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桑葉魔芋復(fù)配粉對老年鼠高牛肉蛋白飲食全腸道及其蛋白消化酶活性的影響

2020-07-06 13:25鄧?yán)?/span>羅金華張琪鐘耕
食品與發(fā)酵工業(yè) 2020年12期
關(guān)鍵詞:灌胃小腸牛肉

鄧?yán)?,羅金華,張琪,鐘耕,3*

1(西南大學(xué) 食品科學(xué)學(xué)院,重慶,400715)2(重慶市生物技術(shù)研究所有限責(zé)任公司,重慶,401121) 3(西南大學(xué),國家級食品科學(xué)與工程本科實驗教學(xué)示范中心,重慶,400715)

人口老齡化是20世紀(jì)以來全球社會經(jīng)濟(jì)發(fā)展面臨的嚴(yán)峻挑戰(zhàn),我國人口老齡化速度是發(fā)達(dá)國家的2倍[1]。預(yù)計到2040年,我國平均每3個人中就有1位60歲以上老人,如此龐大的老年群體的健康不容忽視[2]。人到老年時期,臟器、消化腺、胃腸蠕動減弱[3],較高的蛋白質(zhì)攝入有利于維持老年機(jī)體健康[4],各個國家都建議老年人每日膳食蛋白量應(yīng)大于推薦量,且優(yōu)質(zhì)蛋白質(zhì)比例應(yīng)盡可能達(dá)到50%[5]。一般認(rèn)為,動物蛋白利用率更高,營養(yǎng)價值更好[6]。牛肉蛋白因其蛋白含量高、脂肪含量低、易消化吸收,是適合老年人食用的健康蛋白食物。但高蛋白飲食對老年人腎臟、肝臟有毒副作用,并刺激老年人腸道產(chǎn)生應(yīng)激反應(yīng)[7],增加老年人機(jī)體負(fù)擔(dān)。通過營養(yǎng)調(diào)控維持腸道免疫處于最佳水平是保證腸道健康、減少疾病、降低經(jīng)濟(jì)損失的重要手段[8-10]。全腸道病理切片能夠連續(xù)性觀察腸道不同位置的形態(tài)結(jié)構(gòu)、黏膜形態(tài)變化,對比不同腸段之間的形態(tài)和病變差異,觀察病理變化所在區(qū)域和大小,具有較好的對比性和可靠性。高蛋白飲食對全腸道組織結(jié)構(gòu)及腸道中的蛋白酶活性有何影響還未見報道。

實驗室前期研究發(fā)現(xiàn)桑葉粉與魔芋粉復(fù)配協(xié)同作用可促進(jìn)腸道蠕動[11-13],調(diào)節(jié)腸道微生物菌群[14-15],增強(qiáng)機(jī)體免疫力[16]。同時,鐘耕等[17]的研究也證實了該復(fù)配粉能夠有效幫助消費者改善對重慶火鍋等高蛋白、高脂飲食的消化性。因此,本研究從動物腸道內(nèi)環(huán)境結(jié)構(gòu)入手,采用全腸道切片觀察技術(shù),就復(fù)配粉對高牛肉蛋白飲食腸道健康的影響進(jìn)行探索,為復(fù)配粉在改善腸道健康,尤其是老年腸道健康方面提供科學(xué)參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

桑葉粉,河南省盧氏縣百瑞蠶茶有限公司,超細(xì)粉,100%過300目篩,水分質(zhì)量分?jǐn)?shù)≤5%,總膳食纖維質(zhì)量分?jǐn)?shù)52.9%,其中可溶性膳食纖維質(zhì)量分?jǐn)?shù)7.9%;魔芋粉(符合NY/T 494—2010中純化魔芋微粉標(biāo)準(zhǔn)),重慶康佳客食品公司,葡甘聚糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)>90%;按照實驗室前期實驗結(jié)果復(fù)配m(桑葉粉)∶m(魔芋粉)=1∶1;鮮牛里脊,重慶永輝超市沙坪壩店。

30只無特殊病原15月齡BALB/c小鼠,雌性,合格證號SCXK(渝)2018-0003。所有實驗用鼠均購于重慶醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心,于西南大學(xué)藥學(xué)院實驗動物中心SPF級屏障動物實驗室飼養(yǎng)。

100 g/L中性甲醛固定液、中性樹脂,國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司;PBS鹽酸緩沖液,北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司;二甲苯,天津致遠(yuǎn)化學(xué)試劑有限公司;蘇木素,珠海貝索生物技術(shù)有限公司,以上試劑均為分析純。小鼠胰蛋白酶ELISA酶檢測試劑盒、小鼠腸肽酶ELISA檢測試劑盒,上海扶生實業(yè)有限公司;其余為實驗室常用化學(xué)試劑,均為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

徠卡-2016轉(zhuǎn)輪式切片機(jī),德國徠卡集團(tuán)有限公司; TSJ-Ⅱ型全自動封閉組織脫水機(jī)、BMJ-Ⅲ包埋機(jī)、PHY-Ⅲ病理組織漂烘儀,常州市中威電子儀器有限公司;BA400 Digital數(shù)碼三目攝像顯微鏡,麥克奧迪實業(yè)集團(tuán)有限公司;Image-Pro Plus 6.0圖像軟件分析儀,美國Media Cybernetics 公司; RT-6100酶標(biāo)儀,美國Rayto公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 牛肉蛋白粉的制備

牛肉蛋白粉的制備參照SONG等[18]的方法,并略作修改。將新鮮牛里脊肉剔除可見結(jié)締組織后切割成一定塊狀大小,于沸水中煮制脫脂,待牛肉全熟后瀝水,50 ℃烘箱中干燥脫水,經(jīng)粉碎過80目篩,收集篩下物,密封低溫保存?zhèn)溆谩K仲|(zhì)量分?jǐn)?shù)1.02%,蛋白質(zhì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)93.50%。

1.3.2 飼料的配制

參照美國營養(yǎng)學(xué)會AIN-93M飼料配方,用牛肉蛋白粉替代部分玉米淀粉制備蛋白質(zhì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)為50%以上的高蛋白飼料,保持飼料能量一致,由南通特洛菲飼料科技有限公司特制。

1.3.3 動物分組及干預(yù)

小鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后隨機(jī)分為6組,每組5只,分別為陰性對照組(negative control group,NC),空白對照組(blank control group,BC)、陽性對照組(positive control group,PC)、高劑量組(high dose group, HD)、中劑量組(middle dose group, MD)和低劑量組(low dose group, LD)。NC組飼喂AIN-93M標(biāo)準(zhǔn)日糧,其他各組飼喂高牛肉蛋白日糧,全部自由進(jìn)食,每日定時灌胃。其中,PC組灌胃江中消食片0.36 g/kg,HD組灌胃復(fù)配粉0.3 g/kg,MD組灌胃復(fù)配粉0.15 g/kg,LD組灌胃復(fù)配粉0.075 g/kg,NC組和BC組分別灌胃同等劑量的生理鹽水。動物實驗室溫度為(23±1)℃,濕度為(53±2)%,每天光照12 h。飼養(yǎng)4周,期間定期更換墊料和水。實驗期間定期對各鼠稱重并記錄體重,密切觀察各鼠一般情況,每天觀察大便性狀。

1.3.4 樣品收集

試驗周期結(jié)束后,小鼠禁食過夜12~14 h,頸椎脫臼處死。完整收集小腸、大腸,用40 g/L多聚甲醛固定,用于腸道形態(tài)切片觀察。完整收集各臟器,用于臟器指數(shù)測定。收集空腸內(nèi)容物,用于酶活性的測定。

1.3.5 臟器指數(shù)計算

根據(jù)小鼠臟器質(zhì)量和體重,按照公式(1)計算各臟器指數(shù)[19]。

(1)

式中:臟器總質(zhì)量,g;體重,g。

1.3.6 小腸、大腸切片觀察

固定組織經(jīng)全自動脫水機(jī)脫水、包埋、切片后按如下步驟操作:

切片脫蠟至水,蘇木精染色10~20 min,自來水沖洗1~3 min,鹽酸酒精分化5~10 s,自來水沖洗1~3 min,放入50 ℃的溫水中返藍(lán),直到出現(xiàn)藍(lán)色為止。自來水沖洗1~3 min,放入85%(體積分?jǐn)?shù))的酒精3~5 min,伊紅染色3~5 min,水洗3~5 s,梯度酒精脫水,二甲苯透明,中性樹膠封固,鏡檢。

以上標(biāo)本均按病理檢驗標(biāo)準(zhǔn)作業(yè)程序(standard operation procedure,SOP)程序進(jìn)行。采用三目攝像顯微攝像系統(tǒng)對切片進(jìn)行圖像采集,每張切片于40倍下觀察全部組織,選擇要測量的區(qū)域并采集100倍圖片待測。

1.3.7 酶活性的測定

腸道內(nèi)容物酶活性的測定參照試劑盒方法。

1.3.8 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析

實驗結(jié)果以均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差表示,用Excel 2010數(shù)據(jù)計算,用Statistix 9單因素方差分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 對小鼠體重的影響

如表1所示,實驗期間各組小鼠進(jìn)食正常,毛皮色澤和活動情況未見異常。

表1 灌胃4周后各組小鼠體重變化情況 單位:g

注:同一行中不同右上標(biāo)小寫字母表示存在顯著性差異(P<0.05)(下同)

從小鼠體重測定結(jié)果可知,隨著飼喂時間的延長,小鼠體重均呈下降趨勢,可能是老年鼠處于生理衰退期,加之魔芋葡甘聚糖有一定的減重作用[20],但體重變化量無顯著性差異。

2.2 對小鼠臟器指數(shù)的影響

心、肝、脾、肺、腎是動物體內(nèi)重要的免疫中心和代謝器官,臟器指數(shù)是實驗動物某臟器的質(zhì)量與體重的比值,是衡量機(jī)體生長狀況的重要指標(biāo),也是毒理實驗中常用的指標(biāo),正常時臟器指數(shù)比較恒定[15]。本研究中,高蛋白膳食組小鼠與NC組各臟器指數(shù)無顯著性差異,小鼠各臟器指數(shù)的質(zhì)量變化不顯著。表明各實驗組飲食方式對實驗動物機(jī)體沒有毒副作用。

表2 高牛肉飼料對小鼠臟器指數(shù)的影響 單位:%

2.3 對小腸形態(tài)的影響

小腸是食物消化與吸收的主要場所,分十二指腸、空腸、回腸,腸絨毛是黏膜上皮中柱狀細(xì)胞游離面的細(xì)微突起,皺襞、絨毛和微絨毛的存在,極大地擴(kuò)大了小腸黏膜的面積[21]。

由圖1可知,NC組小鼠十二指腸黏膜層腸絨毛結(jié)構(gòu)完整,黏膜表面被覆單層柱狀上皮,固有層內(nèi)管狀腸腺結(jié)構(gòu)清晰,間質(zhì)內(nèi)未見明顯炎細(xì)胞浸潤及纖維增生。黏膜下層疏松結(jié)締組織內(nèi)可見血管和神經(jīng),肌層及外膜無炎細(xì)胞浸潤,其他亦未見明顯病理變化。BC組部分腸絨毛萎縮,上皮脫落,固有層內(nèi)部分腸腺萎縮壞死,其他未見明顯病理變化。PC組、HD組、MD組及LD組無病理變化,與NC組無差異。

a-NC組;b-BC組;c-PC組;d-HD組;e-MD組;f-LD組
圖1 對老年鼠十二指腸組織形態(tài)的影響(200×)
Fig.1 Effect on duodenal tissue morphology of old mice
注:圖b中↑表示上皮脫落(圖2同)

由圖2可知,NC組小鼠空腸黏膜層腸絨毛結(jié)構(gòu)完整,杯狀細(xì)胞數(shù)量正常,固有層內(nèi)管狀腸腺結(jié)構(gòu)清晰,其他亦未見明顯病理變化。BC組黏膜層、黏膜下層、肌層和漿膜層分層較清晰,少量黏膜上皮脫落,其他未見明顯病理變化。PC組、HD組、MD組及LD組與NC組無顯著性差異。

a-NC組;b-BC組;c-PC組;d-HD組;e-MD組;f-LD組
圖2 對老年鼠空腸組織形態(tài)的影響
Fig.2 Effect on jejunal morphology of old mice

由圖3可知,NC組回腸黏膜層腸絨毛結(jié)構(gòu)、黏膜上皮完整,固有層內(nèi)管狀腸腺結(jié)構(gòu)清晰,其他未見明顯病理變化。BC組回腸絨毛黏膜層結(jié)構(gòu)基本完整,少量腸絨毛斷裂,黏膜上皮脫落,其他未見明顯病理變化。PC組回腸黏膜層腸絨毛結(jié)構(gòu)完整,偶見少量黏膜上皮細(xì)胞脫落,其他未見明顯病理變化。HD組、MD組、LD組與NC組無顯著性差異。

a-NC組;b-BC組;c-PC組;d-HD組;e-MD組;f-LD組
圖3 對老年鼠回腸組織形態(tài)的影響
Fig.3 Effect on ileum morphology of old mice
注:圖b中↑表示絨毛斷裂

由老年鼠小腸(十二指腸、空腸、回腸)切片觀察可知高牛肉蛋白飲食會導(dǎo)致腸絨毛斷裂、萎縮、上皮脫落、固有層內(nèi)部分腸腺萎縮壞死,而復(fù)配粉和消食片均能改善老年鼠高牛肉蛋白飲食對小腸造成的傷害,未見明顯病理變化。

小腸表面積的大小直接反映小腸吸收功能,絨毛和隱窩的形態(tài)特征是反映上皮細(xì)胞的成熟及吸收功能最常用指標(biāo),絨毛越長、隱窩越淺,腸道消化吸收營養(yǎng)物質(zhì)的能力越強(qiáng)[22]。絨毛高度(V)/隱窩深度(C)值是小腸功能狀態(tài)的一種反應(yīng),V/C值與黏膜狀態(tài)成正比[23]。由表3可知,灌胃復(fù)配粉組小腸組織各項指標(biāo)較BC組顯著較優(yōu)(P<0.05),特別是HD組絨毛高度和肌層厚度顯著性大于NC組(P<0.05),V/C值與NC組差異不顯著。可能是因為牛肉蛋白中谷氨酸、精氨酸含量較高,谷氨酸含量達(dá)30 000 mg/kg,而谷氨酸能夠顯著改善小腸的吸收功能[24],精氨酸可提高小腸絨毛高度和空腸麥芽糖酶活性,降低隱窩深度,使小腸形態(tài)結(jié)構(gòu)與吸收功能得到改善[22]。并且,復(fù)配粉中的魔芋粉可促進(jìn)腸道蠕動[16],魔芋膠可對腸道壁形成保護(hù)膜,具有腸道益生性[14]。因此,復(fù)配粉能夠提高小腸各項指標(biāo)性能,維持腸道屏障的完整性,改善高牛肉蛋白飲食對老年鼠小腸造成的傷害,保護(hù)腸道結(jié)構(gòu),且呈量效關(guān)系。

表3 小腸組織測定結(jié)果Table 3 The results of small intestine tissue

2.4 對老年鼠大腸組織形態(tài)的影響

大腸包括盲腸、結(jié)腸和直腸,主要功能是吸收水分、無機(jī)鹽,并進(jìn)行纖維素的發(fā)酵和分解。大腸黏膜包括黏膜上皮、黏膜下層、肌層、外膜[21]。

由圖4可知,各組小鼠盲腸結(jié)構(gòu)較完整,黏膜表面被覆柱狀上皮且光滑無絨毛,固有層內(nèi)大腸腺排列較為密集,肌層結(jié)構(gòu)完整清晰,漿膜層完整,其他未見明顯病理改變。

a-NC組;b-BC組;c-PC組;d-HD組;e-MD組;f-LD組
圖4 對高牛肉蛋白飲食老年鼠盲腸組織形態(tài)的影響(200 ×)
Fig.4 Effect of high beef protein diet on the cecum morphology of old mice

由圖5可知,NC組小鼠結(jié)腸黏膜層柱狀上皮細(xì)胞形態(tài)正常,固有層內(nèi)大腸腺排列較為密集,杯狀細(xì)胞數(shù)量正常,肌層肌纖維結(jié)構(gòu)完整清晰,漿膜層完整,其他未見明顯病理改變。BC組黏膜層厚度不均一,部分黏膜上皮缺失,少量腸腺萎縮,局部固有層內(nèi)炎細(xì)胞浸潤,主要為淋巴細(xì)胞;其他未見明顯病理變化。PC組、HD組、MD組及LD組與NC組無顯著性差異。

a-NC組;b-BC組;c-PC組;d-HD組;e-MD組;f-LD組
圖5 對高牛肉蛋白飲食老年鼠結(jié)腸組織形態(tài)的影響(200×)
Fig.5 Effect of high beef protein diet on colonic morphology of old mice
注:圖b中↑表示炎細(xì)胞浸潤,表示腸腺萎縮

由圖6可知,各組小鼠直腸結(jié)構(gòu)較完整,固有層內(nèi)大腸腺結(jié)構(gòu)完整清晰,黏膜下層、肌層及漿膜層完整,其他未見明顯病理改變。

a-NC組;b-BC組;c-PC組;d-HD組;e-MD組;f-LD組
圖6 對高牛肉蛋白飲食老年鼠直腸組織形態(tài)的影響(200×)
Fig.6 Effect of high beef protein diet on the rectum morphology of old mice

高蛋白飲食降低腸道內(nèi)短鏈脂肪酸的產(chǎn)生,提高氨、苯酚、硫化氫濃度,可引起結(jié)腸炎,也影響腸道神經(jīng)系統(tǒng)和腸動力,繼而引發(fā)感染和腫瘤的形成[22-23]。通過對老年鼠大腸(盲腸、結(jié)腸、回腸)切片觀察說明高蛋白飲食對老年鼠結(jié)腸存在一定的傷害,這與前人的研究結(jié)果一致。復(fù)配粉能促進(jìn)高蛋白飲食老年鼠大腸腸道健康,可能是因為蛋白質(zhì)消化主要發(fā)生在小腸,而大腸參與部分蛋白質(zhì)消化,且主要靠微生物發(fā)酵作用分解蛋白質(zhì)[14, 25]。

2.5 對蛋白質(zhì)消化酶活性的影響

小腸是蛋白質(zhì)消化的主要部位[25-26],蛋白質(zhì)在小腸內(nèi)消化主要依賴胰腺分泌的各種蛋白酶,包括內(nèi)肽酶(胰蛋白酶、糜蛋白酶和彈性蛋白酶)和外肽酶(氨基肽酶和羧基肽酶)[27]。本研究選取在蛋白質(zhì)消化中起主要作用的胰蛋白酶、腸肽酶,其活性測定結(jié)果如表4所示。

表4 各組小鼠腸道酶活性 單位:U/g

消化酶活性的高低是反映機(jī)體消化機(jī)能的重要生理指標(biāo)[28-29],在一定范圍內(nèi),隨著日糧蛋白質(zhì)水平的提高,動物胃蛋白酶、腸道、肝臟胰蛋白酶活性均顯著上升[30-31]。由表4可知,隨著高蛋白飲食的攝入,胰蛋白酶和腸肽酶活性顯著上升,是NC組的1倍以上,說明老年鼠攝入高蛋白,對消化酶活性具有一定的激活作用,這與前人的研究結(jié)果一致。雖然由2.3得出高蛋白飲食對小腸組織有一定的不利影響,但不影響腸道蛋白酶活性。而灌胃復(fù)配粉后,酶活性有降低趨勢,特別是HD組和MD組,胰蛋白酶和腸肽酶活性顯著降低,說明復(fù)配粉的灌胃對蛋白質(zhì)消化有顯著性影響,并呈現(xiàn)劑量關(guān)系。有研究表明,當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)攝入量在一定范圍內(nèi)升高,動物能通過自身機(jī)體調(diào)節(jié)酶活性以適應(yīng)消化相應(yīng)的蛋白水平,當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)含量超過消化器官承載負(fù)荷后,會對消化酶的分泌產(chǎn)生負(fù)反饋調(diào)節(jié)[30-31],并且由2.3得出,復(fù)配粉對高牛肉蛋白飲食老年鼠腸道形態(tài)變化有修復(fù)作用。因此,酶活性降低的原因可能是復(fù)配粉的灌胃使得腸道結(jié)構(gòu)改善,消化吸收能力變強(qiáng),也可能是復(fù)配粉的灌胃使得腸道微生物菌群發(fā)生變化,促進(jìn)了蛋白質(zhì)的消化吸收[32],使得食物中蛋白質(zhì)的濃度降低,使機(jī)體誘導(dǎo)蛋白質(zhì)消化酶的活性適應(yīng)性降低。小腸蛋白酶活性變化可能與小腸所處的狀態(tài)和食物的種類密切相關(guān)。

3 結(jié)論

復(fù)配粉對高牛肉蛋白飲食老年鼠腸道形態(tài)變化有修復(fù)作用,起到保護(hù)腸道結(jié)構(gòu)的功能。其改善機(jī)理有待進(jìn)一步研究。

高蛋白飲食能刺激老年鼠腸道內(nèi)的蛋白質(zhì)消化酶活性顯著上升,而復(fù)配粉能夠降低機(jī)體蛋白質(zhì)消化酶的活性,其降低機(jī)理有待進(jìn)一步研究。

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