王珊　馮文靜　毛擁軍

[摘要] 目的 探討褐藻膠寡糖（AOS）對D-半乳糖（D-gal）誘導(dǎo)的衰老小鼠骨質(zhì)疏松的作用及其可能的機制。

方法 將45只8周齡雄性C57BL/6J小鼠隨機分為對照組（Control組）、模型組（D-gal組）、D-gal+AOS低劑量組（D-gal+AOS-L組）、D-gal+AOS中劑量組（D-gal+AOS-M組）和D-gal+AOS高劑量組（D-gal+AOS-H組）。除Control組外，其余組小鼠頸背部注射D-gal 8周建立小鼠骨質(zhì)疏松模型。D-gal+AOS-L、D-gal+AOS-M和D-gal+AOS-H組從第5周開始分別給予50、100、150 mg/（kg·d）的AOS灌胃4周，Control組和D-gal組給予蒸餾水灌胃。藥物干預(yù)完成后，應(yīng)用骨密度儀測量各組小鼠股骨骨密度，采用Western Blot檢測小鼠股骨組織中衰老相關(guān)蛋白P16及氧化應(yīng)激相關(guān)蛋白P67 phox的表達(dá)，RT-PCR檢測氧化應(yīng)激相關(guān)基因p47 phox和gp91 phox mRNA的表達(dá)及破骨細(xì)胞活化相關(guān)基因核因子κB受體活化因子配體（RANKL）mRNA的表達(dá)。

結(jié)果 D-gal組小鼠骨密度較Control組降低，AOS干預(yù)各組小鼠骨密度較D-gal組均增加，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（F=46.853，P<0.05）。D-gal組小鼠股骨組織中P16和P67 phox蛋白表達(dá)較Control組增加，AOS干預(yù)各組P16和P67 phox蛋白表達(dá)較D-gal組降低，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（F=50.862、156.943，P<0.05）。D-gal組小鼠股骨組織中p47 phox、gp91 phox和RANKL mRNA相對表達(dá)量較Control組增加，AOS干預(yù)各組小鼠p47 phox、gp91 phox和RANKL mRNA相對表達(dá)量較D-gal組均降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（F=17.373～112.311，P<0.05）。

結(jié)論 AOS對 D-gal誘導(dǎo)的小鼠骨質(zhì)疏松具有保護作用，其機制可能與氧化應(yīng)激和破骨細(xì)胞活化的抑制有關(guān)。

[關(guān)鍵詞] 海藻酸;寡糖類;半乳糖;骨質(zhì)疏松;衰老;氧化性應(yīng)激;RANK配體

[中圖分類號] R681

[文獻(xiàn)標(biāo)志碼] A

[文章編號] 2096-5532（2020）03-0261-04

doi：10.11712/jms.2096-5532.2020.56.113

[開放科學(xué)（資源服務(wù)）標(biāo)識碼（OSID）]

[網(wǎng)絡(luò)出版] https：//kns.cnki.net/kcms/detail/37.1517.R.20200610.1359.004.html;2020-06-11 11：06

EFFECT OF ALGINATE OLIGOSACCHARIDE ON D-GALACTOSE-INDUCED OSTEOPOROSIS IN MICE

WANG Shan， FENG Wenjing， MAO Yongjun

（Department of Geriatric Medicine， The Affiliated Hospital of Qingdao University， Qingdao 266100， China）

[ABSTRACT]＼ Objective＼ To investigate the effect of alginate oligosaccharide （AOS） on D-galactose （D-gal）-induced osteoporosis in senescent mice and its possible mechanism.

Methods＼ A total of 45 male C57BL/6J mice， aged 8 weeks， were randomly divided into Control group， model group （D-gal group）， D-gal+low-dose AOS group （D-gal+AOS-L group）， D-gal+middle-dose AOS group （D-gal+AOS-M group）， and D-gal+high-dose AOS group （D-gal+AOS-H group）. All mice except those Control group were given subcutaneous injection of D-gal at the back of the neck for 8 weeks to establish a mouse model of osteoporosis. D-gal+AOS-L group， D-gal+AOS-M group， and D-gal+AOS-H group were given AOS by gavage at a dose of 50， 100， and 150 mg/（kg·d） for 4 weeks since week 5， and Control group and D-gal group were given distilled water by gavage. After drug intervention， dual-energy X-ray absorptiometry was used to measure bone mineral density （BMD） of the femur， Western Blot was used to measure the protein expression of the aging-related protein P16 and the oxidative stress-related protein P67 phox， and RT-PCR was used to measure the mRNA expression of the oxidative stress-related genes p47 phox and gp91 phox and the osteoclast activation-related gene receptor activator of nuclear factor-kappa B ligand （RANKL）.

＼ Results＼ Compared with Control group， D-gal group had a significant reduction in BMD， and compared with D-gal group， the AOS intervention groups had a significant increase in BMD （F=46.853，P<0.05）. Compared with Control group， D-gal group had significant increases in the protein expression of P16 and P67 phox in femoral tissue， and compared with D-gal group， the AOS intervention groups had significant reductions in the protein expression of P16 and P67 phox （F=50.862，156.943;P<0.05）. Compared with Control group， D-gal group had significant increases in the relative mRNA expression of p47 phox， gp91 phox， and RANKL in femoral tissue， and compared with D-gal group， the AOS intervention groups had significant reductions in the relative mRNA expression of p47 phox， gp91 phox， and RANKL （F=17.373-112.311，P<0.05）.

＼ Conclusion

AOS exerts a protective effect against D-gal-induced osteoporosis in

mice， possibly by inhibiting oxidative stress and osteoclast activation.

骨質(zhì)疏松具有骨微觀結(jié)構(gòu)退行性改變、骨量減少和骨密度降低的特點，導(dǎo)致骨強度降低[1]、骨脆性增加[2]及骨折風(fēng)險增加[3]，引起了老齡化社會的廣泛關(guān)注。氧化應(yīng)激學(xué)說是衰老的重要機制之一[4]，該學(xué)說認(rèn)為活性氧（ROS）的積聚超過機體的清除能力造成DNA損傷、激活氧化應(yīng)激，從而導(dǎo)致衰老及衰老相關(guān)疾病的發(fā)生。ROS在體內(nèi)積聚可激活核因子κB受體活化因子配體（RANKL）信號通路，導(dǎo)致骨吸收增加。RANKL信號通路被認(rèn)為是促進破骨細(xì)胞活化的主要靶點，可激活多種下游信號通路[5]，從而促進骨吸收和破骨細(xì)胞分化過程。長期注射D-半乳糖（D-gal）可導(dǎo)致實驗動物產(chǎn)生一系列類似于自然老化的病理變化，如認(rèn)知障礙、氧化應(yīng)激和骨量減少等[6]。用D-gal誘導(dǎo)建立亞急性衰老模型具有周期短、價格低廉、操作簡便、結(jié)果穩(wěn)定可靠等優(yōu)點，已廣泛應(yīng)用于衰老機制研究和抗衰老藥物篩選。褐藻膠寡糖（AOS）具有較高的生物活性，如抗炎、抗氧化、抗凋亡、抗腫瘤等[7]。骨質(zhì)疏松性骨折是導(dǎo)致老年人死亡的主要原因之一[8]，因此骨質(zhì)疏松癥的早期預(yù)防、診斷和治療十分重要，開發(fā)更有效的延緩骨質(zhì)疏松癥的藥物具有重要意義。目前大多數(shù)骨質(zhì)疏松研究側(cè)重于絕經(jīng)后婦女，而缺乏對老年男性骨質(zhì)疏松的研究。故本實驗采用D-gal誘導(dǎo)建立小鼠骨質(zhì)疏松模型，探討AOS對衰老雄性小鼠骨質(zhì)疏松的作用及其可能的機制。

1 材料和方法

1.1 實驗材料

健康雄性C57BL/6J小鼠45只，SPF級，8周齡，購自濟南朋悅實驗動物繁育有限公司，飼養(yǎng)于青島大學(xué)醫(yī)學(xué)部SPF級實驗動物中心。飼養(yǎng)條件：12 h晝夜循環(huán)，室溫（20±2）℃，相對濕度40%～60%，自由攝食物和水。動物實驗操作均經(jīng)青島大學(xué)動物福利和倫理管理委員會批準(zhǔn)，并且遵守中國動物保護委員會制訂的《動物保護與使用指南》。P16小鼠單克隆抗體購自美國 Cell Signaling Technology公司，RIPA裂解液和BCA蛋白濃度測定試劑盒購自上海碧云天公司，逆轉(zhuǎn)錄試劑盒及Mix購自Roche公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 動物分組及處理 45只小鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后，隨機分為對照組（Control組，A組）、模型組（D-gal組，B組）、D-gal+AOS低劑量組（D-gal+AOS-L組，C組）、D-gal+AOS中劑量組（D-gal+AOS-M組，D組）以及D-gal+AOS高劑量組（D-gal+AOS-H組，E組），每組9只。Control組小鼠頸背部皮下注射滅菌注射用水5 mL/（kg·d），其余組小鼠頸背部皮下注射D-gal 200 mg/（kg·d），連續(xù)8周。從D-gal注射第5周開始，AOS干預(yù)低、中、高劑量組分別給予AOS 50、100、150 mg/（kg·d）灌胃處理4周，Control組和D-gal組小鼠給予蒸餾水10 mL/（kg·d）灌胃處理4周。

1.2.2 骨密度測量 藥物干預(yù)完成后，取每組各3只小鼠的同側(cè)股骨，采用雙能X線骨密度儀（Dexa;Osteosys Primus，Korea）對整個股骨進行骨密度測量（掃描間距1.5 mm，掃描速度60 mm/s）。

1.2.3 Western Blot檢測P16和P67 phox蛋白表達(dá) 藥物干預(yù)完成后，取每組各3只小鼠的股骨組織進行液氮研磨，將RIPA裂解液加入研磨好的股骨組織中提取蛋白，用BCA試劑盒檢測蛋白濃度。提取的蛋白進行SDS-PAGE電泳，待溴酚藍(lán)至分離膠底部時轉(zhuǎn)移到PVDF膜上，凝膠成像系統(tǒng)成像后用Quantity One軟件分析灰度值。

1.2.4 RT-PCR檢測股骨組織p47 phox、gp91 phox和RANKL mRNA的表達(dá) 藥物干預(yù)完成后，取每組各3只小鼠的股骨組織進行液氮研磨，加Trizol 50～100 g/L，顛倒混勻室溫放置30 min。4 ℃下以12 000 r/min離心5 min，棄沉淀，加1/5體積氯仿，充分震蕩混勻后置于冰上靜置5 min。4 ℃下以12 000 r/min離心15 min，將上清轉(zhuǎn)移至新的1.5 mL EP管中。加入與上清等體積的異丙醇，充分震蕩混勻，置于冰上靜置10 min。4 ℃下以12 000 r/min離心10min，棄上清，加體積分?jǐn)?shù)0.75的乙醇溶液懸浮沉淀。4 ℃下以12 000 r/min離心5 min，吸除上清，自然晾干后加入10 μL DEPC水溶解RNA。用Nanodrop分光光度計測定RNA濃度，用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒將mRNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。應(yīng)用RT-PCR法進行擴增，擴增條件：95 ℃、600 s，95 ℃、10 s，60 ℃、10 s，72 ℃、15 s，共計40個循環(huán);95 ℃、10 s，65 ℃、60 s，97 ℃、1 s。PCR引物及其序列見表1。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法

應(yīng)用SPSS 21.0軟件對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計學(xué)分析，

計量數(shù)據(jù)以±s表示，多組比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD法，以P<0.05為差異有顯著性。

2 結(jié)果

2.1 各組小鼠股骨骨密度比較

與Control組相比較，D-gal組小鼠股骨骨密度明顯下降;與D-gal組相比較，AOS干預(yù)各組小鼠股骨骨密度明顯增加，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（F=46.853，P<0.05）。見表2。

2.2 各組小鼠股骨組織中P16和P67 phox蛋白表達(dá)比較

與Control組相比較，D-gal組小鼠股骨組織中P16和P67 phox蛋白表達(dá)增加;與D-gal組比較，AOS干預(yù)各組小鼠股骨組織中P16和P67 phox蛋白表達(dá)降低，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（F=50.862、156.943，P<0.05）。見圖1、表2。

2.3 各組小鼠股骨組織中p47 phox、gp91 phox 和RANKL mRNA表達(dá)比較

與Control組相比較，D-gal組股骨組織中p47phox、gp91 phox和RANKL mRNA表達(dá)增加;與D-gal組相比，AOS干預(yù)各組小鼠股骨組織中p47 phox、gp91 phox和RANKL mRNA表達(dá)降低，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（F=17.373～112.311，P<0.05）。見表3。

3 討論

到2050年，65歲以上的老年人口將超過8億。隨著世界人口平均壽命的延長，衰老相關(guān)疾病如阿爾茨海默病[9]、骨質(zhì)疏松[10]等的發(fā)病率和死亡率將明顯增加，其造成的社會醫(yī)療負(fù)擔(dān)也日益加重。骨質(zhì)疏松癥是一種與年齡相關(guān)的退行性疾病，嚴(yán)重影響人們的生活質(zhì)量，導(dǎo)致老年人的死亡率增加。衰老可以引起骨皮質(zhì)和骨小梁的礦化減少、孔隙度增加及骨密度降低等，導(dǎo)致骨質(zhì)疏松和骨折的風(fēng)險增加[11]。本文研究結(jié)果顯示，D-gal組衰老性骨質(zhì)疏松模型小鼠的股骨骨密度較Control組顯著降低，而與D-gal組相比，AOS干預(yù)各組小鼠的股骨骨密度顯著增加。說明AOS對D-gal誘導(dǎo)的骨質(zhì)疏松有保護作用。P16作為細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶抑制因子[12]，在衰老和抑制腫瘤生長過程中起重要作用。P16在大多數(shù)嚙齒動物和人體組織中的表達(dá)隨年齡增長而顯著增加[13]。本文結(jié)果顯示，P16蛋白在D-gal組股骨中的表達(dá)增加，而與D-gal組相比，AOS干預(yù)各組小鼠股骨中P16蛋白的表達(dá)降低，說明AOS延緩了D-gal誘導(dǎo)的衰老進程。

氧化應(yīng)激可誘導(dǎo)DNA損傷和細(xì)胞衰老，而抑制衰老可能是治療骨丟失的有效方法。氧化應(yīng)激與許多年齡相關(guān)疾病（骨質(zhì)疏松、心血管疾病和神經(jīng)退行性疾病等）有關(guān)，它可以破壞骨骼系統(tǒng)中骨吸收和骨形成的動態(tài)平衡，使骨硬度和強度降低，在骨質(zhì)疏松的發(fā)生和發(fā)展中起重要作用[14]。ROS的一個主要來源是煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸（NADPH）氧化酶，它可促進氧化應(yīng)激的發(fā)生。本研究結(jié)果顯示，D-gal組股骨中NADPH氧化酶亞基p67 phox、p47

phox和gp91 phox的mRNA表達(dá)增加，而與D-gal組相比，AOS干預(yù)各組股骨中NADPH氧化酶亞基mRNA表達(dá)減少。表明AOS對衰老性骨質(zhì)疏松的保護作用可能與氧化應(yīng)激的抑制有關(guān)。

隨著年齡的增長，破骨細(xì)胞介導(dǎo)的骨吸收和成骨細(xì)胞介導(dǎo)的骨生成之間失去平衡[15]，當(dāng)骨吸收超過骨形成時出現(xiàn)骨代謝失衡，引起骨量降低從而導(dǎo)致骨質(zhì)疏松的發(fā)生。RANKL在破骨細(xì)胞生成中發(fā)揮著重要的作用[16]，可以與核因子κB受體活化因子（RANK）結(jié)合激活信號通路，促進破骨細(xì)胞活化、分化和成熟等過程[17]。RANKL相關(guān)信號通路被認(rèn)為是促進骨丟失和破骨細(xì)胞活化的主要靶點[18]。本研究結(jié)果顯示，在衰老性骨質(zhì)疏松D-gal組股骨中RANKL mRNA表達(dá)增加，而與D-gal組相比，AOS干預(yù)各組小鼠股骨中RANKL mRNA表達(dá)降低，說明AOS對衰老性骨質(zhì)疏松的保護作用可能與RANKL通路抑制有關(guān)。

綜上所述，AOS對D-gal誘導(dǎo)的C57BL/6J小鼠骨質(zhì)疏松有保護作用，其機制可能與氧化應(yīng)激和破骨細(xì)胞活化抑制有關(guān)，具體機制還需進一步研究。

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（本文編輯 馬偉平）

[收稿日期]2019-11-24; [修訂日期]2020-05-07

[基金項目]國家自然科學(xué)基金資助項目（31571829，31-640050）;山東省自然科學(xué)基金資助項目（ZR2016HQ23）

[第一作者]王珊（1993-），女，碩士研究生。

[通信作者]毛擁軍（1964-），男，博士，教授，博士生導(dǎo)師。

E-mail：mmc168@126.com。