李艷花，劉曉琴，牛春紅，黃 芳，薛秀花，徐 芳，張曉娟，尉杰忠△，馬存根，△

（1山西大同大學(xué)腦科學(xué)研究所，神經(jīng)炎癥及變性疾病基礎(chǔ)與應(yīng)用研究山西省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，山西大同037009；2北京師范大學(xué)細(xì)胞增殖及調(diào)控生物學(xué)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京100875；3山西中醫(yī)藥大學(xué)神經(jīng)生物學(xué)研究中心，國(guó)家中醫(yī)藥管理局多發(fā)性硬化益氣活血重點(diǎn)研究室，山西晉中030619）

多發(fā)性硬化（multiple sclerosis，MS）屬于中樞神經(jīng)系統(tǒng)脫髓鞘疾病[1]。有較多研究表明，MS患者中存在著補(bǔ)體的激活[2]。復(fù)發(fā)緩解型和繼發(fā)進(jìn)展型MS患者的腦脊液中C1q水平較對(duì)照組有顯著提升[3]，復(fù)發(fā)的MS患者腦和脊髓組織病灶內(nèi)補(bǔ)體因子B（complement factor B，CFB）和C3b均有高表達(dá)，補(bǔ)體激活在MS病理過(guò)程中的神經(jīng)細(xì)胞、軸突和髓鞘損傷中起著重要的作用，有可能成為MS治療的靶點(diǎn)[4-5]。

線粒體是一種動(dòng)態(tài)的細(xì)胞器，發(fā)動(dòng)蛋白相關(guān)蛋白1（dynamin-related protein 1，Drp1）磷酸化后轉(zhuǎn)移到線粒體，與線粒體分裂蛋白1（mitochondrial fission protein 1，F(xiàn)is1）相互作用，引起線粒體分裂。Drp1的超級(jí)活化會(huì)造成線粒體分裂過(guò)度，形成線粒體碎片導(dǎo)致氧化應(yīng)激、生物能量缺陷和促凋亡因子的釋放，從而介導(dǎo)細(xì)胞損傷[6]。最近，越來(lái)越多的研究發(fā)現(xiàn)，在MS患者血清、腦脊液和中樞神經(jīng)系統(tǒng)病灶區(qū)存在諸多線粒體損傷的現(xiàn)象[7]。線粒體分裂抑制劑1（mitochondrial division inhibitor-1，Mdivi-1）是一種分子量為353.22的有機(jī)小分子化合物，可以通過(guò)血腦屏障進(jìn)入腦內(nèi)，其作用靶點(diǎn)是Drp1蛋白[8]。Mdivi-1通過(guò)抑制Drp1蛋白過(guò)度磷酸化，減少線粒體過(guò)度分裂，在腦缺血、帕金森病[9]、亨廷頓病、肌萎縮側(cè)索硬化、阿爾茨海默病[10]等疾病中都展示出良好的治療效果，但對(duì)MS的治療卻鮮有報(bào)道[11]。

材料和方法

1 材料

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 健康雄性C57BL/6小鼠32只，體重18～20 g，8周齡，從北京維通利華動(dòng)物有限公司購(gòu)買，生產(chǎn)許可證號(hào)為SCXK（京）2019-0008，使用許可證號(hào)為SYXK（晉）2018-0002。

1.2 主要試劑 含0.2%cuprizone的飼料（Envigo）；OCT（optimum cutting temperature）包埋劑（Sakura Finetek）；抗髓磷酯蛋白脂質(zhì)（myelin proteolipid，PLP）抗體（LifeSpan BioSciences）；抗C1q抗體、抗CFB抗體、抗C3b抗體和抗C5b-9抗體（Abcam）；抗半乳糖腦苷脂酶（galactocerebroside，GalC）抗體（Millipore）。

2 方法

2.1 動(dòng)物分組及模型制備 所有動(dòng)物實(shí)驗(yàn)均符合山西大同大學(xué)動(dòng)物倫理委員會(huì)的相關(guān)規(guī)定，盡可能減少動(dòng)物使用量，避免疼痛，清潔級(jí)飼養(yǎng)。上述C57BL/6小鼠飼喂含或無(wú)0.2%cuprizone的飼料[12-14]，從第15天起開(kāi)始給藥處理，共分為4組，每組8只：（1）DMSO正常（DMSO+normal）組（d42），飼喂無(wú)cuprizone的飼料，從第15天起持續(xù)腹腔給予0.1%DMSO水溶液，至第42天麻醉處死；（2）cuprizone模型組（d15），飼喂含cuprizone的飼料15 d，于給藥起始時(shí)處死；（3）DMSO+cuprizone模型組（d42），飼喂含cuprizone的飼料，從第15天起持續(xù)腹腔給予0.1%DMSO水溶液，至第42天麻醉處死；（4）Mdivi-1干預(yù)（Mdivi-1+cuprizone）組（d42），飼喂含cuprizone的飼料，從第15天起持續(xù)腹腔給予Mdivi-1（25 mg·kg-1·d-1，溶解于0.1%DMSO水溶液），至第42天麻醉處死。處理流程見(jiàn)圖1。

2.2 標(biāo)本采集 給藥結(jié)束時(shí)，采用0.3%戊巴比妥鈉每只0.2 mL腹腔麻醉后，斷頸處死，用生理鹽水經(jīng)心臟灌注，再用40 mL的4%多聚甲醛灌注，取腦組織，體外2%多聚甲醛室溫過(guò)夜固定。蔗糖梯度脫水，OCT包埋，于液氮中快速冷凍，冰凍切片機(jī)切片，將各個(gè)實(shí)驗(yàn)組樣本的切片依次粘貼在同一張載玻片上，切片厚度為10 μm（前囟-0.94 mm至-2.18 mm，見(jiàn)圖1），-80℃冰箱中冷藏備用。

2.3 LFB髓鞘染色 使用本實(shí)驗(yàn)室改良的固藍(lán)（Luxol fast blue，LFB）染色流程將上述冰凍切片進(jìn)行染色，具體如下：切片晾干，70%和95%乙醇各浸泡30 s，乙醇∶二甲苯（1∶1）溶液中5 min，純二甲苯中15 min，脫脂；再次在乙醇∶二甲苯（1∶1）溶液、95%乙醇中依次浸泡30 s，除去二甲苯。之后按常規(guī)放入LFB溶液中，57℃恒溫?fù)u床溫育8 h。經(jīng)酒精梯度復(fù)水至70%乙醇，0.05%碳酸鋰2 min，70%乙醇10 min，分化完成。乙醇、二甲苯梯度脫水透明，中性樹(shù)膠封片，顯微鏡下觀察胼胝體（位置如圖1所示）。

Figure 1.Timeline depicting the experimental design for mice exposed to cuprizone and DMSO or Mdivi-1 treatment for 15 d or 42 d.The animals were divided into DMSO+normal group，cuprizone（d15）group，DMSO+cuprizone（d42）group and Mdivi-1+cuprizone（d42）group.圖1 實(shí)驗(yàn)分組及cuprizone處理實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

2.4 免疫熒光染色 將上述冰凍切片晾干，PBS浸洗3次，每次5 min，1%BSA/PBS封閉2 h，用1%BSA/0.3%Triton X-100/PBS稀釋I抗（抗PLP抗體、抗C1q抗體、抗CFB抗體、抗C3b抗體、抗C5b-9抗體和抗GalC抗體），4℃孵育過(guò)夜，PBS洗3次，每次5 min，再加入相應(yīng)的II抗，室溫孵育1.5 h，PBS洗3次。50%甘油封片。未加I抗處理的切片作為陰性對(duì)照。用激光共聚焦顯微鏡采集數(shù)據(jù)。

2.5 TUNEL染色 根據(jù)TUNEL試劑盒說(shuō)明書操作，使用4%多聚甲醛溶液將上述冰凍切片固定10 min，PBS浸洗3次，每次5 min，用1%BSA/0.3%Triton X-100/PBS通透10 min，PBS浸洗3次，在TUNEL熒光素染色液中浸染10 min，PBS浸洗3次，50%甘油封片。用激光共聚焦顯微鏡采集數(shù)據(jù)。

3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

每組8只小鼠，所有實(shí)驗(yàn)均重復(fù)至少3次。使用Image-Pro Plus軟件選取計(jì)數(shù)或面積參數(shù)，對(duì)上述圖片進(jìn)行分析。GraphPad Prism 5軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行單因素方差分析。統(tǒng)計(jì)圖中的數(shù)據(jù)采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（mean±SD）表示，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。用Excel軟件統(tǒng)計(jì)功能中的CORRL工具做兩變量之間的相關(guān)系數(shù)分析。

結(jié) 果

1 Mdivi-1保護(hù)胼胝區(qū)髓鞘免受cuprizone損傷

在模型制備的第42天，麻醉處死所有剩余動(dòng)物，腦組織冰凍切片行LFB髓鞘染色和PLP抗體免疫熒光染色。結(jié)果顯示，與DMSO正常組比較，cuprizone飼喂42 d導(dǎo)致小鼠大腦胼胝體區(qū)的髓鞘明顯丟失，殘留很少[LFB：（28.73±8.78）%；PLP：（20.15±3.77）%]，然而Mdivi-1干預(yù)明顯減少了髓鞘丟失[LFB：（73.16±10.96）%；PLP：（58.88±6.65）%]，LFB髓鞘染色結(jié)果和PLP抗體免疫熒光染色結(jié)果相似，見(jiàn)圖2。

2 Mdivi-1降低Drp1（Ser616）磷酸化水平

Drp1（Ser616）過(guò)度磷酸化會(huì)導(dǎo)致線粒體過(guò)度分裂，導(dǎo)致細(xì)胞損傷。已有研究顯示Mdivi-1能抑制Drp1的過(guò)度磷酸化，起神經(jīng)保護(hù)作用。因此，我們檢測(cè)了Mdivi-1是否能夠抑制Drp1的過(guò)度磷酸化。結(jié)果顯示，DMSO正常組Drp1磷酸化的細(xì)胞較少；cuprizone飼喂15 d導(dǎo)致Drp1磷酸化水平明顯升高，飼喂42 d時(shí)Drp1磷酸化水平達(dá)到高峰，并定位于GalC+的少突膠質(zhì)細(xì)胞；Mdivi-1干預(yù)明顯減少了Drp1磷酸化，見(jiàn)圖3。

3 Mdivi-1干預(yù)明顯減少了細(xì)胞凋亡

前人研究顯示Drp1（Ser616）過(guò)度磷酸化會(huì)引發(fā)細(xì)胞凋亡，因此，我們利用TUNEL試劑盒檢測(cè)了細(xì)胞凋亡情況。結(jié)果顯示，cuprizone飼喂15 d，胼胝體區(qū)出現(xiàn)大量凋亡細(xì)胞，持續(xù)飼喂42 d時(shí)，凋亡細(xì)胞數(shù)減少近50%；Mdivi-1干預(yù)明顯減少了凋亡細(xì)胞的數(shù)目（P＜0.01），見(jiàn)圖4。

4 Mdivi-1抑制少突膠質(zhì)細(xì)胞的補(bǔ)體激活替代通路

Figure 2.Mdivi-1 prevented myelin loss after cuprizone treatment.LFB staining and immunofluorescence of PLP-positive myelin in the corpus callosum of brain，and quantitative analysis of the myelin density were performed.Mean±SD.n=8.**P＜0.01 vs DMSO+normal group；##P＜0.01 vs DMSO+cuprizone group.圖2 Mdivi-1保護(hù)胼胝體髓鞘免受cuprizone誘導(dǎo)的損傷

Figure 3.Mdivi-1 inhibited the phosphorylation of Drp1 on day 42 after cuprizone treatment.Representative microphotographs for p-Drp1（Ser616）+and quantitative analysis were shown.Representative microphotographs for p-Drp1+GalC+cells in the brain of mice were also exhibited.Mean±SD.n=8.**P＜0.01 vs DMSO+normal group；##P＜0.01 vs cuprizone group；△△P＜0.01 vs DMSO+cuprizone group.圖3 Mdivi-1降低cuprizone誘導(dǎo)的少突膠質(zhì)細(xì)胞Drp1磷酸化水平

細(xì)胞死亡的另一個(gè)原因可能與補(bǔ)體激活導(dǎo)致的攻膜復(fù)合體在細(xì)胞膜上組裝相關(guān)。補(bǔ)體活化分為經(jīng)典途徑、替代途徑和凝集素途徑3種。我們采用免疫熒光染色技術(shù)，檢測(cè)了補(bǔ)體通路中重要的成分：C1q、CFB、C3b和C5b-9。結(jié)果顯示，DMSO正常組以上補(bǔ)體分子的表達(dá)量均很低，cuprizone飼喂15 d導(dǎo)致C1q、CFB、C3b和C5b-9表達(dá)量升高，持續(xù)飼喂42 d時(shí)C1q、CFB、C3b和C5b-9表達(dá)量到達(dá)高峰，而Mdivi-1處理明顯降低了CFB、C3b和C5b-9的表達(dá)，但不影響C1q的表達(dá)；再使用免疫熒光雙色標(biāo)記實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，補(bǔ)體分子C1q表達(dá)于Iba-1+的小膠質(zhì)細(xì)胞上，CFB、C3b和C5b-9均定位于GalC+的少突膠質(zhì)細(xì)胞上，見(jiàn)圖5。這說(shuō)明Mdivi-1明顯地抑制了CFB相關(guān)的攻膜復(fù)合體在少突膠質(zhì)細(xì)胞的組裝。

5 Drp1磷酸化水平與補(bǔ)體激活相關(guān)

Figure 4.Mdivi-1 significantly inhibited cell apoptosis in the corpus callosum of the mice（TUNEL staining）.Mean±SD.n=8.*P＜0.05，**P＜0.01 vs DMSO+normal group；##P＜0.01 vs cuprizone group；△△P＜0.01 vs DMSO+cuprizone group.圖4 Mdivi-1抑制胼胝體區(qū)細(xì)胞凋亡

用Excel軟件將不同實(shí)驗(yàn)組的p-Drp1、TUNEL、C1q、CFB、C3b、C5b-9各項(xiàng)檢測(cè)指標(biāo)的陽(yáng)性細(xì)胞面積做線性圖，分析Drp1磷酸化程度與其它檢測(cè)指標(biāo)的相關(guān)系數(shù)。結(jié)果顯示，Drp1磷酸化程度與TUNEL、C1q、CFB、C3b和 C5b-9的相關(guān)系數(shù)分別為 0.27、0.44、0.99、0.98和0.98，可見(jiàn)Drp1磷酸化與TUNEL的相關(guān)系數(shù)最小，而與CFB/C3b/C5b-9補(bǔ)體分子的相關(guān)系數(shù)較大，見(jiàn)圖6。

討 論

cuprizone脫髓鞘模型是國(guó)際上公認(rèn)的研究MS的一種動(dòng)物模型，小鼠喂食cuprizone后，在大腦胼胝體區(qū)可出現(xiàn)明顯的髓鞘丟失和成熟少突膠質(zhì)細(xì)胞減少的現(xiàn)象[15]。2017 年，Luo等[16]的研究顯示體外H2O2、TNF-α處理少突膠質(zhì)細(xì)胞可導(dǎo)致大量的Drp1轉(zhuǎn)移到線粒體；在MS的動(dòng)物模型——實(shí)驗(yàn)性自身免疫性腦脊髓炎（experimental autoimmune encephalomyelitis，EAE）和cuprizone模型小鼠的脊髓和腦組織中也出現(xiàn)Drp1（Ser616）磷酸化程度升高的現(xiàn)象，認(rèn)為Drp（Ser616）的過(guò)度激活與少突膠質(zhì)細(xì)胞損傷直接相關(guān)。P110是一種小分子肽，能抑制Drp1激活，干擾Drp1與Fis1的相互作用，抑制線粒體過(guò)度分裂，減少線粒體碎片化，具有髓鞘保護(hù)作用[16]。Mdivi-1通過(guò)抑制Drp1蛋白過(guò)度磷酸化，減少線粒體過(guò)度分裂，具有保護(hù)線粒體的功能[8]，與P110相似，但由于Mdivi-1是小分子化合物，使用成本更低，應(yīng)用價(jià)值更高。本研究通過(guò)飼喂含cuprizone日常鼠糧，成功造成了小鼠胼胝體的髓鞘脫失，導(dǎo)致磷酸化Drp1陽(yáng)性細(xì)胞增加，凋亡細(xì)胞也增加；與cuprizone模型組（d15）比較，DMSO+cuprizone模型組（d42）胼胝體區(qū)磷酸化Drp1陽(yáng)性細(xì)胞明顯增多，但TUNEL陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)量減少了約50%；Mdivi-1干預(yù)明顯減少了Drp1磷酸化和細(xì)胞凋亡。另外，磷酸化Drp1陽(yáng)性細(xì)胞面積與TUNEL陽(yáng)性細(xì)胞面積的相關(guān)性系數(shù)只有0.27。這些結(jié)果表明，凋亡是cuprizone造成少突膠質(zhì)細(xì)胞早期丟失的原因，但在cuprizone模型晚期，凋亡作用減弱，細(xì)胞凋亡與磷酸化Drp1相關(guān)性較小。那么，在cuprizone模型晚期，Drp1大量激活與什么相關(guān)，該時(shí)期造成髓鞘丟失的主要原因又是什么呢？

前人研究顯示補(bǔ)體途徑激活能導(dǎo)致攻膜復(fù)合體的組裝，在MS發(fā)展過(guò)程中發(fā)揮雙重作用，膜結(jié)合型攻膜復(fù)合體在EAE急性期具有促炎和溶解髓鞘的作用；亞溶解型攻膜復(fù)合體（sublytic C5b-9）則通過(guò)抑制細(xì)胞色素C釋放及caspase-9和caspase-3的激活，促進(jìn)凋亡前體蛋白BAD磷酸化來(lái)減少少突膠質(zhì)細(xì)胞的凋亡，提高其存活率，進(jìn)而發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用[17]。因此，本研究對(duì)補(bǔ)體激活途徑及其終產(chǎn)物的表達(dá)進(jìn)行了分析，結(jié)果顯示cuprizone導(dǎo)致C1q、CFB、C3b和C5b-9的表達(dá)量增加，與cuprizone模型組（d15）比較，DMSO+cuprizone模型組（d42）胼胝體C1q、CFB、C3b和C5b-9表達(dá)量升高更明顯，Mdivi-1干預(yù)明顯降低了CFB、C3b和C5b-9的表達(dá)量，但是沒(méi)有影響C1q的表達(dá)；并且C1q定位于小膠質(zhì)細(xì)胞，而CFB、C3b和C5b-9定位于少突膠質(zhì)細(xì)胞。這些結(jié)果提示，cuprizone處理可以導(dǎo)致少突膠質(zhì)細(xì)胞中補(bǔ)體替代途徑的激活，并導(dǎo)致攻膜復(fù)合體在少突膠質(zhì)細(xì)胞上的組裝。因此，攻膜復(fù)合體的組裝有可能是凋亡之外，cupri-zone模型中少突膠質(zhì)細(xì)胞丟失的另一個(gè)重要原因。另外，磷酸化Drp1陽(yáng)性細(xì)胞面積與CFB、C3b和C5b-9陽(yáng)性細(xì)胞面積的相關(guān)性系數(shù)較大，說(shuō)明Drp1的過(guò)度激活可能與替代途徑補(bǔ)體分子的激活和攻膜復(fù)合體的組裝相關(guān)。目前，未見(jiàn)研究顯示Drp1磷酸化/線粒體失調(diào)在補(bǔ)體激活過(guò)程中起作用。在將來(lái)，探索Drp1過(guò)度激活導(dǎo)致補(bǔ)體激活的信號(hào)通路可能具有重要的意義。

Figure 5.Mdivi-1 significantly inhibited the activation of CFB/C3b/C5b-9 pathway.Observation of C1q，CFB，C3b and C5b-9 positive staining in the corpus callosum of the mice was accessed by immunofluorescence method，and the quantitative analysis was performed.Double immunofluorescence staining for C1q+Iba-1+，CFB+GalC+，C3b+GalC+，and C5b-9+GalC+were showed.Mean±SD.n=8.*P＜0.05，**P＜0.01 vs DMSO+normal group；##P＜0.01 vs cuprizone group；△△P＜0.01 vs DMSO+cuprizone group.圖5 Mdivi-1抑制CFB/C3b/C5b-9補(bǔ)體途徑的激活

綜上所述，我們推測(cè)在cuprizone模型的早期，少突膠質(zhì)細(xì)胞死亡的主要原因是凋亡，其機(jī)制可能與Drp1介導(dǎo)的線粒體通路相關(guān)性較?。欢谀Ｐ偷耐砥?，少突膠質(zhì)細(xì)胞死亡的主要原因可能是補(bǔ)體替代途徑激活的膜結(jié)合型攻膜復(fù)合體的組裝，其機(jī)制可能與Drp1介導(dǎo)的線粒體通路相關(guān)性較大。Mdivi-1干預(yù)可抑制少突膠質(zhì)細(xì)胞凋亡和膜結(jié)合型攻膜復(fù)合體的組裝，起到保護(hù)少突膠質(zhì)細(xì)胞和髓鞘的作用，但其機(jī)制仍需要深入探討。

Figure 6.Analysis of correlation.The trendlines of different detection factors in different groups were shown.The correlation coefficients for p-Drp1 between TUNEL，C1q，CFB，C3b and C5b-9 were 0.27，0.44，0.99，0.98 and 0.98，respectively.圖6 相關(guān)性分析