夏 珺， 俞 婷， 趙 蕾

（重慶醫(yī)科大學(xué)脂糖代謝性疾病重慶市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，脂質(zhì)研究中心，重慶400016）

隨著生活水平的提高，動(dòng)脈粥樣硬化已經(jīng)成為世界范圍內(nèi)血管性死亡的主要原因[1]。在動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)病過(guò)程中，循環(huán)中的單核細(xì)胞黏附于血管壁內(nèi)皮細(xì)胞，分化成為巨噬細(xì)胞，進(jìn)而進(jìn)入內(nèi)膜、吞噬脂質(zhì)，形成泡沫細(xì)胞，因此單核細(xì)胞向巨噬細(xì)胞的分化是動(dòng)脈粥樣硬化病變?cè)缙诘牡湫褪录?。有研究提示通過(guò)抑制單核細(xì)胞向巨噬細(xì)胞的分化可以抑制動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)展[2]，但具體機(jī)制還有待進(jìn)一步研究。

CD36又稱(chēng)脂肪酸轉(zhuǎn)位酶（fatty acid translocase，F(xiàn)AT），是一種廣泛分布于單核細(xì)胞、巨噬細(xì)胞和脂肪細(xì)胞上的膜糖蛋白，屬于B類(lèi)清道夫受體家族。有研究報(bào)道，CD36在單核細(xì)胞向巨噬細(xì)胞的分化過(guò)程中表達(dá)增加[3]。但是CD36的表達(dá)是否會(huì)影響巨噬細(xì)胞的分化還尚未見(jiàn)相關(guān)報(bào)道。因此，本研究擬用人源單核巨噬細(xì)胞THP-1為研究對(duì)象，通過(guò)干擾和過(guò)表達(dá)CD36，探討CD36對(duì)單核細(xì)胞向巨噬細(xì)胞分化過(guò)程的影響及其分子機(jī)制。

材料和方法

1 細(xì)胞株

人源單核細(xì)胞THP-1購(gòu)于美國(guó)模式培養(yǎng)物保存中心（American Type Culture Collection，ATCC）。

2 主要試劑

胎牛血清購(gòu)于UTR；RPMI-1640培養(yǎng)基購(gòu)于Hy-Clone；佛波酯（phorbol 12-myristate 13-acetate，PMA）和牛血清白蛋白（bovine serum albumin，BSA）購(gòu)于Sigma；Trizol RNA抽提試劑盒、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒及SYBR real-time PCR試劑盒購(gòu)于TaKaRa；BCA蛋白檢測(cè)試劑盒、β-actin兔抗人多克隆抗體和結(jié)晶紫購(gòu)于北京鼎國(guó)公司；FAT/CD36兔抗人多克隆抗體購(gòu)于Novus；CD36-PE抗體購(gòu)自BD；細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶（extracellular signal-regulated kinase，ERK）、p-ERK、p-Src和Src兔抗人多克隆抗體購(gòu)于CST；辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的山羊抗兔或鼠IgGⅡ抗購(gòu)于北京中杉金橋公司；PVDF膜購(gòu)于Millipore；ECL化學(xué)發(fā)光試劑購(gòu)于Bio-Rad；引物由北京華大基因公司合成；CD36過(guò)表達(dá)慢病毒購(gòu)于上海吉?jiǎng)P基因化學(xué)有限公司。

3 主要方法

3.1 細(xì)胞培養(yǎng)及傳代 使用含10%（體積分?jǐn)?shù)）胎牛血清、1×105U/L青霉素G和100 mg/L鏈霉素的RPMI-1640完全培養(yǎng)基，將細(xì)胞置于37℃、5%CO2恒溫箱中培養(yǎng)。每天將細(xì)胞吹散，每2 d換液1次，3～4 d傳代1次。

3.2 細(xì)胞誘導(dǎo) 給予0、100和200 μg/L PMA誘導(dǎo)THP-1細(xì)胞，使之分化為貼壁生長(zhǎng)的巨噬細(xì)胞。

3.3 干擾細(xì)胞的CD36表達(dá)CD36小干擾RNA（CD36small interfering RNA，siCD36）由上海生工生物工程公司設(shè)計(jì)并合成，正義鏈為5’-GGCUGUGUUUGGAGGUAUUCUTT-3’，反義鏈為 3’-TTCCGACACAAACCUCCAUAAGA-5’；陰性對(duì)照 scrambled siRNA（scrRNA）也由該公司提供。將THP-1細(xì)胞接種于6孔板，用scrRNA及siCD36分別轉(zhuǎn)染THP-1細(xì)胞：在50 μL RPMI-1640培養(yǎng)基中加入0.25 μL siRNA，短暫輕柔渦旋，加入1 μL RNAiMAX，短暫輕柔渦旋，室溫孵育15 min（15～25 ℃），將轉(zhuǎn)染復(fù)合物逐滴加入到THP-1細(xì)胞中12 h，進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

3.4 構(gòu)建CD36過(guò)表達(dá)細(xì)胞系 采用CD36 cDNA的重組慢病毒轉(zhuǎn)染構(gòu)建CD36過(guò)表達(dá)（CD36OE）細(xì)胞系，或以空載體（vector）作為對(duì)照，然后用嘌呤霉素篩選轉(zhuǎn)染的細(xì)胞，進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

3.5 Western blot實(shí)驗(yàn) 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的THP-1細(xì)胞接種于6 cm皿中常規(guī)誘導(dǎo)24和48 h后收集細(xì)胞，PBS洗滌細(xì)胞3次，加RIPA（含蛋白酶抑制劑，磷酸酶抑制劑），4℃裂解30 min。4℃、12 000×g離心15 min，吸取上清液，BCA法進(jìn)行蛋白定量。經(jīng)8%SDS-PAGE分離蛋白，PVDF膜轉(zhuǎn)膜，3%BSA室溫封閉1 h后，加入抗CD36抗體（1∶1 000）、抗p-ERK抗體（1∶1 000）、抗ERK抗體（1∶1 000）、抗p-Src抗體（1∶1 000）、抗Src抗體（1∶1 000）和抗β-actin抗體（1∶3 000）4℃孵育過(guò)夜，TBST洗膜3次，每次15 min，加Ⅱ抗于37℃搖床中孵育1 h，TBST清洗2次，每次15 min，最后用TBS洗滌1次，化學(xué)發(fā)光劑ECL顯色曝光，采用ImageJ軟件進(jìn)行分析。

3.6 real-time PCR檢測(cè)mRNA水平 使用Trizol提取細(xì)胞總RNA并檢測(cè)其含量和純度。將1 μg總RNA逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，逆轉(zhuǎn)錄條件為：37℃5 min，85℃5 s，4℃5 min后終止。反應(yīng)產(chǎn)物保存于-20℃。取2 μL逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物進(jìn)行real-time PCR，以β-actin為內(nèi)參照，反應(yīng)體系為25 μL。擴(kuò)增條件為：94℃1 min；94℃ 10 s，54℃ 10 s，72℃ 10 s，39個(gè)循環(huán)。記錄Ct值，以2-ΔΔCt計(jì)算目的基因轉(zhuǎn)錄水平。引物序列見(jiàn)表1。

表1 real-time PCR的引物序列Table 1.The sequences of the primers for real-time PCR

3.7 細(xì)胞黏附實(shí)驗(yàn) 結(jié)晶紫染色觀察細(xì)胞黏附情況。將細(xì)胞種于96孔板中，PBS洗2次，附著的細(xì)胞固定在4%的多聚甲醛中5 min。0.5%的結(jié)晶紫在20%的甲醇中溶解，配制成結(jié)晶紫染色液，染色3 min。將細(xì)胞在空氣中干燥，用10%乙酸洗脫，595 nm下分光光度計(jì)檢測(cè)吸光度（A）值。

3.8 細(xì)胞形態(tài)觀察 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的THP-1細(xì)胞接種于6 cm皿中常規(guī)誘導(dǎo)24 h，在普通光學(xué)顯微鏡下拍攝其形態(tài)，用ImageJ處理圖像，求每個(gè)細(xì)胞的相對(duì)表面積（總的細(xì)胞相對(duì)表面積/細(xì)胞數(shù)）。

3.9 流式細(xì)胞術(shù) 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的THP-1細(xì)胞接種于6 cm皿中，給予100 μg/L PMA誘導(dǎo)分化0 h、24 h、48 h和72 h。PBS洗滌細(xì)胞3次，收集細(xì)胞。對(duì)照管不加抗體，向待測(cè)管中加入抗人CD36-PE抗體，常溫下孵育15 min。加入1 mL PBS，流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞表面的CD36表達(dá)。

4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

所有數(shù)據(jù)均采用GraphPad Prism 5統(tǒng)計(jì)分析軟件進(jìn)行處理，所得到的數(shù)值均以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)誤（mean±SEM）表示，兩組之間的差異采用t檢驗(yàn)差異分析，用單因素方差分析通過(guò)Tukey的多重比較檢驗(yàn)對(duì)3組之間的差異進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1 人單核細(xì)胞THP-1向巨噬細(xì)胞分化過(guò)程中CD36表達(dá)增加

給予不同濃度的PMA處理THP-1細(xì)胞，誘導(dǎo)THP-1細(xì)胞向巨噬細(xì)胞分化。巨噬細(xì)胞分化過(guò)程中，細(xì)胞黏附性增加（P＜0.01），見(jiàn)圖1A。采用PMA（100 μg/L）處理THP-1細(xì)胞不同時(shí)間，分別用流式細(xì)胞術(shù)、Western blot和real-time PCR檢測(cè)THP-1細(xì)胞內(nèi)CD36的蛋白和mRNA水平，結(jié)果顯示，在分化過(guò)程中CD36表達(dá)增加（P＜0.01），見(jiàn)圖1B～D。

2 干擾CD36抑制人單核巨噬細(xì)胞THP-1向巨噬細(xì)胞的分化

構(gòu)建敲減CD36基因（CD36i組）和陰性對(duì)照（NCi組）THP-1細(xì)胞，利用real-time PCR和Western blot檢測(cè)CD36的mRNA和蛋白表達(dá)情況。結(jié)果顯示，與NCi組比較，CD36i組CD36的mRNA和蛋白表達(dá)顯著降低（P＜0.05），見(jiàn)圖 2A、B。這表明敲減CD36基因的THP-1細(xì)胞模型建立成功。

在光學(xué)顯微鏡下觀察兩組THP-1細(xì)胞分化過(guò)程中的形態(tài)變化。結(jié)果顯示，與NCi組比較，CD36i組細(xì)胞表面積明顯減?。≒＜0.01），見(jiàn)圖2C；結(jié)晶紫染色法檢測(cè)兩組THP-1細(xì)胞分化過(guò)程中黏附活性差異顯示，CD36i組的THP-1單核細(xì)胞黏附活性明顯小于陰性對(duì)照組（P＜0.01），見(jiàn)圖2D；real-time PCR檢測(cè)兩種THP-1細(xì)胞分化過(guò)程中CD11b和CD80的mRNA表達(dá)，結(jié)果表明CD36i組的THP-1單核細(xì)胞CD11b和CD80的mRNA明顯低于陰性對(duì)照組（P＜0.01），見(jiàn)圖2E、F。

3 過(guò)表達(dá)CD36促進(jìn)人單核巨噬細(xì)胞THP-1向巨噬細(xì)胞分化

構(gòu)建CD36OE THP-1細(xì)胞系，同時(shí)采用vector轉(zhuǎn)染細(xì)胞作為對(duì)照，利用real-time PCR和Western blot檢測(cè)CD36的mRNA和蛋白表達(dá)情況。結(jié)果顯示，與vector組比較，CD36OE組CD36的mRNA和蛋白表達(dá)顯著升高（P＜0.05），見(jiàn)圖3A、B。這表明CD36過(guò)表達(dá)THP-1細(xì)胞系建立成功。

Figure 1.CD36 expression in the process of monocyte-macrophage differentiation.A：THP-1 cells were incubated with PMA（0，100 and 200 μg/L）for 24 h，and the crystal violet absorbance（A）was measured at a wavelength of 595 nm；B：the protein expression of CD36 was analyzed by flow cytometry；C：the mRNA level of CD36 was detected by real-time PCR；D：the protein expression of CD36 was determined by Western blot.Mean±SEM.n=3.##P＜0.01 vs 0 μg/L group；*P＜0.05，**P＜0.01 vs 0 h group.圖1 CD36在單核巨噬細(xì)胞向巨噬細(xì)胞分化過(guò)程中的表達(dá)變化

在光學(xué)顯微鏡下觀察兩種THP-1細(xì)胞分化過(guò)程中的形態(tài)變化。結(jié)果顯示，與vector組比較，CD36OE組細(xì)胞表面積明顯增大（P＜0.05），見(jiàn)圖3C；結(jié)晶紫染色法檢測(cè)兩種THP-1細(xì)胞分化過(guò)程中黏附活性差異，CD36過(guò)表達(dá)組的THP-1單核細(xì)胞黏附活性明顯大于對(duì)照組（P＜0.01），見(jiàn)圖3D；real-time PCR檢測(cè)兩種THP-1細(xì)胞分化過(guò)程中CD11b和CD80的mRNA，結(jié)果顯示，CD36過(guò)表達(dá)組的THP-1單核細(xì)胞CD11b和CD80的mRNA水平明顯高于對(duì)照組（P＜0.01），見(jiàn)圖3E、F。

4 干擾CD36表達(dá)抑制ERK的磷酸化

THP-1細(xì)胞向巨噬細(xì)胞分化過(guò)程中，Western blot檢測(cè)ERK及其磷酸化水平，結(jié)果表明，隨著分化時(shí)間延長(zhǎng)，ERK的磷酸化水平明顯升高（P＜0.05），見(jiàn)圖4A。NCi組和CD36i組的THP-1細(xì)胞向巨噬細(xì)胞分化過(guò)程中，Western blot檢測(cè)p-ERK和ERK的蛋白水平變化，結(jié)果表明干擾CD36表達(dá)后，ERK的磷酸化水平明顯低于對(duì)照組（P＜0.05），見(jiàn)圖4B。

5 干擾CD36表達(dá)抑制Src信號(hào)通路

NCi組和CD36i組的THP-1細(xì)胞向巨噬細(xì)胞分化過(guò)程中，采用Western blot檢測(cè)Src酪氨酸激酶及其磷酸化水平。結(jié)果表明，干擾CD36后，Src的磷酸化水平明顯低于對(duì)照組（P＜0.05），見(jiàn)圖5。

討 論

Figure 2.The effect of CD36 expression knock-down on the differentiation of THP-1 cells into macrophages.THP-1 cells were incubated with PMA（100 μg/L）for 24 h.A：the mRNA expression of CD36 in the THP-1 cells was detected by real-time PCR；B：the protein expression of CD36 in the THP-1 cells was determined by Western blot；C：the optical microscopic images（×400）showed the monocyte adhesion，and the surface area was determined；D：the crystal violet absorbance（A）was measured at a wavelength of 595 nm；E：the mRNA expression of CD11b in the THP-1 cells was detected by real-time PCR；F：the mRNA expression of CD80 in the THP-1 cells was detected by real-time PCR.Mean±SEM.n=3.*P＜0.05，**P＜0.01 vs NCi group.圖2 敲減CD36表達(dá)對(duì)THP-1細(xì)胞向巨噬細(xì)胞分化的影響

既往研究認(rèn)為，單核細(xì)胞向巨噬細(xì)胞的分化在動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)展中起著重要的作用。循環(huán)單核細(xì)胞在暴露于各種調(diào)節(jié)信號(hào)后會(huì)分化為組織巨噬細(xì)胞，并繼續(xù)積累，形成具有黏附性的動(dòng)脈病變斑塊。眾所周知，單核細(xì)胞向巨噬細(xì)胞的分化可以促進(jìn)炎癥和動(dòng)脈粥樣硬化[4]。因此，調(diào)節(jié)單核細(xì)胞向巨噬細(xì)胞的分化可以為炎癥性疾病如動(dòng)脈粥樣硬化提供至關(guān)重要的保護(hù)。

CD36作為B類(lèi)清道夫受體，可識(shí)別較多致炎的內(nèi)源性代謝產(chǎn)物，如氧化低密度脂蛋白、長(zhǎng)鏈脂肪酸、非修飾的脂蛋白和淀粉樣蛋白等[5]，已被認(rèn)為是將機(jī)體的天然免疫和代謝過(guò)程有機(jī)聯(lián)合在一起的重要靶點(diǎn)。既往研究提示，CD36調(diào)控巨噬細(xì)胞遷移、炎癥和介導(dǎo)氧化低密度脂蛋白的攝取，導(dǎo)致泡沫細(xì)胞形成，在動(dòng)脈粥樣硬化發(fā)生發(fā)展中起關(guān)鍵作用[6-7]。人主動(dòng)脈粥樣斑塊中巨噬細(xì)胞上CD36的表達(dá)顯著增加[8]。CD36的異常升高可能是動(dòng)脈粥樣硬化病變發(fā)生和發(fā)展的生物標(biāo)志事件之一。但目前CD36在動(dòng)脈粥樣硬化中的功能是有爭(zhēng)議的，CD36表達(dá)可能存在“最佳保護(hù)窗口”[1]。

本研究發(fā)現(xiàn)，在THP-1細(xì)胞向巨噬細(xì)胞的分化過(guò)程中，CD36的表達(dá)是升高的，與既往的研究結(jié)果一致[3]。單核細(xì)胞向巨噬細(xì)胞分化的一個(gè)重要標(biāo)志是細(xì)胞表面積增大，有偽足樣突起，黏附性增加[9]。分化標(biāo)記物CD11b，CD80的表達(dá)也增加[10-11]。我們發(fā)現(xiàn)干擾CD36后THP-1細(xì)胞向巨噬細(xì)胞的分化減少，表現(xiàn)為細(xì)胞表面積和偽足樣突起減少，粘附能力下降；CD11b和CD80的表達(dá)降低；同時(shí)在CD36過(guò)表達(dá)的THP-1細(xì)胞上，THP-1細(xì)胞向巨噬細(xì)胞的分化增加，表現(xiàn)為細(xì)胞表面積和偽足樣突起增加，黏附能力增強(qiáng)；CD11b和CD80的表達(dá)升高。

ERK1和ERK2是涉及許多細(xì)胞途徑的絲氨酸/蘇氨酸激酶。既往研究表明ERK1/2途徑參與細(xì)胞生長(zhǎng)和分化，ERK1/2完全缺失的骨髓前體細(xì)胞，由于M-CSF無(wú)法通過(guò)ERK傳遞關(guān)鍵的生長(zhǎng)信號(hào)而無(wú)法有效生長(zhǎng)或分化為巨噬細(xì)胞[12]。單核巨噬細(xì)胞中ERK1/2的激活，可通過(guò)影響單核細(xì)胞分化而導(dǎo)致心血管炎癥性疾病，參與動(dòng)脈粥樣硬化的形成[13]。我們發(fā)現(xiàn)單核細(xì)胞分化過(guò)程中ERK的磷酸化水平是升高的，與既往的研究一致[9]。干擾CD36抑制了單核細(xì)胞分化過(guò)程中磷酸化ERK1/2的上調(diào)，并且減少了其向巨噬細(xì)胞的分化，說(shuō)明CD36可能通過(guò)ERK通路調(diào)節(jié)單核細(xì)胞向巨噬細(xì)胞的分化。

Figure 3.The effect of CD36 over-expression on the differentiation of THP-1 cells into macrophages.THP-1 cells were incubated with PMA（100 μg/L）for 24 h.A：the mRNA expression of CD36 in the THP-1 cells was detected by real-time PCR；B：the protein expression of CD36 in THP-1 cells was determined by Western blot；C：the optical microscopic images（×400）showed the monocyte adhesion，and the surface area was determined；D：the crystal violet absorbance（A）was measured at a wavelength of 595 nm；E：the mRNA expression of CD11b in the THP-1 cells was detected by real-time PCR；F：the mRNA expression of CD80 in the THP-1 cells was detected by real-time PCR.Mean±SEM.n=3.*P＜0.05，**P＜0.01 vs vector group.圖3 CD36過(guò)表達(dá)對(duì)THP-1細(xì)胞向巨噬細(xì)胞分化的影響

Figure 4.The effect of CD36 expression knock-down on ERK phosphorylation.A：THP-1 cells were incubated with PMA at 100 μg/L for 0，24 and 48 h，and the protein levels of p-ERK and ERK were determined by Western blot；B：THP-1 cells were incubated with PMA（100 μg/L）for 24 h，and the protein levels of p-ERK and ERK in the THP-1 cells was determined by Western blot.Mean±SEM.n=3.##P＜0.01 vs 0 h group；*P＜0.05 vs NCi group.圖4 敲減CD36表達(dá)對(duì)ERK磷酸化的影響

Figure 5.The effect of CD36 expression knock-down on Src phosphorylation.THP-1 cells were incubated with PMA at 100 μg/L for 24 h after knock-down of CD36，and the protein levels of p-Src and Src in the THP-1 cells were determined by Western blot.Mean±SEM.n=3.*P＜0.05 vs NCi group.圖5 敲減CD36對(duì)Src磷酸化的影響

在許多情況下，CD36介導(dǎo)的細(xì)胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)是由Src家族非受體酪氨酸激酶引發(fā)的。Src家族激酶不僅在腫瘤生物學(xué)中發(fā)揮重要作用，而且還調(diào)節(jié)巨噬細(xì)胞功能，包括在泡沫細(xì)胞形成和促炎性細(xì)胞因子表達(dá)中發(fā)揮作用[14]。Src家族的磷酸化和活化，可進(jìn)一步激活絲裂原激活的蛋白激酶ERK1/2[15]。在本研究中，我們也發(fā)現(xiàn)干擾CD36表達(dá)，抑制THP-1細(xì)胞分化過(guò)程中磷酸化Src的上調(diào)，提示抑制CD36表達(dá)顯著抑制Src通路的活性。

綜上所述，CD36可以激活Src的磷酸化，進(jìn)一步促進(jìn)ERK的磷酸化和活化，最終促進(jìn)單核細(xì)胞向巨噬細(xì)胞的分化。本研究為臨床治療及預(yù)防動(dòng)脈粥樣硬化提供了新的思路。