王 瑩，陳 文，張 浩

(成都理工大學(xué) 材料與化學(xué)化工學(xué)院，成都 610059)

甜味劑是對(duì)食物有重要影響的食品添加劑，是禁糖人士的福音。甜蜜素(CYC)屬于甜味劑的一種，其對(duì)光、熱穩(wěn)定，甜度為蔗糖的30～80倍[1]，應(yīng)用范圍很廣。CYC 化學(xué)名稱是環(huán)己基氨基磺酸鈉(C6H11NHSO3Na)，為白色結(jié)晶或結(jié)晶性粉末，無臭，水溶性好。CYC 可溶于水和丙二醇，在兩者中的溶解度為1 g/5 mL[2]，0.1 kg·m－3CYC溶液的pH 約為6.5。自2009年廣東省“真果粒奶味飲料”中CYC 超標(biāo)事件發(fā)生以來，CYC 的安全使用問題受到了公眾的廣泛關(guān)注。人體每天代謝的CYC 的量有限，CYC的最大攝入量為每公斤體重11 mg。攝入過量的CYC不僅會(huì)加重肝臟負(fù)擔(dān)，還對(duì)腎臟有一定的毒副作用[3]；有研究表明，甜蜜素還對(duì)成骨細(xì)胞的增殖和分化有明顯的的抑制作用[4]。因此，建立一個(gè)簡單、快速、有效地測定食品中CYC 含量的方法，對(duì)于食品安全的保障具有十分重要的意義。

目前，CYC的測定方法有氣相色譜法[5-6]、高效液相色譜法[7-8]、液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法[9-10]、分光光度法[11]、薄層層析法[12]和離子色譜法[13-14]等。這些方法各有其應(yīng)用領(lǐng)域和特點(diǎn)，但氣相色譜法和液相色譜法存在設(shè)備昂貴、無法在基層檢測機(jī)構(gòu)使用的問題；液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法和薄層層析法存在分析過程繁瑣、樣品前處理要求較高、操作過程不夠簡便等問題。

目前，關(guān)于采用電化學(xué)方法檢測CYC的報(bào)道不多。文獻(xiàn)[15]使用三電極系統(tǒng)，在氨性底液[含有0.8%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))對(duì)氨基苯磺酸、0.2%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))鹽酸奈乙二胺、5%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))氨水的混合溶液]中，建立了在－0.38 V(相對(duì)于飽和甘汞電極)下測量CYC的二次衍生極譜波的方法，但該方法需將CYC酯化，分析過程繁瑣，分析時(shí)間較長。根據(jù)文獻(xiàn)[16]報(bào)道，在強(qiáng)堿性溶液中，KMn O4會(huì)與CYC發(fā)生氧化還原反應(yīng)，Mn O4－被還原為綠色的Mn O42－。當(dāng)把極譜三電極置于上述反應(yīng)體系中進(jìn)行線性掃描時(shí)，Mn O4－在電極上會(huì)產(chǎn)生一個(gè)還原峰，且還原峰的峰電流與CYC的含量在一定范圍內(nèi)呈顯著負(fù)相關(guān)，即CYC濃度越大，峰電流越小。

本工作先采用正己烷對(duì)樣品中的CYC 進(jìn)行提取，以將其與樣品中的色素及其他具有還原性的物質(zhì)進(jìn)行有效的分離，然后采用單掃描示波極譜法測定CYC含量，該方法分析體系簡單，無需對(duì)CYC進(jìn)行轉(zhuǎn)化，具有靈敏度較高、操作簡便、分析成本低等特點(diǎn)，有較好的應(yīng)用價(jià)值。

1 試驗(yàn)部分

1.1 儀器與試劑

JP-303型示波極譜儀；三電極體系:滴汞電極為工作電極，飽和甘汞電極為參比電極(222型)，鉑微電極為輔助電極；BS-2245型電子分析天平；H-S6型恒溫水浴箱；HC-2066 型高速離心機(jī)；優(yōu)普系列ULUP-IV-10T 型超純水機(jī)。

CYC 標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液:10.00 g·L－1，稱取1.000 0 g CYC 于燒杯中，用水溶解并定容至100.0 mL。

CYC標(biāo)準(zhǔn)溶液:1.000 g·L－1，移取10.00 mL CYC標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液于100 mL 容量瓶中，用水稀釋至刻度。

NaOH 飽和溶液:23 mol·L－1，稱取92.0 g NaOH 于燒杯中，加入100 mL水溶解，冷卻至室溫后真空抽濾，濾液備用。

KMn O4溶液:0.033 5 mol·L－1，稱取1.7 g KMnO4固體于500 mL 水中，蓋上表面皿，加熱至沸騰并保持微沸狀態(tài)1 h，冷卻至室溫，溶液保存于棕色試劑瓶中，并在室溫下靜置5 d后，用砂芯漏斗過濾備用[12]。其含量用草酸基準(zhǔn)試劑標(biāo)定。

十二烷基磺酸鈉(SDS)溶液:1.0×10－3mol·L－1，稱取0.014 4 g SDS于燒杯中，用水溶解并定容至50.0 mL。

CYC標(biāo)準(zhǔn)品純度為99%；NaOH 為優(yōu)級(jí)純；其他試劑均為分析純；試驗(yàn)用水為RO 純凈水。

果凍、話梅、菠蘿啤酒樣品采購于當(dāng)?shù)爻小?/p>

1.2 儀器工作條件

起始電位－0.20 V；掃描速率0.40 V·s－1；靜止時(shí)間4 s；掃描次數(shù)3 次；汞柱高度45 cm；量程0～4.0×102nA；測試溫度常溫。

1.3 試驗(yàn)方法

稱取固體樣品果凍約70 g或話梅約15 g，加水約30 mL，用玻棒搗碎后攪拌10 min，濾紙過濾，濾液備用；將20 mL 液體樣品菠蘿啤酒放入50 ℃水浴鍋，保溫20 min除去其中的二氧化碳，冷卻至室溫，備用。

取上述處理好的固(液)體樣品溶液20 mL于50 mL 離心管中，加入10 mL 正已烷，振蕩提取5 min后，以2 000 r·min－1轉(zhuǎn)速離心10 min，收集上清液于50 mL燒杯中，加入30 mL水，于70℃保溫30 min，除去溶液中的正己烷，即得到待測樣品溶液。在10.0 mL 的比色管中依次加入樣品溶液1.0 mL、KMn O4溶液0.10 mL、少量水、NaOH 飽和溶液0.90 mL和SDS溶液0.75 mL，用水稀釋至刻度，搖勻后放入50 ℃恒溫水浴中保溫20 min，冷卻至室溫后倒入10 mL燒杯中，在儀器工作條件下進(jìn)行測定。

2 結(jié)果與討論

2.1 底液的選擇

2.1.1 KMnO4用量

試驗(yàn)通過KMn O4峰電流與CYC 含量的負(fù)相關(guān)性來檢測CYC的，因此KMn O4的濃度需適當(dāng)過量，使其峰電流足夠大，以保證CYC 能與其完全反應(yīng)，但是KMn O4的用量過大，又會(huì)使CYC 對(duì)其消耗量不足，難以造成峰電流的明顯改變，所以KMn O4的用量選擇非常關(guān)鍵。

試驗(yàn)結(jié)果顯示:當(dāng)CYC的質(zhì)量濃度為0.50 g·L－1時(shí)，KMn O4用量分別為0.05，0.10，0.20，0.30，0.40，0.50 mL 時(shí)，峰電流分別為6.000×102，5.969×102，6.000×102，4.188×102，5.938×102，3.344×102nA。由此可見，在KMn O4溶液用量為0.05～0.20 mL 時(shí)，峰電流響應(yīng)最好，綜合考慮，試驗(yàn)選擇KMn O4溶液用量為0.10 mL。

2.1.2 NaOH 飽和溶液用量

KMn O4與CYC 的反應(yīng)只有在強(qiáng)堿性條件下才能進(jìn)行，但堿性太強(qiáng)不僅會(huì)腐蝕試驗(yàn)器皿，還會(huì)使反應(yīng)不再均勻緩和地進(jìn)行。試驗(yàn)考察了CYC 標(biāo)準(zhǔn)溶液的質(zhì)量濃度分別為0.10 g·L－1(低)和0.50 g·L－1(高)時(shí)，不同用量NaOH 飽和溶液對(duì)峰電流的影響，結(jié)果見圖1。

圖1 NaOH 用量對(duì)峰電流的影響Fig.1 Effect of the volume of NaOH solution on the peak current

由圖1可知:在高、低質(zhì)量濃度的CYC 標(biāo)準(zhǔn)溶液中，不同用量的NaOH 飽和溶液對(duì)峰電流的影響趨勢一致，峰電流均隨著NaOH 用量的增加而下降。綜合考慮，試驗(yàn)選擇NaOH 飽和溶液用量為0.90 mL。

2.1.3 表面活性劑的種類和用量

由于表面活性劑可以在溶液中形成膠束，能通過增大待測物在溶液中的溶解度來增大待測物在電極表面的吸附量，對(duì)峰電流具有增敏作用。

試驗(yàn)考察了表面活性劑SDS、十六烷基三甲基溴化銨(CTMAB)和曲拉通(Triton X-100)對(duì)峰電流的的影響。結(jié)果顯示:SDS對(duì)峰電流的影響較明顯。進(jìn)一步對(duì)其用量考察后發(fā)現(xiàn):SDS溶液的用量為0.75 mL時(shí)，對(duì)峰電流具有較大的增敏作用。試驗(yàn)選擇SDS溶液的用量為0.75 mL。

2.2 反應(yīng)溫度和時(shí)間的選擇

試驗(yàn)考察了CYC 標(biāo)準(zhǔn)溶液的質(zhì)量濃度分別為0.10 g·L－1和0.50 g·L－1時(shí)，不同反應(yīng)溫度不同反應(yīng)時(shí)間對(duì)峰電流的影響，結(jié)果見圖2。

圖2 反應(yīng)溫度及時(shí)間對(duì)峰電流的影響Fig.2 Effect of the reaction temperature and time on the peak current

由圖2結(jié)果表明:在50 ℃下反應(yīng)20 min 時(shí)，KMn O4的峰電流最低最穩(wěn)定，反應(yīng)更完全。為兼顧高、低含量CYC 的檢測，試驗(yàn)選擇反應(yīng)溫度為50 ℃，反應(yīng)時(shí)間為20 min。

2.3 儀器工作條件的選擇

試驗(yàn)考察了CYC 標(biāo)準(zhǔn)溶液的質(zhì)量濃度分別為0.10 g·L－1和0.50 g·L－1時(shí)，不同掃描速率(0.10～1.0 V·s－1)、不同掃描次數(shù)(1～8次)、不同靜止時(shí)間(1～10 s)、不同起始電位(－0.20～－0.70 V)、不同汞柱高度(30～55 cm)對(duì)峰電流的影響，優(yōu)化后的儀器工作條件見1.2節(jié)。

2.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線與檢出限

配制質(zhì)量濃度分別為40，60，80，100，110，120，130，140，150，200，250，300，350，400，450，500，550，600，650，700 mg·L－1的CYC標(biāo)準(zhǔn)溶液系列，在儀器工作條件下測定，以CYC 的質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，KMn O4峰電流為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。CYC的質(zhì)量濃度在40～700 mg·L－1時(shí)與峰電流具有很好的曲線擬合關(guān)系，標(biāo)準(zhǔn)曲線的回歸方程為I″p(×102nA)＝－0.010 4ρ3＋0.142 1ρ2－0.645 1ρ＋1.782，相關(guān)系數(shù)為0.990 9，可以用于食品樣品中的CYC含量分析。

按照儀器工作條件對(duì)0.10 g·L－1的CYC標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行連續(xù)10次測定，以峰電流的標(biāo)準(zhǔn)偏差與標(biāo)準(zhǔn)曲線斜率之比計(jì)算該方法的檢出限(3s/k)為5.3 mg·L－1，滿足分析要求。

2.5 精密度與穩(wěn)定性試驗(yàn)

按照儀器工作條件對(duì)0.10 g·L－1和0.50 g·L－1的CYC標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行6次平行測定，計(jì)算測定值的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差分別為1.56%，2.29%，說明本方法精密度較高。

對(duì)分別含有0.10 g·L－1和0.50 g·L－1的CYC標(biāo)準(zhǔn)溶液的樣品溶液的敞開體系和密閉體系的穩(wěn)定性進(jìn)行考察，發(fā)現(xiàn)，敞開體系放置時(shí)間為15～90 min，密閉體系放置時(shí)間為12 h內(nèi)時(shí)，樣品溶液處于穩(wěn)定狀態(tài)，其穩(wěn)定性較好。

2.6 共存物質(zhì)的影響

由于食品基質(zhì)比較復(fù)雜，試驗(yàn)考察了在0.50 g·L－1CYC溶液中添加了食品中可能共存的離子和添加劑后對(duì)峰電流的影響，結(jié)果見表1。

表1 共存物質(zhì)的干擾Tab.1 Interference of coexisting substances

由表1可知:可能共存的離子和添加劑對(duì)試驗(yàn)結(jié)果的測定影響較??；根據(jù)我國GB 2760－2014的規(guī)定，CYC允許添加量為0.65～8.0 g·kg－1，糖精鈉允許添加量為0.15～5.0 g·kg－1，檸檬酸添加量在10 g·kg－1之內(nèi)，均不會(huì)對(duì)CYC 的測定產(chǎn)生干擾。

防腐劑山梨酸鉀、抗壞血酸和水溶性色素如檸檬黃、日落黃、胭脂紅等添加劑因不溶于正己烷而不會(huì)在樣品提取溶液中存在，不影響CYC的測定。

2.7 極譜行為研究

為了確定電極反應(yīng)機(jī)理，按照試驗(yàn)方法配制7種不同混合溶液，并對(duì)其進(jìn)行測定，結(jié)果見圖3。

圖3 不同混合溶液的二階導(dǎo)數(shù)極譜圖Fig.3 Second-order derivate polarogram of different mixture solutions

由圖3可知:在掃描電壓范圍內(nèi)，CYC 會(huì)產(chǎn)生微弱的峰電流，但是其變化無規(guī)律(曲線7)；KMn O4在－1.0 V 附近產(chǎn)生一個(gè)較強(qiáng)的還原峰(曲線1)；NaOH 溶液的還原峰電位在－0.50 V 附近(曲線5)；SDS溶液單獨(dú)存在時(shí)，無還原峰出現(xiàn)(曲線6)；CYC-KMnO4產(chǎn)生的還原峰電流與KMn O4的一致，峰電位因CYC 的影響左移至－0.80 V 附近(曲線2)；當(dāng)加入NaOH 溶液后，二者發(fā)生氧化還原反應(yīng)，－0.80 V 處峰電流顯著降低(曲線4)；加入SDS后，－0.80 V 處的峰電流有一定程度的增大，說明SDS對(duì)峰電流有增敏作用(曲線3)，因此，試驗(yàn)選擇將－0.80 V 處的峰作為定量檢測CYC 含量的極譜峰。

根據(jù)以上的結(jié)論，推斷電極的反應(yīng)機(jī)理為:MnO4－在滴汞電極上會(huì)產(chǎn)生一個(gè)靈敏的還原峰，當(dāng)在堿性溶液中時(shí)，其與CYC 發(fā)生氧化還原反應(yīng)，MnO4－被還原為MnO42－，溶液中MnO4－含量降低，其產(chǎn)生的峰電流下降，根據(jù)峰電流變化間接測定CYC 的含量。電極反應(yīng)機(jī)理見以下反應(yīng)式:MnO4－＋e－→MnO42－。

2.8 電化學(xué)行為研究

根據(jù)試驗(yàn)方法，當(dāng)CYC標(biāo)準(zhǔn)溶液的質(zhì)量濃度為0.50 g·L－1時(shí)，試驗(yàn)考察了不同掃描速率對(duì)峰電流的影響。結(jié)果顯示，在掃描速度為200～1 000 mV·s－1時(shí)，測得的峰電流與掃描速率成正比，其線性回歸方程為:I″p(×102nA)＝0.003 6ν(mV·s－1)＋0.335 3(n＝10)，相關(guān)系數(shù)為0.987 4。由此可推斷，電化學(xué)反應(yīng)過程受吸附控制。

2.9 回收試驗(yàn)

按試驗(yàn)方法先測定果凍、話梅和菠蘿啤酒樣品中CYC的含量，每種樣品平行測定3次，然后在其中加入已知含量的CYC 標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行加標(biāo)回收試驗(yàn)，結(jié)果見表2。

表2 回收試驗(yàn)結(jié)果Tab.2 Results of test for recovery

由表2可知:CYC的回收率為90.0%～110%，說明本方法具有較好的準(zhǔn)確度。

2.10 方法比對(duì)

用本法與文獻(xiàn)[17]報(bào)道的分光光度法對(duì)3種樣品進(jìn)行測定，并對(duì)其測定值進(jìn)行比對(duì)，結(jié)果見表3。

表3 2種方法的結(jié)果比對(duì)(n＝3)Tab.3 Comparison of results obtained by the 2 methods(n＝3)

由表3可知:本法與分光光度法[17]的分析結(jié)果很接近，相對(duì)偏差較小，說明本法具有較高的準(zhǔn)確度。

本工作建立了一種簡易的KMn O4氧化-單掃描示波極譜法間接測定食品中CYC的方法，該方法線性范圍寬，檢出限低，適于甜蜜素含量較高的樣品分析。