余 亮，江惠麗，劉豪杰

（湖北省鄂州市中心醫(yī)院消化內(nèi)科，湖北鄂州436000）

潰瘍性結(jié)腸炎是一種病因不明的結(jié)腸和直腸慢性非特異性炎癥性疾病，病變主要累及大腸黏膜及黏膜下層，其病程漫長，常反復(fù)發(fā)作，臨床治療較為困難[1-2]。目前多認為免疫因素在潰瘍性結(jié)腸炎發(fā)生、發(fā)展中起重要作用，免疫干預(yù)治療有顯著的臨床效果[3-4]。

連翹酯苷A（forsythiaside A，F(xiàn)A）是從木犀科植物連翹的干燥果實中提取的中藥單體，具有抗氧化、抗病毒、抗炎及免疫調(diào)節(jié)等多種生物功能[5]。研究表明[6-7]，連翹酯苷A用于治療內(nèi)毒素血癥小鼠具有顯著的免疫調(diào)節(jié)能力，并對內(nèi)毒素誘導(dǎo)的炎癥反應(yīng)起到抑制作用，表現(xiàn)出顯著的抗炎和免疫調(diào)節(jié)作用。然而，連翹酯苷A在潰瘍性結(jié)腸炎中的治療效果尚未見報道。T淋巴細胞是機體免疫反應(yīng)的核心環(huán)節(jié)，其中CD3+、CD4+和CD8+各亞群細胞間比例失調(diào)可導(dǎo)致免疫反應(yīng)紊亂，進而造成炎癥活動或組織損傷，這是潰瘍性結(jié)腸炎發(fā)病及進展的重要機制之一[8]。此外免疫球蛋白和補體水平可反應(yīng)機體免疫應(yīng)答能力。本研究通過建立潰瘍性結(jié)腸炎模型大鼠，從T淋巴細胞亞群、免疫球蛋白、補體等不同方面的免疫功能變化探討連翹酯苷A對潰瘍性結(jié)腸炎大鼠免疫功能的影響及其相關(guān)機制。

材料和方法

1 動物

60只健康清潔級SD大鼠，雌雄不限，購自北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司，許可證號為SCXK（京）2012-0001。飼養(yǎng)環(huán)境為溫度（21±2）℃，相對濕度30%～70%，光照周期12 h/12 h。

2 主要試劑

連翹酯苷A（上海士鋒生物生物科技有限公司，批號L28-120624）；2，4-二硝基氯苯（北京興福精細化學(xué)研究所，批號20070717）；戊巴比妥鈉（上海生化試劑三廠，批號84-06-12）；丙二醛（malondialdehyde，MDA）和超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）檢測試劑盒（碧云天生物技術(shù)研究所）；腫瘤壞死因子α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）、白細胞介素2（interleukin-2，IL-2）和IL-4 ELISA檢測試劑盒（上海酶聯(lián)生物科技有限公司）；抗CD3、CD4和CD8單克隆抗體（北京同立海源生物科技有限公司）；免疫球蛋白（IgA和IgG）檢測試劑盒（中山標佳生物科技有限公司）。

3 方法

3.1 潰瘍性結(jié)腸炎大鼠模型的建立 60只SD大鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)7 d后，隨機分為對照組（control）和模型組（model）。模型組48只大鼠頸背部剃毛后，經(jīng)頸背部滴注2%的2，4-二硝基氯苯丙酮溶液，每天1次，1次5滴，連續(xù)滴注14 d；然后向肛內(nèi)約6 cm處結(jié)腸腔內(nèi)灌注1%的2，4-二硝基氯苯乙醇溶液，每次0.35 mL，每天1次，連續(xù)灌注4 d。對照組12只大鼠給予相應(yīng)藥物溶劑處理，飲食且與模型組相同。模型組大鼠造模后1 d出現(xiàn)不同程度飲食減少、體質(zhì)量減輕、精神萎靡、有膿血黑便、肛周及會陰部潮濕等潰瘍性結(jié)腸炎的表現(xiàn)。隨機處死對照組和模型組各2只，取結(jié)腸標本進行病理檢查，以確認造模成功。

3.2 實驗分組和給藥 于造模結(jié)束后第2天，將模型組大鼠隨機分為4組，即模型組及連翹酯苷A低劑量（low dose of FA，F(xiàn)A-L）、中劑量（middle dose of FA，F(xiàn)A-M）和高劑量（high dose of FA，F(xiàn)A-H）組，每組12只。采用灌胃給藥方式，連翹酯苷A低、中、高劑量組分別給予5 mg/kg、20 mg/kg和80 mg/kg連翹酯苷A，連續(xù)7 d。對照組和模型組給予等體積生理鹽水。

3.3 樣本采集 連翹酯苷A給藥結(jié)束后第2天，各組大鼠稱重后，給予3%戊巴比妥鈉麻醉，股靜脈取血3 mL加入EDTA-K2抗凝管中，分離外周血單個核細胞（peripheral blood mononuclear cells，PBMC）；另取3 mL于EDTA-K2抗凝管中，3 000 r/min離心20 min收集上層血清，保存于-20℃中。采血后，脫頸椎法處死大鼠，取病變結(jié)腸組織，用0.85%氯化鈉沖洗后進行組織勻漿，保存于-80℃。另取大鼠脾臟和胸腺，除盡脂肪等組織后，稱取濕重，計算脾臟指數(shù)和胸腺指數(shù)。脾臟（或胸腺）指數(shù)=脾臟（或胸腺）濕重/大鼠體重×100。

3.4 指標檢測 （1）取大鼠結(jié)腸組織勻漿，采用硫代巴比妥酸反應(yīng)產(chǎn)物比色法檢測組織中MDA含量，采用氮藍四唑顯色法檢測組織中SOD活性。（2）取大鼠PBMC懸液，流式細胞術(shù)檢測CD3+、CD4+和CD8+T淋巴細胞占總T淋巴細胞百分比，并計算CD4+/CD8+比值；采用全自動特定蛋白分析儀（Beckman Coulter IMMAGE 800，免疫比濁法）檢測血清中的IgA和IgG水平；采用全自動化學(xué)發(fā)光免疫分析系統(tǒng)（Beckman Coulter UniCel Dxl 800）及其配套試劑檢測血清補體C3和C4水平。（3）取大鼠血清，ELISA檢測血清中TNF-α、IL-2和IL-4的含量。

4 統(tǒng)計學(xué)處理

應(yīng)用統(tǒng)計學(xué)軟件SPSS 19.0分析實驗數(shù)據(jù)，計量資料用均數(shù)±標準差（mean±SD），兩組間比較采用t檢驗，多組間比較采用單因素方差分析，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié) 果

1 連翹酯苷A對各組大鼠結(jié)腸病理損傷的影響

對照組大鼠結(jié)腸黏膜固有層無炎癥細胞浸潤，隱窩無壞死，上皮結(jié)構(gòu)完整；與對照組比較，模型組大鼠結(jié)腸黏膜固有層伴淋巴細胞、嗜酸性粒細胞和中性粒細胞浸潤，多數(shù)黏膜層出現(xiàn)隱窩膿腫、隱窩炎，表面無上皮覆蓋，結(jié)構(gòu)紊亂，形成潰瘍、萎縮等，提示造模成功；與模型組比較，連翹酯苷A各劑量組大鼠結(jié)腸組織上述病變明顯減輕，黏膜可見再生的黏膜上皮及腺體覆蓋，其中高劑量組效果最好，可見黏膜潰瘍基本痊愈，見圖1。

Figure 1.The effect of FA on the pathological changs of the colon tissues in each group（HE staining，×200）.圖1 連翹酯苷A對各組大鼠結(jié)腸病理損傷的影響

2 連翹酯苷A對各組大鼠免疫器官指數(shù)及結(jié)腸組織中MDA含量和SOD活性的影響

與對照組比較，模型組大鼠脾臟指數(shù)和胸腺指數(shù)降低，結(jié)腸組織中MDA含量升高，SOD活性降低（P＜0.05）；與模型組比較，連翹酯苷A各劑量組大鼠脾臟指數(shù)和胸腺指數(shù)呈劑量依賴性升高，結(jié)腸組織中MDA含量降低，SOD活性增強（P＜0.05），見表1。

表1 連翹酯苷A對各組大鼠免疫器官指數(shù)及結(jié)腸組織中MDA含量和SOD活性的影響Table 1.The effect of FA on immune organ indexes and MDA content and SOD activity in the colon tissues of each group（Mean±SD.n=12）

3 連翹酯苷A對各組大鼠PBMC中CD3+、CD4+和CD8+T淋巴細胞水平的影響

與對照組比較，模型組大鼠PBMC中CD3+、CD4+和CD8+T淋巴細胞水平均降低（P＜0.05），CD4+/CD8+比值降低（P＜0.05）；與模型組比較，連翹酯苷A各劑量組大鼠PBMC中CD3+、CD4+和CD8+細胞的水平及CD4+/CD8+比值呈劑量依賴性升高（P＜0.05），見表2。

表2 連翹酯苷A對各組大鼠PBMC中CD3+、CD4+和CD8+T淋巴細胞水平的影響Table 2.The effect of FA on the levels of CD3+，CD4+and CD8+T-lymphocytes in PBMC of rats in each group（Mean±SD.n=12）

4 連翹酯苷A對各組大鼠血清中IgA、IgG、C3和C4水平的影響

與對照組比較，模型組大鼠血清中IgA和IgG水平升高，C3和C4水平降低（P＜0.05）；與模型組比較，連翹酯苷A各劑量組大鼠血清中IgA和IgG水平呈劑量依賴性降低（P＜0.05），C3和C4水平升高。見表3。

表3 連翹酯苷A對各組大鼠血清中IgA、IgG、C3和C4水平的影響Table 3.The effect of FA on serum levels of IgA，IgG，C3 and C4 in the rats（U/L.Mean±SD.n=12）

5 連翹酯苷A對各組大鼠血清中TNF-α、IL-2和IL-4含量的影響

與對照組比較，模型組大鼠血清中TNF-α和IL-2含量升高（P＜0.05），IL-4含量降低（P＜0.05）；與模型組比較，連翹酯苷A各劑量組大鼠血清中TNF-α和IL-2含量呈劑量依賴性降低（P＜0.05），IL-4含量呈劑量依賴性升高（P＜0.05），見表4。

表4 連翹酯苷A對各組大鼠血清中TNF-α、IL-2和IL-4含量的影響Table 4.The effect of FA on the serum levels of TNF-α，IL-2 and IL-4 in the rats（ng/L.Mean±SD.n=12）

討 論

潰瘍性結(jié)腸炎的發(fā)病機制尚未完全闡明，目前認為在遺傳基因基礎(chǔ)上，外源性物質(zhì)感染腸道引起的異常免疫反應(yīng)是導(dǎo)致結(jié)腸炎性病變的重要原因[9]。本研究采用2，4-二硝基氯苯丙酮和 2，4-二硝基氯苯乙醇溶液建立潰瘍性結(jié)腸炎大鼠模型，發(fā)現(xiàn)連翹酯苷A能有效減輕結(jié)腸病變程度。脾臟和胸腺是機體重要的免疫器官。已有研究表明，潰瘍性結(jié)腸炎大鼠脾臟指數(shù)和胸腺指數(shù)明顯降低，器官免疫能力降低[10]。本研究中模型組大鼠的脾臟指數(shù)和胸腺指數(shù)降低，與文獻報道一致；而經(jīng)連翹酯苷A處理后大鼠脾臟指數(shù)和胸腺指數(shù)明顯升高，提示連翹酯苷A能夠促進潰瘍性結(jié)腸炎模型大鼠的脾臟和胸腺發(fā)育，具有免疫調(diào)節(jié)作用，且以高劑量效果最好。

機體氧自由基過多作用于脂質(zhì)發(fā)生過氧化反應(yīng)，產(chǎn)生的過氧化產(chǎn)物MDA使蛋白質(zhì)變性、交聯(lián)，而損傷DNA，使酶、激素失活進而損傷細胞及細胞膜，是潰瘍性結(jié)腸炎病情進展的重要因素之一[11-12]。本研究結(jié)果顯示，模型組大鼠結(jié)腸組織中MDA含量增加，SOD活性減弱，經(jīng)連翹酯苷A處理后大鼠結(jié)腸組織中MDA含量減少，SOD活性增強，提示連翹酯苷A能有效增強大鼠抗氧化能力從而抑制結(jié)腸組織中脂質(zhì)過氧化反應(yīng)，減輕結(jié)腸黏膜損傷。此外。氧化應(yīng)激產(chǎn)生過量氧自由基可刺激免疫細胞，使免疫細胞功能降低，進而影響機體免疫系統(tǒng)功能[13]。T淋巴細胞是細胞免疫反應(yīng)的重要組成部分，外周血T細胞亞群中CD4+細胞具有協(xié)助B細胞分泌抗體和調(diào)節(jié)其他T細胞免疫應(yīng)答的作用，而CD8+細胞則是主要的細胞毒效應(yīng)細胞[14]。本研究結(jié)果顯示，潰瘍性結(jié)腸炎大鼠PBMC中CD3+、CD4+和CD8+T淋巴細胞百分比及CD4+/CD8+比值降低，說明潰瘍性結(jié)腸炎大鼠機體識別和殺傷毒性細胞的能力下降，細胞免疫功能處于免疫抑制狀態(tài)造成機體免疫能力下降；而經(jīng)連翹酯苷A處理后，CD3+、CD4+和CD8+T淋巴細胞百分比及CD4+/CD8+比值明顯升高，大鼠免疫能力逐漸恢復(fù)，提示連翹酯苷A能夠調(diào)節(jié)T淋巴細胞亞群比例而調(diào)節(jié)潰瘍性結(jié)腸炎大鼠免疫功能，其作用可能與增強大鼠抗氧化能力有關(guān)。

免疫球蛋白是機體免疫防御機制的另一重要組成部分。王艷等[15]報道，潰瘍性結(jié)腸炎患者血清免疫球蛋白異常變化與患者疾病活動度和體液免疫紊亂顯著相關(guān)。但目前對潰瘍性結(jié)腸炎血清免疫球蛋白變化的研究結(jié)論尚不統(tǒng)一。有報道指出，潰瘍性結(jié)腸炎患者血清IgG、IgA和IgM及補體C3和C4水平無明顯變化[16]；也有報道表明，潰瘍性結(jié)腸炎血清IgM水平無明顯變化，而IgG和IgA水平明顯升高[17-18]。本研究結(jié)果顯示，潰瘍性結(jié)腸炎大鼠血清中IgA和IgG水平升高，補體C3和C4水平降低。免疫球蛋白屬于體液免疫，IgA和IgG水平升高提示潰瘍性結(jié)腸炎大鼠體液免疫亢進，可能是對細胞免疫功能降低的代償作用。C3和C4是補體系統(tǒng)的重要分子，在補體活化產(chǎn)生膜攻擊復(fù)合物中起重要作用，其水平降低導(dǎo)致機體吞噬作用受限制、血管通透性下降、細胞溶解作用下降等，使機體免疫力降低[19]。在本研究中，經(jīng)連翹酯苷A處理后，大鼠血清IgA和IgG水平降低，補體C3和C4水平升高，提示連翹酯苷A對潰瘍性結(jié)腸炎大鼠免疫功能具有改善作用。

研究表明，抗炎和促炎因子分泌失衡是潰瘍性結(jié)腸炎患者腸道炎性病變的重要環(huán)節(jié)，促炎因子TNF-α和IL-2水平升高參與細胞免疫和促進腸道炎性反應(yīng)，可造成腸道組織進一步損傷[20-21]。此外機體清除氧自由基能力降低也是促進炎癥發(fā)生的重要因素。IL-4是重要的抗炎因子，可以通過抑制TNF-α和IL-2及其它炎性因子產(chǎn)生、抑制巨噬細胞和淋巴細胞產(chǎn)生和移動、增強SOD活性等來維持腸道免疫功能[22]。本研究結(jié)果顯示，潰瘍性結(jié)腸炎大鼠血清中TNF-α和IL-2含量升高，IL-4含量降低，而經(jīng)連翹酯苷A處理后血清TNF-α和IL-2含量明顯降低，IL-4含量明顯升高，提示連翹酯苷A可能通過促進潰瘍性結(jié)腸炎大鼠IL-4分泌，抑制促炎因子，維持腸道免疫穩(wěn)態(tài)，從而減緩病情發(fā)展。

綜上所述，連翹酯苷A能夠增強潰瘍性結(jié)腸炎大鼠機體氧自由基清除能力，抑制炎癥反應(yīng)，增強機體免疫功能，有效減輕結(jié)腸病變。本研究為連翹酯苷A在潰瘍性結(jié)腸炎臨床治療中的應(yīng)用提供了實驗和理論依據(jù)。