黃靜雅 張 禹 樸美蘭 魏福安 李曉艷 李喜升

(遼寧省蠶業(yè)科學(xué)研究所,遼寧鳳城 118100)

多肽作為一種蛋白質(zhì)形式，具有低抗原性、易吸收、抗氧化、降血壓等特點(diǎn)[1]，其來源主要有動(dòng)植物蛋白、微生物蛋白[2]。目前，制備多肽方法主要有酸水解法、堿水解法、酶水解法、合成法等[3]，其中，蛋白酶水解法因其反應(yīng)條件溫和、易于控制，目前利用蛋白酶水解法制備多肽的研究眾多，但這些研究主要以農(nóng)產(chǎn)品、水產(chǎn)品以及桑蠶蛹為主要研究對(duì)象[4-7]，而關(guān)于柞蠶蛹制備多肽的研究則鮮見報(bào)道[8-12]。此外，這些研究大都圍繞酶解工藝展開，對(duì)酶解產(chǎn)物的后續(xù)處理的研究相對(duì)較少，改良蠶蛹酶解產(chǎn)物的色澤和風(fēng)味主要采用活性炭、β-環(huán)糊精吸附法等[13]，這些方法操作繁瑣還容易造成活性炭污染，尤其是蠶蛹酶產(chǎn)物的苦味、澀味等不良風(fēng)味問題沒有得到根本的解決。相關(guān)研究表明，酶解產(chǎn)物的風(fēng)味等宏觀評(píng)價(jià)指標(biāo)直接影響著多肽下游產(chǎn)品的品質(zhì)，在滅酶的過程中添加適量的檸檬酸可以改良的苦味和澀味、提升酶解液的總體風(fēng)味且不會(huì)造成營養(yǎng)的損失[14]。我國柞蠶蛹年產(chǎn)量巨大，但關(guān)于柞蠶蛹的研究報(bào)道在數(shù)量和技術(shù)性方面卻遠(yuǎn)不及桑蠶蛹。因此研究柞蠶蛹蛋白的酶解和后續(xù)工藝可完善酶法制備柞蠶蛹多肽工藝流程，控制柞蠶蛹多肽品質(zhì)，從而拓展其在食品、飲料工業(yè)、以及保健品行業(yè)的應(yīng)用。

本文以脫脂柞蠶蛹為原料，采用蛋白酶酶解制備柞蠶蛹多肽，考察了酶試劑種類對(duì)水解度和多肽含量的影響、單因素酶解條件對(duì)水解度的影響，結(jié)合Box-Behnken中心組合設(shè)計(jì)原理對(duì)酶解工藝參數(shù)進(jìn)行響應(yīng)面優(yōu)化。在滅酶過程中添加適量的檸檬酸量，用透析法除鹽，通過微濾后真空干燥獲得柞蠶蛹粉，并對(duì)其進(jìn)行了感官評(píng)價(jià)，現(xiàn)將相關(guān)結(jié)果報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 材料試劑與儀器設(shè)備

脫脂柞蠶蛹粉(實(shí)驗(yàn)室自制)，中性蛋白酶、堿性蛋白酶、木瓜蛋白酶、胰蛋白酶、風(fēng)味蛋白酶、復(fù)合蛋白酶(丹麥諾維信公司)，其他常用試劑均為分析純，透析袋截留分子量500 D。ST -16R ThermoFisher高速冷凍離心機(jī)(賽默飛世爾科技有限公司)，722分光光度計(jì)(上海精密科學(xué)儀器有限公司)，HJ-6A多頭磁力加熱攪拌器 (江蘇科析儀器有限公司)，高速萬能粉碎機(jī) (天津市泰斯特儀器有限公司)，SZ-93自動(dòng)雙重純水蒸餾器(上海亞榮生化儀器廠)。

1.2 方法

1.2.1 柞蠶蛹脫脂蛋白粉制備

新鮮柞蠶蛹經(jīng)漂洗水煮后除去內(nèi)臟和蛹皮，熱風(fēng)干燥后粉碎，在50 ℃條件下用石油醚經(jīng)索氏抽提器中提取6 h脫除脂肪，干燥箱中揮發(fā)溶劑，磨細(xì)過80目篩，制得柞蠶蛹脫脂蛋白粉密封后于-18 ℃條件下儲(chǔ)存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 柞蠶蛹多肽制備

取適量預(yù)處理后蠶蛹蛋白粉于錐形瓶中，添加雙蒸水使液料比為20∶1，將錐形瓶置于磁力加熱攪拌器攪拌加熱，待溫度恒定至50 ℃，調(diào)節(jié)pH至酶解最適pH值后添加2%的蛋白酶(以脫脂蛋白粉計(jì))，恒溫酶解6 h，反應(yīng)過程中用0.5 mol/L的鹽酸和氫氧化鈉調(diào)節(jié)使pH保持在最適值范圍，酶解完成后90 ℃以上水浴滅酶20 min，5 000 r/min離心10 min，取上清液定容至120 mL，制得的蠶蛹蛋白多肽液于4 ℃儲(chǔ)存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3 酶解試驗(yàn)

1.2.3.1 酶試劑的確定

分別用中性蛋白酶、堿性蛋白酶、木瓜蛋白酶、胰蛋白酶、風(fēng)味蛋白酶和復(fù)合蛋白酶酶解預(yù)處理后的柞蠶蛹蛋白，固定酶解條件為50 ℃、6 h、pH7.0(堿性蛋白酶pH8.5)，測定水解度和多肽含量，每組實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，取3次實(shí)驗(yàn)的平均值。

1.2.3.2 酶解單因素試驗(yàn)

為了考察各因素對(duì)酶解液水解度的影響，選擇兩種較為適宜的酶試劑進(jìn)行柞蠶蛹多肽制備試驗(yàn)，在探討的影響因素基礎(chǔ)上，保持其他的參數(shù)不變即液料比15∶1、酶添加量2%(以脫脂柞蠶蛹粉計(jì))、酶解溫度50 ℃、反應(yīng)時(shí)間6 h、pH7.0進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，測定水解度。因素與水平如表1，所有實(shí)驗(yàn)進(jìn)行3次重復(fù)，取結(jié)果的平均值。

表1 酶解工藝試驗(yàn)因素與水平

1.2.3.3 響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

為進(jìn)一步研究各變量之間交互作用的影響關(guān)系，使用響應(yīng)面分析法篩選最佳酶解工藝。每個(gè)單因素的初步研究是響應(yīng)面優(yōu)化的指導(dǎo)范圍，運(yùn)用根據(jù)Box-Benhnken的中心組合試驗(yàn)設(shè)計(jì)原理，在固定pH7.0，酶添加量2%(中性蛋白酶∶復(fù)合蛋白酶=1∶1)的條件下，選擇對(duì)水解度有顯著影響的三個(gè)因素：液料比A、反應(yīng)時(shí)間B、反應(yīng)溫度C進(jìn)行三因素三水平的響應(yīng)面分析試驗(yàn)。響應(yīng)面試驗(yàn)因素水平見表2。

表2 響應(yīng)面試驗(yàn)因素水平和編碼

1.2.4 檸檬酸對(duì)酶解液品質(zhì)的影響

在液料比15∶1，50 ℃，pH7.0條件下添加2%的中性蛋白酶酶解4 h，酶解完成后向酶解液中添加適量檸檬酸煮沸30 min滅酶，4 000 r/min離心10 min取上清液4 ℃保存待測。研究檸檬酸添加量分別為0%、0.5%、1%、2%(以酶解液質(zhì)量計(jì))時(shí)上清液中氨基酸態(tài)氮的含量，以及對(duì)酶解液鮮味、苦味、澀味和酸味的影響[9]。

1.2.5 酶解液的精制

1.2.5.1 脫鹽

酶解液在4 ℃條件下透析48 h，透析過程中適時(shí)更換溶液。

1.2.5.2 濃縮干燥

微濾器微濾除去酶解液中的大分子蛋白，獲得的澄清透明的蠶蛹多肽液，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮后于真空干燥箱中烘干得柞蠶蛹多肽粉[14]。

1.2.5.3 蠶蛹多肽品質(zhì)

采用模糊感官評(píng)價(jià)法對(duì)所得柞蠶蛹多肽粉顏色、滋味與氣味、雜質(zhì)幾個(gè)方面進(jìn)行感官評(píng)價(jià)；由5男5女共10人組成評(píng)價(jià)小組，按表3進(jìn)行綜合感官評(píng)價(jià)。

表3 感官評(píng)價(jià)評(píng)分指標(biāo)

1.2.6 指標(biāo)測定方法

1.2.6.1 水解度的測定

水解度/%=(酶解液中氨基態(tài)氮含量/樣品中總氮量)×100

氨基態(tài)含量測定：甲醛電位滴定法[15]

樣品中總氮量測定：凱氏定氮法[16]

1.2.6.2 多肽含量的測定

以標(biāo)準(zhǔn)結(jié)晶牛血清清蛋白為標(biāo)準(zhǔn)蛋白溶液繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線； 取2 mL酶解液加入2 mL 15%的三氯乙酸混勻后靜置沉淀10 min，5 000 r/min離心10 min，取上清用雙縮脲法[17]測定吸光值，代入標(biāo)準(zhǔn)曲線測定多肽含量。

2 結(jié)果與分析

2.1 酶試劑種類對(duì)水解度和多肽含量的影響

由圖1可知中性蛋白酶、堿性蛋白酶、風(fēng)味蛋白酶、木瓜蛋白酶和復(fù)合蛋白酶的酶解產(chǎn)物擁有較高的水解度，水解度的高低與蛋白酶酶切位點(diǎn)有關(guān)。胰蛋白酶的特異性強(qiáng)，主要裂解賴氨酸和精氨酸的羧基端化學(xué)鍵，造成酶解物水解度較其他蛋白酶低[18]；而中性蛋白酶和復(fù)合蛋白酶酶解作用下的產(chǎn)物多肽含量較高，因此本研究選用中性蛋白酶和復(fù)合蛋白酶進(jìn)行酶解條件試驗(yàn)，考察其在不同的液料比、酶添加量、反應(yīng)溫度和反應(yīng)時(shí)間條件下酶解液的水解程度。

2.2 兩種蛋白酶單因素酶解條件結(jié)果

不同酶解條件下中性蛋白酶、復(fù)合蛋白酶酶解產(chǎn)物的水解度見圖2。

圖2A所示，兩種蛋白酶在6 h反應(yīng)時(shí)間內(nèi)，隨著液料比的減小，酶解產(chǎn)物的水解度呈增大趨勢，由于底物濃度越大，單位時(shí)間內(nèi)可供酶作用的位點(diǎn)越多，酶的催化越能夠充分發(fā)揮作用。但當(dāng)液料比小于15∶1時(shí)，復(fù)合蛋白酶水解度緩慢下降，液料比小于10∶1時(shí)，中性蛋白酶水解度呈下降趨勢，這可能是由于底物濃度過高影響了蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的充分伸展，進(jìn)而降低了酶解速率，底物濃度過大會(huì)造成生產(chǎn)成本的提高，因此在后續(xù)實(shí)驗(yàn)中選擇液料比15∶1進(jìn)行單因素酶解實(shí)驗(yàn)。

圖2B所示，兩種酶的添加量越大，酶解產(chǎn)物的水解度越大，由于料液比值固定，酶添加量越多，酶與底物上的酶切位點(diǎn)作用接觸的幾率增加反應(yīng)速率加快；中性蛋白酶和復(fù)合蛋白酶分別在添加量大于2%和3%時(shí)，水解度的增大趨勢變緩。這可能是因?yàn)榉磻?yīng)底物上可供酶切位點(diǎn)并沒有隨著酶添加量的增大而增加，但大量的酶催化底物發(fā)生反應(yīng)所得產(chǎn)物濃度升高卻導(dǎo)致了水分活度的下降，使反應(yīng)速率下降[15]?？紤]成本因素，中性蛋白酶的酶添加量2%較為適宜，復(fù)合蛋白酶的添加量應(yīng)控制在3%以下。

由圖2C可知，隨著反應(yīng)溫度的提高，酶解產(chǎn)物的水解度呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢，反應(yīng)溫度為50 ℃時(shí)兩種酶水解度最高。溫度上升，反應(yīng)體系中水分活度提高使反應(yīng)加劇，同時(shí)酶活性增大，二者協(xié)同提高了反應(yīng)速率。但因酶催化有其適宜溫度范圍，溫度過高會(huì)使酶失活，造成反應(yīng)速率下降。因此50 ℃是中性蛋白酶和復(fù)合蛋白酶適宜的反應(yīng)溫度。

由圖2D可知，水解度與反應(yīng)時(shí)間成正比。復(fù)合蛋白酶在6 h后酶解產(chǎn)物水解度提升速度減緩，中性蛋白酶的酶解液水解度在10 h后提升變慢。這說明隨著酶解反應(yīng)的進(jìn)行，酶產(chǎn)物的大量積累對(duì)酶解產(chǎn)生了反饋抑制。在實(shí)際生產(chǎn)中，可根據(jù)目標(biāo)產(chǎn)物要求，通過控制酶解反應(yīng)時(shí)間達(dá)到適度水解或者深度水解目的。

2.3 響應(yīng)面優(yōu)化酶解工藝條件結(jié)果與分析

2.3.1 響應(yīng)面擬合回歸方程的建立

為探究柞蠶蛹多肽制備最佳工藝參數(shù)，根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果，采用Box-Behnken設(shè)計(jì)原理對(duì)酶解工藝條件進(jìn)行優(yōu)化，實(shí)驗(yàn)結(jié)果和各因素相互效應(yīng)圖見表4和圖3-5。

表4 試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果

利用Design-Expert 10.0軟件對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，得到水解度Y、液料比A、反應(yīng)時(shí)間B和反應(yīng)溫度C的多元二次回歸方程：

Y=29.97+6.86A+1.49B-0.99C+0.34AB-1.61AC-0.45BC-0.63A2-1.67B2-1.18C2

2.3.2 響應(yīng)面擬合回歸方程的方差分析結(jié)果

表5 響應(yīng)面擬合回歸方程的方差分析結(jié)果

2.3.3 響應(yīng)面模型的驗(yàn)證試驗(yàn)

為進(jìn)一步確定柞蠶蛹多肽最優(yōu)加工工藝，根據(jù)Design-Expert 10.0軟件運(yùn)行結(jié)果，水解度在液料比、反應(yīng)時(shí)間和反應(yīng)溫度的共同影響下的最優(yōu)提取工藝為：液料比19.79∶1、反應(yīng)時(shí)間9.03 h、反應(yīng)溫度52.29 ℃，在此條件下模型預(yù)測的水解度為37.608%。為檢驗(yàn)?zāi)Ｐ偷臏?zhǔn)確度，在選擇在液料比20∶1，反應(yīng)時(shí)間9 h、反應(yīng)溫度52 ℃、pH7.0工藝下進(jìn)行3次平行驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)，所得實(shí)際水解度平均值為36.84%±0.41%，與預(yù)測值相近，響應(yīng)面優(yōu)化后的酶解工藝參數(shù)可應(yīng)用于實(shí)際。

2.4 檸檬酸對(duì)酶解液品質(zhì)的影響

表6 檸檬酸添加量對(duì)酶解液品質(zhì)的影響

蛋白質(zhì)水解過程中容易生成有苦味的肽分子，這些苦味肽大多數(shù)是一些疏水性氨基酸。有機(jī)酸類可以在一定的條件下對(duì)蛋白質(zhì)進(jìn)行水解，這種水解液不但可以改善水解液的口感，而且不存在安全類的問題[18]。由表6可知，在滅酶的同時(shí)加入檸檬酸不會(huì)降低產(chǎn)品的氨基酸態(tài)氮含量，還可掩蓋酶解液的苦味、澀味等不理想滋味，而檸檬酸添加過多會(huì)使產(chǎn)物酸度過大，因此添加0.5%檸檬酸較為適宜，此方法可應(yīng)用制作柞蠶蛹多肽飲品、口服液、固體飲料等。

黃美佳[19]等在桑蠶蛹酶解液滅酶后添加8%蔗糖和1%檸檬酸制得蠶蛹蛋白肽口服液。根據(jù)實(shí)驗(yàn)觀察，在滅酶的過程中加入檸檬酸不但可以改善產(chǎn)物風(fēng)味，可以提高酶解液的色澤明亮澄清度，而在滅酶后加入檸檬酸對(duì)色澤的改善效果則會(huì)降低；這可能是由于經(jīng)過高溫滅酶增強(qiáng)了酶解液中疏水性氨基酸等呈色物質(zhì)的穩(wěn)定性，減弱了檸檬酸對(duì)呈色物質(zhì)的還原能力。

2.5 柞蠶蛹多肽品質(zhì)

將制得的蠶蛹肽粉參照GB/T 22492-2008 大豆肽粉感官評(píng)價(jià)指標(biāo)從色澤、氣味、口感三個(gè)方面進(jìn)行評(píng)分[20]，每個(gè)項(xiàng)目滿分為10分。見圖6。

由圖6可知柞蠶蛹多肽粉色澤較好，顏色均一明亮；氣味良好，無異味；口感細(xì)膩，可以在此基礎(chǔ)上進(jìn)一步開發(fā)相關(guān)食品。

3 結(jié) 論

本實(shí)驗(yàn)通過單因素結(jié)合響應(yīng)曲面法對(duì)制備柞蠶蛹多肽的工藝條件進(jìn)行優(yōu)化，獲得酶解最佳工藝條件為：液料比20∶1，反應(yīng)時(shí)間9 h、反應(yīng)溫度52 ℃、pH7.0，中性蛋白酶和復(fù)合蛋白酶(雙酶比=1∶1)總添加量2%，此工藝下制備的柞蠶蛹多肽水解度為36.84%±0.41%；在滅酶的過程中添加0.5%的檸檬酸可改善酶解液的苦味、澀味，原有的鮮味不會(huì)受到影響。真空干燥酶解液制備柞蠶蛹多肽粉并對(duì)其進(jìn)行模糊感官評(píng)價(jià)，表明產(chǎn)品色澤淺黃均一、明亮，具柞蠶蛹特有的香氣和鮮味、無異味，可添加至食品、飲料中作為主配料。

4 討 論

在我國很多地區(qū)有食用柞蠶蛹的習(xí)慣，柞蠶蛹是一種常見的重要過敏源，蛹皮中含有的幾丁質(zhì)和蛹肉中的一些大分子蛋白可引起部分人群食入性過敏[21]，本研究通過酶切使蠶蛹中的大分子蛋白被水解成了小分子多肽，并通過微濾降低去除不溶的大分子蛋白和雜質(zhì)。前人研究表明，肽混合物在人體的吸收率和吸收速度比單純的氨基酸更佳，因此本文建立的柞蠶蛹多肽加工工藝可生產(chǎn)出易吸收、低敏性的柞蠶蛹多肽，可為柞蠶蛹類產(chǎn)品加工提供技術(shù)支撐。

檸檬酸是一種常用的食品添加劑，普遍用于汽水飲料、葡萄酒、糖果、點(diǎn)心、餅干、罐頭果汁、乳制品等食品的制造。酶解液中加入檸檬酸可顯著改進(jìn)風(fēng)味，掩蓋了原有的苦味、澀味，這與趙謀明等[18]所報(bào)道的味精菌體酶解結(jié)果相符合；檸檬酸同時(shí)兼具調(diào)色劑功能，使酶解液由褐色變?yōu)榈S色[14]，這對(duì)柞蠶蛹多肽產(chǎn)物的感官評(píng)價(jià)具有積極的影響，可應(yīng)用于柞蠶蛹多肽固體飲料以及多肽口服液等產(chǎn)品的制造，而關(guān)于檸檬酸對(duì)酶解產(chǎn)物風(fēng)味的和色澤的形成和機(jī)理還有待進(jìn)一步的研究。