9c2 由廣州中醫(yī)藥大學(xué)中藥學(xué)院藥理實(shí)驗(yàn)室中心提供。

1.3 儀器 Thermo Forma 3951 細(xì)胞培養(yǎng)箱、Sorvall ST 40 臺(tái)式離心機(jī)均購(gòu)自美國(guó)Thermo 公司；FACS Calibur型流式細(xì)胞儀（美國(guó)BD 公司）；iMark 680 酶標(biāo)儀、Western blot 轉(zhuǎn)膜儀（美國(guó)Bio-Rad 公司）；TCS SP8 激光共聚焦顯微鏡（德國(guó)Leica 公司）。

2 方法

2.1 H9c2 心肌細(xì)胞培養(yǎng) 用含10% FBS 高糖DMEM 培養(yǎng)液，于37℃、5% CO2、95% 飽和濕度條件下培養(yǎng)細(xì)胞。細(xì)胞生長(zhǎng)滿皿約80% 時(shí)進(jìn)行傳代，棄去舊培養(yǎng)液，PBS 沖洗，加入0.25% 胰酶消化2～3 min，再加含血清培養(yǎng)液終止消化，用滴管輕輕吹打至細(xì)胞從皿底完全脫落，按實(shí)驗(yàn)需求接種于培養(yǎng)板或培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)待用。

2.2 細(xì)胞存活率檢測(cè) 將培養(yǎng)好的細(xì)胞接種于96孔板中，在細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)良好時(shí)，按實(shí)驗(yàn)需要進(jìn)行不同的處理。模型組加入終濃度為50 μmol／L H2O2造模，3個(gè)藥物組在加入H2O2基礎(chǔ)上分別加入終濃度為10、20、40、80 μmol／L 紅花黃色素A，空白組只更換培養(yǎng)基，不作任何處理。各組作用24 h，每孔加入10 μL CCK-8 試劑，37℃孵育2 h，用酶標(biāo)儀測(cè)定各孔450 nm 波長(zhǎng)OD。每組設(shè)5個(gè)復(fù)孔，細(xì)胞存活率＝（OD實(shí)驗(yàn)組／OD空白組） ×100%。

2.3 細(xì)胞凋亡率檢測(cè) 將細(xì)胞接種于6 孔板中，分組處理后，棄去培養(yǎng)液，PBS 洗滌2 次，每孔加入0.25% 胰蛋白酶（不含EDTA） 于37℃消化2～3 min，每孔加入含血清的培養(yǎng)液終止消化。細(xì)胞懸浮液以1 000 r／min 離心10 min，棄去上清，收集細(xì)胞。按照試劑盒提供的步驟進(jìn)行AnnexinVFITC／7-AAD 染色，流式細(xì)胞儀檢測(cè)H9c2 細(xì)胞凋亡率。凋亡率＝右上象限細(xì)胞百分比＋右下象限細(xì)胞百分比。

2.4 氧化應(yīng)激水平檢測(cè) 將H9c2 心肌細(xì)胞接種于6 孔板中，分組處理后，去除細(xì)胞培養(yǎng)液，PBS洗滌2 次，加入細(xì)胞裂解液作用30 min 制作細(xì)胞勻漿，按MDA、SOD 檢測(cè)試劑盒說(shuō)明書(shū)操作檢測(cè)，按公式將吸光度值換算成MDA（μmol／g Prot） 和SOD（U／mg Prot）。

2.5 線粒體熒光染色 將培養(yǎng)好的細(xì)胞接種于6孔板中，分組處理后，去除細(xì)胞培養(yǎng)液，加入以細(xì)胞培養(yǎng)液（1∶1 000） 稀釋配制好的MitoTracker?Green FM 工作液，37℃孵育30 min。在染色后，用PBS 洗滌3 次，加入4%多聚甲醛固定液，室溫靜置30 min。

2.6 TR3 熒光免疫染色 將固定好的細(xì)胞加入0.5% TritonX-100 室溫破膜10 min，吸棄TritonX-100，PBS 洗滌3 次。5% BSA 在37℃下封閉30 min，吸棄封閉液。3% BSA 稀釋一抗，每皿加200 μL，4℃搖床孵育過(guò)夜。吸棄各皿一抗，PBS洗滌3 次。每孔加入PBS 稀釋的二抗200 μL，室溫避光在搖床上孵育60 min。

2.7 細(xì)胞核熒光染色 將固定好的細(xì)胞以PBS 洗滌2 次，加入DAPI 溶液（0.5 μmol／L），室溫避光輕搖30 min，棄去染色液，PBS 洗滌后用熒光顯微鏡在364 nm 激發(fā)波長(zhǎng)下觀察染色情況。

2.8 線粒體與細(xì)胞核提取分離 將細(xì)胞接種于6 孔板中，分組處理后，去除細(xì)胞培養(yǎng)液，PBS洗滌，加入細(xì)胞裂解液作用30 min 制作細(xì)胞勻漿，按說(shuō)明書(shū)采用密度梯度分離法在4℃下離心操作，先以2 700 r／min 離心5 min 沉淀細(xì)胞核，上清液轉(zhuǎn)移至梯度溶液中，20 000 r／min 離心20 min，從濃度梯度交界處吸取線粒體樣品。

2.9 Western blot 法檢測(cè)蛋白表達(dá) 按照“2.8”項(xiàng)下方法分離線粒體和細(xì)胞核，加入預(yù)冷的裂解液作用30 min，以微孔過(guò)濾器去除細(xì)胞碎片等雜質(zhì)，取上清液，BCA 法測(cè)定蛋白濃度。用12% SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳分離總蛋白，然后轉(zhuǎn)移到聚偏二氟乙烯膜上，5% BSA 封閉90 min，加入稀釋好的一抗，在4℃條件下孵育過(guò)夜。TBST 洗膜后，加入二抗，37℃孵育1 h，洗滌2 次，ECL 發(fā)光試劑顯影，采用凝膠成像系統(tǒng)軟件分析膠片中蛋白條帶組的灰度面積，將空白組各蛋白與內(nèi)參β-actin 的比值設(shè)為基準(zhǔn)值1.0，其余各組蛋白均除以基準(zhǔn)值的計(jì)算相對(duì)表達(dá)量。

2.10 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS 19.0 軟件進(jìn)行分析，數(shù)據(jù)以（） 表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用SNK-q檢驗(yàn)，以P≤0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 紅花黃色素A 對(duì)H9c2 細(xì)胞存活率的影響 如圖1 所示，與模型組比較，細(xì)胞存活率隨紅花黃色素A 濃度（40～80 μmol／L） 增加而逐漸升高（P＜0.05，P＜0.01），但當(dāng)紅花黃色素A 濃度達(dá)到100 μmol／L 時(shí)，細(xì)胞存活率開(kāi)始下降，表明此時(shí)藥物濃度過(guò)高，對(duì)細(xì)胞的培養(yǎng)環(huán)境產(chǎn)生影響，不利于細(xì)胞生長(zhǎng)，因此后續(xù)實(shí)驗(yàn)僅以40、60、80 μmol／L 3個(gè)濃度作進(jìn)一步研究。

圖1 紅花黃色素A 對(duì)H9c2 細(xì)胞存活率的影響Fig.1 Effects of safflor yellow A on the survival rate of H9c2 cells

3.2 紅花黃色素A 對(duì)H9c2 細(xì)胞凋亡率的影響 與空白組相比，模型組凋亡率增加（P＜0.05）；與模型組比較，紅花黃色素A組細(xì)胞凋亡率下降（P＜0.05，P＜0.01），呈濃度依賴性。見(jiàn)表1、圖2。

表1 紅花黃色素A 對(duì)H9c2 細(xì)胞凋亡率的影響（，n＝5）Tab.1 Effects of safflor yellow A on the apoptosis rate of H9c2 cells（， n＝5）

表1 紅花黃色素A 對(duì)H9c2 細(xì)胞凋亡率的影響（，n＝5）Tab.1 Effects of safflor yellow A on the apoptosis rate of H9c2 cells（， n＝5）

注：與空白組比較，＃ P ＜0.05；與模型組比較，* P ＜0.05，**P＜0.01。

圖2 流式細(xì)胞檢測(cè)各組細(xì)胞的凋亡率Fig.2 Apoptosis rate of cells in each group by flow cytometry

3.3 紅花黃色素A 對(duì)H9c2 細(xì)胞氧化應(yīng)激水平的影響 與空白組比較，模型組SOD 水平降低，而MDA 水平升高（P＜0.05）。與模型組比較，紅花黃色素A組SOD 水平升高，MDA 水平下降（P＜0.05，P＜0.01），呈濃度依賴性。見(jiàn)表2。

表2 紅花黃色素A 對(duì)H9c2 細(xì)胞氧化應(yīng)激水平的影響（， n＝5）Tab.2 Effects of safflor yellow A on the level of oxidative stress in H9c2 cells（， n＝5）

表2 紅花黃色素A 對(duì)H9c2 細(xì)胞氧化應(yīng)激水平的影響（， n＝5）Tab.2 Effects of safflor yellow A on the level of oxidative stress in H9c2 cells（， n＝5）

注：與空白組比較，＃ P ＜0.05；與模型組比較，* P ＜0.05，**P＜0.01。

3.4 TR3 核受體的細(xì)胞內(nèi)定位 以下每一組細(xì)胞的染色圖像均分別以3 種不同波長(zhǎng)的發(fā)生光通過(guò)共聚焦顯微鏡進(jìn)行拍攝，其中左上方小圖為DAPI 著色的細(xì)胞核，右上方小圖為熒光單抗結(jié)合的TR3核受體，左下方小圖為附著熒光探針的線粒體，右下方小圖為前3個(gè)圖片的疊加成像。從圖3 可觀察到，相對(duì)于空白組，模型組TR3 核受體開(kāi)始從細(xì)胞核擴(kuò)散移位，并與線粒體的位置重疊，而隨著紅花黃色素A 的濃度增加，TR3 核受體的移位逐漸減小并聚集在細(xì)胞核附近，較少與線粒體位置重疊。

圖3 各組TR3 核受體的細(xì)胞內(nèi)定位Fig.3 Intracellular localization of TR3 nuclear receptors in each group

3.5 紅花黃色素A 對(duì)H9c2 細(xì)胞Bax、Bcl-2、cl caspase-9、TR3 蛋白表達(dá)影響 與空白組相比，模型組Bax、cl caspase-9 蛋白表達(dá)增 加（P＜0.05），而B(niǎo)cl-2 蛋白表達(dá)降低（P＜0.05），線粒體上TR3 蛋白表達(dá)比細(xì)胞核更高（P＜0.05）。與模型組相比，紅花黃色素A組Bax、cl caspase-9 蛋白表達(dá)下降，Bcl-2 蛋白表達(dá)上升，線粒體上TR3蛋白表達(dá)減少，而細(xì)胞核上的TR3 蛋白表達(dá)增加（P＜0.05，P＜0.01）。見(jiàn)圖4。

4 討論

TR3 屬于甲狀腺激素受體超家族，由于其配體尚未確定，因此被歸類為孤兒受體。TR3 在細(xì)胞中的表達(dá)可受到多種因素影響，包括炎癥因子、生長(zhǎng)因子和應(yīng)激反應(yīng)。TR3 具有多種生理功能，可通過(guò)表達(dá)調(diào)節(jié)、翻譯后修飾及亞細(xì)胞定位發(fā)揮各種不同的生理作用，包括細(xì)胞增殖、分化、生長(zhǎng)、凋亡、代謝及免疫。關(guān)于TR3 的研究較多涉及腫瘤學(xué)方面，研究表明其對(duì)多種腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)增殖均可產(chǎn)生促進(jìn)作用；而在神經(jīng)元和心肌等正常細(xì)胞中，在缺氧再灌注并產(chǎn)生氧化損傷的情況下，TR3 則充當(dāng)誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的關(guān)鍵因子，促使凋亡通路的執(zhí)行［8］。研究指出，TR3 之所以能夠產(chǎn)生截然相反的生物效應(yīng)與其在細(xì)胞內(nèi)的定位密切相關(guān)，在細(xì)胞核內(nèi)TR3 可通過(guò)激活DNA 轉(zhuǎn)錄而促進(jìn)細(xì)胞的增殖和生長(zhǎng)，是大多數(shù)腫瘤細(xì)胞過(guò)度增殖、轉(zhuǎn)移、耐藥的關(guān)鍵因素之一［9］，但對(duì)于正常組織的細(xì)胞，在外界有害因素的刺激下，TR3 轉(zhuǎn)移離開(kāi)細(xì)胞核則可誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。有學(xué)者研究報(bào)道，在離體心肌細(xì)胞應(yīng)激損傷模型中，TR3 從胞核到線粒體的轉(zhuǎn)位是開(kāi)啟細(xì)胞凋亡通路的重要機(jī)制，當(dāng)其定位于線粒體上，可與Bcl-2 結(jié)合引起構(gòu)象變化，同時(shí)上調(diào)Bax的表達(dá)，從而激活細(xì)胞質(zhì)中的cl caspase-9，啟動(dòng)線粒體凋亡途徑導(dǎo)致細(xì)胞死亡［10］。當(dāng)細(xì)胞處于應(yīng)激損傷的狀態(tài)下TR3 離開(kāi)細(xì)胞核的機(jī)制尚未完全清晰，目前有研究指出TR3 離開(kāi)細(xì)胞核的過(guò)程與MAPK（有絲分裂原激活的蛋白激酶） 通路密切相關(guān)，MAPK 的信號(hào)通路可促進(jìn)TR3 的磷酸化使其與DNA 分離轉(zhuǎn)移至核外的細(xì)胞器［2］。

圖4 紅花黃色素A 對(duì)H9c2 細(xì)胞Bax、Bcl-2、cl caspase-9、TR3 蛋白表達(dá)影響Fig.4 Effects of safflor yellow A on Bax，Bcl-2，cl caspase-9 and TR3 protein expression in H9c2

中藥紅花為一年生或者一年兩生菊科植物藥材，原產(chǎn)自西亞和歐洲等地區(qū)，現(xiàn)中國(guó)河南和新疆等地均有種植，一般以管狀花入藥，屬珍貴藥材資源。據(jù)中醫(yī)藥古籍《湯液本草》 記載，紅花性溫、味辛，陰中之陽(yáng)，無(wú)毒，歸入心、肝經(jīng)。《本草匯言》 記載，紅花為化瘀、行血、活血、調(diào)血之藥，可治胸悶心痛、口唇青紫、血滯經(jīng)閉、產(chǎn)后瘀阻、跌打損傷等瘀血證諸癥［11］?，F(xiàn)代天然藥物化學(xué)研究表明，紅花中具有治療心血管疾病的藥效成分，主要為黃酮類化合物，包括紅花黃素A、紅花黃素B、山柰酚苷、槲皮素苷、木犀草素、蘆丁等物質(zhì)，其中水溶性查爾酮類化合物紅花黃色素A 是主要藥效組分［12］。紅花黃色素A 有明顯增加冠脈血流量，改善心肌供血作用，其單成分注射液和復(fù)方注射液血必凈在臨床上常作為冠心病或冠脈支架術(shù)后的輔助用藥。從化學(xué)結(jié)構(gòu)分析，紅花黃色素A帶有多個(gè)酚羥基，因而具有良好的還原性，研究表明，紅花黃色素A 能有效降低心肌缺血-再灌注模型血漿中乳酸脫氫酶（LDH） 和丙二醛（MDA）水平，提高過(guò)氧化物歧化酶（SOD） 活性，加速自由基的消除，從而產(chǎn)生良好的抗氧化作用［13］。氧化應(yīng)激損傷心肌細(xì)胞的機(jī)制與MAPK 通路密切相關(guān)，細(xì)胞實(shí)驗(yàn)研究表明在H2O2建立的氧化損傷模型中，MAPK 通路相關(guān)的蛋白均參與到促進(jìn)細(xì)胞凋亡的過(guò)程，而抗氧化能力較強(qiáng)的天然化合物包括黃酮和皂苷，皆可調(diào)控MAPK 通路而對(duì)模型細(xì)胞產(chǎn)生保護(hù)作用［14-15］。綜合本文各項(xiàng)實(shí)驗(yàn)結(jié)果和相關(guān)文獻(xiàn)的研究結(jié)論進(jìn)行分析，可以初步推測(cè)紅花黃色素A 抑制氧化應(yīng)激對(duì)心肌損傷的機(jī)制是通過(guò)降低氧自由基對(duì)細(xì)胞器的脂質(zhì)成分和蛋白的氧化損傷，抑制MAPK 通路誘導(dǎo)TR3 受體離開(kāi)細(xì)胞核移位至線粒體，抑制其與Bcl-2 結(jié)合，逆轉(zhuǎn)Bax 與Bcl-2的表達(dá)比例，降低下游凋亡蛋白caspase-9 的活化，阻滯細(xì)胞線粒體損傷介導(dǎo)的凋亡程序執(zhí)行，從而發(fā)揮保護(hù)心肌細(xì)胞的作用［16］。

核受體TR3 移位離開(kāi)細(xì)胞核后，除了定位于線粒體還可以結(jié)合到內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上，這是TR3 介導(dǎo)細(xì)胞凋亡的另一重要途徑。研究表明，氧自由基可通過(guò)該途徑引起內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激反應(yīng)，使內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激內(nèi)部蛋白質(zhì)發(fā)生錯(cuò)誤折疊并過(guò)度聚集，同時(shí)又促進(jìn)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)大量釋放Ca2＋，造成胞漿內(nèi)鈣離子超載，激活鈣依賴性蛋白酶Calpain，最終觸發(fā)caspase 12 誘導(dǎo)的凋亡程序［17-18］。紅花黃色素A 能否通過(guò)影響內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激介導(dǎo)的凋亡程序也產(chǎn)生抑制氧化應(yīng)激對(duì)心肌細(xì)胞的損傷作用，這將會(huì)是本課題組的下一個(gè)研究重點(diǎn)。