汪 亮，丁良梅，劉 娣*

（1.黑龍江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 畜牧研究所，哈爾濱 150086；2.黑龍江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 博士后工作站，哈爾濱 150086）

環(huán)境溫度是影響生豬生長、繁殖的重要限制性因素之一。在低溫環(huán)境下，豬只經(jīng)常會發(fā)生低溫病，導(dǎo)致仔豬死亡、母豬生長緩慢，進而影響生豬生產(chǎn)［1］。民豬是在我國東北地區(qū)培育的能夠適應(yīng)寒冷環(huán)境的地方優(yōu)秀豬種［2］，研究民豬抗寒的分子機制及其遺傳方式對于挖掘其優(yōu)秀的遺傳特性、促進優(yōu)良基因利用和推動生豬生產(chǎn)具有重要意義。

表觀遺傳學(xué)是指不通過DNA序列的改變，而是通過DNA甲基化、染色體構(gòu)象變化等方式將親代對環(huán)境的反應(yīng)傳遞給后代，使后代獲得對類似環(huán)境的適應(yīng)性［3］的一種遺傳方式。精子是雄性個體向后代傳遞遺傳信息的唯一渠道，而睪丸支持細胞（sertoli cells，ST）是構(gòu)成曲細精管的唯一體細胞，為精子發(fā)育提供環(huán)境條件［4-5］。因此，ST細胞中的基因表達差異會影響精子發(fā)生，并進一步通過受精作用影響后代表型［6］。

DNA甲基轉(zhuǎn)移酶3B（DNA methyltransferase 3B，DNMT3B）可以通過在基因組CpG二核苷酸胞嘧啶的第5位碳原子上加一個甲基改變基因組甲基化狀態(tài)，以此抑制或關(guān)閉基因的表達，發(fā)揮調(diào)節(jié)作用［7-9］。前期研究表明，環(huán)境溫度的改變會明顯改變ST細胞中的DNMT3B基因的表達，進一步研究其對ST細胞遷移和下游基因的影響，特別是對組蛋白相關(guān)基因、熱應(yīng)激相關(guān)基因和細胞增殖凋亡相關(guān)基因的影響，對人們了解該基因?qū)影l(fā)育環(huán)境的影響及精子傳遞是否與民豬抗寒性狀相關(guān)具有重要意義。

1 材料

1.1 試驗細胞

ST細胞，購自通派（上海）生物科技有限公司。

1.2 主要試劑及儀器

RNAiso Plus（9109，TaKaRa）、反轉(zhuǎn)錄試劑盒（RR047A，TaKaRa），購自哈爾濱寶士德生物科技有限公司；熒光定量試劑 UltraSYBR Mixture（01170／30105），購自北京康為世紀生物科技有限公司；胎牛血清（FBS，A6806-31 NQBB），澳大利亞產(chǎn)；DMEM／F-12培養(yǎng)基（10092007，CORNING），美國產(chǎn)；Annexin V-FITC／PI，購自上海翊圣生物科技有限公司；PCR儀（TC-512），購自德國Biometro公司；電泳儀（DYY-12C），購自北京市六一儀器廠；凝膠成像系統(tǒng)（HR-7752），購自美國BIO-RAD公司；熒光定量PCR儀（Stepone），購自美國Applied Biosystems公司；二氧化碳培養(yǎng)箱（CB150），購自德國BINDER公司。

2 方法

2.1 DNMT3B真核表達載體的構(gòu)建

2.1.1 ST細胞總RNA提取及反轉(zhuǎn)錄 采用TRIzol法提取對數(shù)期細胞總RNA，測定總RNA濃度和純度，按TaKaRa反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書操作。

1）基因組DNA除去反應(yīng)體系：5×gDNA Eraser Buffer 2μL，gDNA Eraser 1μL，模板RNA 1μg，加RNase Free Water至10μL。PCR反應(yīng)條件：42℃2 min，16℃2 min。

2）逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)體系的配制及反應(yīng)體系：RT Primer Mix 1μL，5×PrimeScript Buffer 2 4μL，PrimeScript RT Enzyme MixⅠ1μL，RNase Free Water 4μL，加入步驟1）反應(yīng)液10μL。PCR反應(yīng)條件：42℃15 min，84℃5 s，16℃1 min。獲得cDNA，于-20℃保存，用于后續(xù)試驗。

2.1.2 DNMT3B基因的克隆測序 在NCBI中檢索豬DNMT3B（NM_001348900.1）的CDS序列信息。利用Primer5.0軟件分別設(shè)計上、下游引物，引物序列見表1。

表1 DNMT3B基因CDS區(qū)擴增引物序列

以2.1.1中得到的cDNA為模板，利用表1的引物擴增獲取DNMT3B基因cDNA全長編碼區(qū)序列。PCR擴增體系：2×Taq Master Mix 10μL，10μmol／L上下游引物各0.5μL，模板1μL，ddH2O補至20μL。降落PCR擴增程序：94℃5 min；94℃30 s，63℃30 s，72℃2 min，26個循環(huán)；94℃30 s，50℃30 s，72℃2 min，20個循環(huán)；72℃5 min；16℃1 min。以10 000 bp Marker作為參照，取6μL PCR產(chǎn)物用瓊脂糖凝膠進行電泳檢測。參照北京全式金生物公司試劑盒（EasyPure Quick Gel Extraction Kit，貨號為EG101-01）說明書操作，純化回收上述PCR產(chǎn)物，連接到pGM-T Vector（TIANGEN），構(gòu)建pGM-T-DNMT3B質(zhì)粒。連接體系：10×T4 DNA ligase Buffer 1μL，T4 DNA ligase 1μL，pGM-T載體1μL，目的基因膠回收產(chǎn)物4μL，ddH2O 3μL，在PCR儀中16℃過夜連接。連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化到DH5α感受態(tài)細胞中，挑取單克隆，經(jīng)菌液PCR鑒定后，選取陽性克隆送至北京擎科生物技術(shù)有限公司進行測序，測序結(jié)果用DNAMan、Premier 5.0等軟件進行分析。

2.1.3 pcDNA3.1-DNMT3B真核表達載體的構(gòu)建 擴大培養(yǎng)測序正確的單克隆菌液，按照TIANGEN質(zhì)粒小提試劑盒說明書提取pGM-T-DNMT3B質(zhì)粒，利用HindⅢ和EcoRⅠ兩種限制性內(nèi)切酶對pGM-T-DNMT3B重組質(zhì)粒及pcDNA3.1（＋）進行雙酶切，反應(yīng)體系：HindⅢ0.5μL；EcoRⅠ0.5μL；10×Buffer 1μL；Plasmid 1μL；ddH2O 7μL。反應(yīng)條件：37℃10 min。經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳后回收酶切后含DNMT3B基因產(chǎn)物及pcDNA3.1（＋）載體酶切后產(chǎn)物。兩者通過T4連接酶16℃過夜連接，經(jīng)轉(zhuǎn)化、涂板，單克隆鑒定陽性菌落（方法同2.1.2），最終獲得pcDNA3.1-DNMT3B真核表達載體。

2.2 細胞劃痕法測定DNMT3B基因過表達對細胞遷移的影響

將對數(shù)生長期ST細胞調(diào)整為細胞密度約10×105個／mL，接種于60 mm細胞培養(yǎng)皿中。次日將構(gòu)建的綠色熒光蛋白真核表達載體pEGFP-N1空質(zhì)粒、pcDNA3.1（＋）空質(zhì)粒組、pcDNA3.1-DNMT3B重組質(zhì)粒瞬時轉(zhuǎn)染到ST細胞中（轉(zhuǎn)染步驟按照Lipofectamine 2000說明書進行）。24 h后將轉(zhuǎn)染綠色熒光蛋白真核表達載體pEGFP-N1空質(zhì)粒的細胞倒置于熒光顯微鏡下觀察，確定轉(zhuǎn)染效率；同時將轉(zhuǎn)染pcDNA3.1（＋）空質(zhì)粒組及pcDNA3.1-DNMT3B重組質(zhì)粒的ST細胞按5×104個／孔的密度接種于35 mm細胞培養(yǎng)皿，每組分別設(shè)3個重復(fù)。當(dāng)培養(yǎng)皿底部被單層細胞覆蓋時進行細胞劃痕試驗，步驟如下：用10μL無菌槍頭在單層細胞表面輕輕劃兩條平行直線，用DPBS緩沖液輕輕沖洗脫落下來的細胞2次，向培養(yǎng)皿中加入含1%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液，放置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中。細胞劃痕后分別在第0，24，48，72小時檢測細胞遷移情況，用倒置顯微鏡在同一視野50倍鏡下對劃痕拍照。采用Motic Image 2000 1.3軟件測量不同時間點各組劃痕寬度，0小時記為S0，t小時記為St，將對照組細胞相對遷移速率設(shè)為1，各試驗組細胞相對遷移速率為遷移距離與對照組遷移距離的比值。

2.3 DNMT3B基因過表達對下游基因表達的影響

2.3.1 定量引物設(shè)計及DNMT3B基因在ST細胞中的過表達 將pcDNA3.1-DNMT3B重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染到對數(shù)生長期的ST細胞中，以pcDNA 3.1（＋）質(zhì)粒為對照組（轉(zhuǎn)染步驟按照Lipofectamine 2000說明書進行），參照Real-time PCR引物設(shè)計原則，分別設(shè)計豬cDNA中DNMT3A、DNMT3B、常染色質(zhì)組蛋白賴氨酸N-甲基轉(zhuǎn)移酶2（Euchomatic hiST 細 胞 onelisine N-methyltransferase 2，EHMT2）、組蛋白脫乙酰酶1（histone deacetylase 1，HDAC1）、血紅素加氧酶1（heme oxygenase 1，HMOX1）、熱休克轉(zhuǎn)錄因子1（heat shock transcription factor 1，HSF1）、熱休克蛋白70（heat shock protein 70，HSP70）、熱休克蛋白90（heat shock protein 90，HSP90）、熱休克蛋白1［heat shock protein family B（small）member 1，HSPB1］、tRNA-天冬氨酸甲基化酶（tRNA aspartic acid methyltransferase 1，TRDMT1）、CSD結(jié)構(gòu)域的E1蛋白（cold shock domain containing E1，CSDE1）、特異性促凋亡因子DNA損傷誘導(dǎo)轉(zhuǎn)錄蛋白3（DNA damage inducible transcript 3，DDIT3）、蛋白精氨酸甲基轉(zhuǎn)移酶5（protein arginine methyltransferase 5，PRMT5）、P53、Caspase3、C-myc基因定量引物，引物序列見表2。

表2 基因定量引物序列

2.3.2 下游基因的熒光定量檢測 用TRIzol法 提取細胞總RNA，經(jīng)反轉(zhuǎn)錄，得到cDNA，于-20℃保存?；蚨恳铮ㄒ姳?）進行實時熒光定量PCR反應(yīng)，反應(yīng)體系：cDNA樣品0.5μL，2×SYBR Green PCR Mixture 10μL，上下游引物各0.5μL，滅菌水補充至20μL，每個樣品重復(fù)3次。擴增條件：95℃10 min；95℃15 s；60℃1 min；72℃30 s，40個循環(huán)；溶解曲線程序：95℃15 s；60℃1 min；95℃15 s；60℃1 min。用相對定量分析方法，以β-ACTIN基因為內(nèi)參，計算各基因相對表達量。

2.4 數(shù)據(jù)的統(tǒng)計分析

試驗組內(nèi)均設(shè)置3個重復(fù)，每個試驗均重復(fù)3次。試驗數(shù)據(jù)用GraphPad Prism 5.0、Motic Image 2000 1.3軟件進行分析，采用單因素方差分析法進行差異顯著性分析，當(dāng)P＜0.05時有統(tǒng)計學(xué)意義。

3 結(jié)果與分析

3.1 細胞總RNA的提取

采用TRIzol法提取細胞總RNA，1%瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果見圖1?？俁NA電泳顯示出3條清晰亮帶，由上至下分別為28S、18S、5S。經(jīng)紫外分光光度計測定，提取的總RNA質(zhì)量較好，可用于后續(xù)基因表達量的檢測。

3.2 DNMT3B基因真核過表達載體的構(gòu)建

3.2.1 豬DNMT3B基因PCR擴增結(jié)果 以豬ST細胞cDNA為模板進行DNMT3B基因CDS區(qū)PCR擴增，1%瓊脂糖凝膠電泳檢測結(jié)果見圖2。DNMT3B基因在2 000～3 000 bp之間獲得的片段與預(yù)期片段（2 571 bp）大小相符，清晰條帶。

3.2.2 pGM-T-DNMT3B重組質(zhì)粒構(gòu)建及雙酶切鑒定結(jié)果 將純化獲得的目的片段連接到pGM-T Vector載體上，轉(zhuǎn)化純化重組質(zhì)粒，用HindⅢ和BamHⅠ對獲得的pGM-T-DNMT3B質(zhì)粒雙酶切鑒定，酶切產(chǎn)物進行瓊脂糖凝膠電泳，結(jié)果見圖3。在2 000～3 000 bp中間位置獲得與預(yù)期條帶（2 571 bp）大小相符的條帶，證明重組質(zhì)粒已成功連接。經(jīng)膠回收得到單一清晰條帶，其菌液送往測序公司進行測序。

3.2.3 pcDNA3.1-DNMT3B重組質(zhì)粒鑒定 將雙酶切后純化的DNMT3B基因片段與雙酶切后純化的pcDNA3.1（＋）質(zhì)粒片段進行連接、轉(zhuǎn)化反應(yīng)，構(gòu)建成pcDNA3.1-DNMT3B重組質(zhì)粒，以轉(zhuǎn)化重組質(zhì)粒的菌液提取質(zhì)粒并用HindⅢ和EcoRⅠ進行酶切鑒定。瓊脂糖凝膠電泳檢測，在2 000～3 000 bp之間獲得了DNMT3B基因片段，證明pcDNA3.1-DNMT3B重組質(zhì)粒構(gòu)建成功，見圖4。

3.3 過表達DNMT3B基因?qū)毎w移速率的影響

采用細胞劃痕方法檢測DNMT3B基因過表達對細胞相對遷移速率的影響，以pcDNA3.1（＋）空載體及轉(zhuǎn)染細胞組作為對照組和空白組，分別在0，24，48，72小時拍照，觀察到24，48小時時轉(zhuǎn)染pcDNA3.1-DNMT3B重組質(zhì)粒的細胞遷移能力明顯低于空白組和pcDNA3.1（＋）空載體組。結(jié)果表明：過表達DNMT3B基因的ST細胞24小時時劃痕的相對遷移率低于pcDNA3.1（＋）空質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組及未轉(zhuǎn)染組細胞，為空白組遷移速率的0.512倍，差異顯著（P ＜0.05）；48小時時為空白組遷移速率的0.620倍且差異顯著（P ＜0.05）；72小時時為空白組遷移速率的0.799倍，但差異不顯著。遷移速率結(jié)果見表3，DNMT3B基因過表達對豬ST細胞遷移的影響見圖5。

表3 DNMT3B過表達對豬ST細胞相對遷移距離的影響

3.4 過表達DNMT3B基因的ST細胞中下游基因相對表達量變化

Real-time PCR檢測各組cDNA中DNMT3A、DNMT3B、EHMT2、HDAC1、HMOX1、HSF1、HSP70、HSP90、HSPB1、TRDMT1、CSDE1、DDIT3、PRMT5、P53、Caspase3、C-myc基因相對表達量，并用SPSS13.0軟件對數(shù)據(jù)進行單因素一維方差分析，結(jié)果見圖6。伴隨著DNMT3B基因的過表達，DNMT3A、EHMT2、HDAC1、CSDE1、HSF1、P53、Caspase3、C-myc相對表達量升高，其中DNMT3A、HSF1、P53、C-myc相對表達量顯著升高（P ＜0.05），分別為正常豬ST細胞的1.57，1.51，1.78，1.47倍；TRDMT1相對 表 達 量 略降 低；PRMT5、HSP70、HSP90、HMOX1、HSPB1、DDIT3相對表達量不變。

4 討論

4.1 DNMT3B基因過表達對細胞遷移的影響

細胞遷移能力反映了細胞在特定環(huán)境下生長和運動的能力，細胞劃痕試驗是檢測細胞遷移能力的方法。細胞的劃痕修復(fù)能力能夠反映細胞在某些特定環(huán)境或特定基因表達變化時的生長活性。本試驗檢測了ST細胞在正常培養(yǎng)、轉(zhuǎn)染pcDNA 3.1空質(zhì)粒和過表達DNMT3B基因條件下ST細胞的遷移情況，結(jié)果表明，DNMT3B基因的過表達會明顯抑制ST細胞的遷移，并且這種抑制作用隨著時間的增加而逐漸減弱。目前已知DNMT3A、DNMT3B具有DNA從頭甲基化功能，可以增加DNA某些區(qū)段的甲基化水平，抑制或關(guān)閉相關(guān)基因的表達。朱慧等［10］在肝細胞癌的研究中發(fā)現(xiàn)，通過轉(zhuǎn)染HbsAg基因抑制DNMT3B基因表達后肝癌細胞的增值受到抑制。而董高宏等［11］的研究則證明DNMT3B基因可能是通過Hippo信號通路發(fā)揮其對細胞生長的抑制作用。但彭芳等［12］在宮頸癌的研究中卻發(fā)現(xiàn)，DNMT3B表達的升高會促進人宮頸癌細胞的生長和侵襲。這些研究表明，DNMT3B基因?qū)毎飳W(xué)行為的調(diào)控可能與細胞類型、生長環(huán)境等因素間存在復(fù)雜的相互作用關(guān)系，是調(diào)節(jié)細胞活力和運動的極為重要的基因。

4.2 DNMT3B基因過表達對下游基因影響分析

在檢測的下游基因中包含了EHMT2和HDAC1，這兩種基因與組蛋白修飾相關(guān)，它們的表達情況可以間接反映細胞核中染色體的包裝狀態(tài)。細胞通過這些組蛋白相關(guān)基因的表達來調(diào)節(jié)染色體上其他基因的表達與抑制。S.C.Hyun等［13］通過siRNA干擾敲低某些癌細胞中的EHMT2基因，結(jié)果抑制了膀胱癌、肺癌、前列腺癌和乳腺癌細胞的生長。而在大量醫(yī)學(xué)研究中都發(fā)現(xiàn)，HDAC1廣泛參與腫瘤細胞的生長、凋亡、侵襲和遷移等過程，干擾HDAC1表達能夠降低子宮內(nèi)膜癌細胞的遷移和侵襲能力［14］。本試驗在ST細胞中過表達DNMT3B基因后檢測EHMT2和HDAC1基因的表達，發(fā)現(xiàn)這兩種基因的表達量僅略有升高，表明DNMT3B對其影響不大，DNMT3B對下游基因表達的影響并非通過調(diào)節(jié)組蛋白完成。

熱應(yīng)激蛋白（heat shock proteins，HSPs）家族中的HSP70和HSP90、CSDE1、HSF1、HSPB1等基因是與動物溫度應(yīng)激相關(guān)基因，是細胞在受到溫度、PH值和滲透壓等環(huán)境刺激時合成的一種保護性蛋白［15-17］。這些蛋白雖然成為熱應(yīng)激蛋白，但當(dāng)生物體處在寒冷環(huán)境時這些蛋白的基因表達也會做出相應(yīng)的調(diào)整。本試驗中CSDE1、HSF1的表達有明顯增高。說明DNMT3B能夠通過對特定熱應(yīng)激蛋白類基因的甲基化作用影響動物對壓力環(huán)境的反應(yīng)。

凋亡基因Caspase3基因、癌基因P53基因和C-myc基因都在細胞增殖和凋亡過程中起著重要作用［18-19］。Caspase3基因是細胞凋亡的標記基因之一，功能涉及DNA修復(fù)和DNA完整性的監(jiān)護。當(dāng)Caspase3表達量增高時，引發(fā)裂解核小體間的DNA斷裂，進而導(dǎo)致細胞凋亡［20］。C-myc具有抑制細胞分化及促進腫瘤轉(zhuǎn)化的作用，在對未成熟胸腺細胞中C-myc表達研究中發(fā)現(xiàn)，過度表達的C-myc蛋白會導(dǎo)致胚胎胸腺細胞出現(xiàn)明顯凋亡［21］。P53是一種抑癌基因，其蛋白可以調(diào)節(jié)細胞周期、保持基因組穩(wěn)定性并避免細胞發(fā)生癌變［22-23］。因此這3種基因表達的上調(diào)表明DNMT3B具有抑制細胞生長的作用，這與本試驗中DNMT3B抑制細胞遷移的結(jié)論相同。

5 結(jié)論

本試驗通過在ST細胞中過表達DNMT3B基因，研究了其對細胞遷移生長和下游基因表達的影響，結(jié)果表明，DNMT3B基因具有廣泛細胞生物學(xué)作用，它的過量表達具有促進癌基因表達、抑制細胞生長和遷移并提高特定熱應(yīng)激蛋白類基因表達量的作用。由此也可以推測，當(dāng)動物遭遇逆境時DNMT3B基因表達量的變化將可能影響動物對環(huán)境的適應(yīng)能力。