李奕陽(yáng)

摘 要：CRISPR-Cas系統(tǒng)是一種對(duì)生物物基因組定點(diǎn)編輯技術(shù)。因?yàn)樗僮骱?jiǎn)單、成本低、耗時(shí)短等優(yōu)點(diǎn)，從而逐漸取代鋅指核酸酶（ZFNs）TALE核酸酶 （TALENs），成為對(duì)目標(biāo)基因進(jìn)行高效、定點(diǎn)編輯的技術(shù)，引起生物科學(xué)界的巨大變革。本文介紹了CRISPR-Cas9系統(tǒng)的作用原理和優(yōu)勢(shì)，指出尚未解決的問題，結(jié)合其在各個(gè)國(guó)家的研究現(xiàn)狀，展望CRISPR-Cas9系統(tǒng)的應(yīng)用前景。

關(guān)鍵詞：CRISPR-Cas9;基因編輯;基因治療

0 引言

原核生物基因內(nèi)的一段重復(fù)序列稱為CRISPR，是其在長(zhǎng)期而復(fù)雜的進(jìn)化過程中獲得的對(duì)抗病毒侵入的免疫工具。概括地說，病毒通過對(duì)自身的基因整合進(jìn)入細(xì)菌體內(nèi)完成侵入，并利用細(xì)菌體內(nèi)的蛋白質(zhì)等物質(zhì)進(jìn)行復(fù)制繁殖，而細(xì)菌演化出CRISPR-Cas9系統(tǒng)，抵抗這種侵入。通過CRISPR-Cas9系統(tǒng)，細(xì)菌可以將自身基因內(nèi)病毒侵入的片段進(jìn)行切除，從而實(shí)現(xiàn)免疫防御。

細(xì)菌擁有多種手段切除病毒的遺傳信息，通過合成一種特殊的復(fù)合物進(jìn)行切除的方法最為常見，該復(fù)合物可以定向地尋找特定的基因序列，之后進(jìn)行定點(diǎn)切除。該復(fù)合物在細(xì)菌體內(nèi)較為復(fù)雜，有Cas9蛋白參與基因組的定點(diǎn)編輯，這種技術(shù)被命名為CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)，在當(dāng)下?lián)碛蟹浅V闊的科研前景，并且逐漸開發(fā)完善。此系統(tǒng)具有低成本、易操作、精準(zhǔn)度高、周期短等優(yōu)點(diǎn)[1]。

1 CRISPR系統(tǒng)簡(jiǎn)介

CRISPR技術(shù)具有改變生物科技領(lǐng)域基本規(guī)則的能力，這種系統(tǒng)主要分為兩個(gè)部分，具有引導(dǎo)功能的sgRNA以及具有核酸內(nèi)切酶活性的Cas9蛋白，CRISPR-Cas9系統(tǒng)的科研前景非常廣闊，可以改變生物的遺傳物質(zhì)達(dá)到改變性狀的目的，通過對(duì)植物的基因組定點(diǎn)編輯加強(qiáng)該植株對(duì)某種特定病毒的抵抗能力;通過修復(fù)細(xì)胞DNA治療特定遺傳病等。

CRISPR是在微生物的免疫系統(tǒng)中發(fā)現(xiàn)的，通過對(duì)Cas9酶的利用，能在DNA中插入作為引導(dǎo)序列的RNA，之后實(shí)現(xiàn)切除DNA片段等目的。有研究表明，sgRNA的加入，能更有效地讓基因組產(chǎn)生突變，效率比以往的傳統(tǒng)基因編輯手段要高。雖然具有高效性和廣泛的適應(yīng)性，但是CRISPR-Cas9技術(shù)在目標(biāo)細(xì)胞的編輯中依舊會(huì)產(chǎn)生“脫靶效應(yīng)”，各科研機(jī)構(gòu)仍在尋找有效的改進(jìn)方法。

從20世紀(jì)90年代初CRISPR技術(shù)被發(fā)現(xiàn)，到七年后首次應(yīng)用在生物工程領(lǐng)域，CRISPR技術(shù)迅速地發(fā)展成為各大領(lǐng)域主要的基因組定點(diǎn)編輯的新工具。2012年，研究人員發(fā)現(xiàn)了一種強(qiáng)大的基因組編輯技術(shù)對(duì)生物DNA進(jìn)行修飾，并命名為CRISPR。美國(guó)約翰·霍普金斯大學(xué)醫(yī)學(xué)院證明，這個(gè)技術(shù)可以應(yīng)用于人體干細(xì)胞的編輯。這一發(fā)現(xiàn)有利于更簡(jiǎn)捷地修飾誘導(dǎo)多功能干細(xì)胞的基因組，加速了該技術(shù)進(jìn)行臨床實(shí)驗(yàn)的進(jìn)程，并被發(fā)表于《分子治療》上。2015年1月6日，為了研究人體內(nèi)其他細(xì)胞是否能進(jìn)行這樣的操作，研究小組分別用CRISPR和TALEN在人體的IPSCs上進(jìn)行試驗(yàn)，方法是切下已知基因片段或切下后換上指定序列。將JAK2、SERPINA1和AAVS1基因設(shè)定為模型，通過JAK2基因的變異會(huì)引起骨髓紊亂，真性紅細(xì)胞增多癥;SERPINA1基因變異會(huì)導(dǎo)致alpha1-抗胰蛋白酶缺乏，這是一種遺傳性紊亂，會(huì)造成肺和肝臟疾病;而AAVS1最近發(fā)現(xiàn)是人類基因組中的“安全港”，可以插入外來(lái)基因[2]。

通過比較發(fā)現(xiàn)，在這三個(gè)基因系統(tǒng)中，如果只是簡(jiǎn)單地切掉部分基因，CRISPR系統(tǒng)明顯比TALEN更有效，產(chǎn)生的剪切效率遠(yuǎn)大于后者;在替換基因時(shí)，如替代JAK2和SERPINA1中的致病變異，CRISPR和TALEN的效率相差無(wú)幾。研究人員指出，與癌細(xì)胞研究不同的是，無(wú)論CRISPR還是TALEN，在人體中都有著指定的目標(biāo)，即不會(huì)替換其他基因。還發(fā)現(xiàn)，CRISPR系統(tǒng)的優(yōu)勢(shì)在于：CRISPR可以只瞄準(zhǔn)變異的基因，而不傷害其他細(xì)胞中健康的等位基因。若該發(fā)現(xiàn)成功地與干細(xì)胞的研究相結(jié)合，就可以使CRISPR成為目前風(fēng)險(xiǎn)最小的人體IPSCs基因編輯手段。約翰·霍普金斯大學(xué)醫(yī)學(xué)院導(dǎo)師葉朝輝說：“干細(xì)胞技術(shù)正在迅速發(fā)展。我們認(rèn)為，將iPSCs用于人類治療的日子已經(jīng)不遠(yuǎn)”。他們的研究詳細(xì)說明了如何將CRISPR技術(shù)用于人類iPSCs，展現(xiàn)了該技術(shù)在這類細(xì)胞中的研究潛力。

中國(guó)科研團(tuán)隊(duì)對(duì)CRISPR系統(tǒng)的研究和應(yīng)用進(jìn)行得如火如荼。2014年，南京大學(xué)的研究人員成功編輯猴的基因，這是歷史上首次成功編輯非人類靈長(zhǎng)目動(dòng)物的基因。2016年8月，四川大學(xué)華西醫(yī)院腫瘤學(xué)家盧鈾帶領(lǐng)團(tuán)隊(duì)首次進(jìn)行對(duì)人體使用CRISPR技術(shù)進(jìn)行基因編輯和臨床應(yīng)用。這些研究人員計(jì)劃招募一批保守治療已經(jīng)無(wú)望的非小細(xì)胞肺癌患者。從患者身體血液中提取免疫細(xì)胞，利用CRISPR定向清除腫瘤的新基因序列，然后再把這些細(xì)胞注入患者的血液，成為新的抗體，2018年7月，CRISPR基因編輯實(shí)驗(yàn)在中國(guó)進(jìn)行，并將嘗試使用CRISPR技術(shù)來(lái)破壞人類乳突瘤病毒（HPV）的基因，并有效地降解入侵病毒，據(jù)悉，人類乳突瘤病毒已被證實(shí)可促使宮頸癌腫瘤生長(zhǎng)[3]。

1.1 CRISPR-Cas9系統(tǒng)結(jié)構(gòu)與分類

CRISPR-Cas9系統(tǒng)由tracrRNA序列區(qū)、cas基因序列區(qū)、crispr序列區(qū)三個(gè)功能部分組成。CRISPR系統(tǒng)主要分為三大類：Type I、Type II、Type III，而在化膿鏈球菌中發(fā)現(xiàn)的Cas9基因?qū)儆赥ype II，根據(jù)系統(tǒng)中包含的Cas基因種類的不同，又將Type II再細(xì)分為三種亞型：Type IIA、Type IIB、Type IIC。通常Type II型系統(tǒng)通常包括Cas9、Cas1、Cas2基因和CRISPR序列。

1.2 CRISPR-Cas9系統(tǒng)原理

CRISPR-Cas9免疫系統(tǒng)能夠有效保護(hù)細(xì)胞，當(dāng)病毒二次侵入細(xì)胞時(shí)，整合了該病毒基因片段的crispr位點(diǎn)經(jīng)轉(zhuǎn)錄會(huì)形成crRNA（不成熟的crRNA），成熟的crRNA會(huì)與加工過的tracrRNA招募Cas蛋白形成二元復(fù)合體，完成之后，與病毒的DNA特異位點(diǎn)互補(bǔ)配對(duì)結(jié)合，Cas蛋白就會(huì)切割靶DNA造成DSB，從而實(shí)現(xiàn)Cas9核酸酶對(duì)結(jié)合位點(diǎn)進(jìn)行切割。

CRISPR-Cas9系統(tǒng)在目標(biāo)基因的特異位點(diǎn)引入雙鏈結(jié)構(gòu)切割后，細(xì)胞可以通過兩種主要的形式對(duì)該缺口進(jìn)行修復(fù)。一種主要的修復(fù)機(jī)制是非同源染色體的末端連接，另一種方法是利用外源性修復(fù)模版作為參照，對(duì)同源DNA的修復(fù)則更加準(zhǔn)確地進(jìn)行，從而實(shí)現(xiàn)特定的基因片段插入或替換。更為重要的是，對(duì)比現(xiàn)有的基因編輯手段，CRISPR技術(shù)對(duì)基因的編輯是具有遺傳性的，通過改變親本的基因序列，經(jīng)過有性繁殖之后的子代也會(huì)擁有相同的基因序列，從而實(shí)現(xiàn)永久地消除基因缺陷，換言之就是永久地免疫該類病毒。近些年來(lái)，CRISPR的基因編輯已經(jīng)在動(dòng)物身上試驗(yàn)并取得巨大的成功，并且在人類遺傳疾病上得到了更加深入的嘗試。重點(diǎn)是，在病毒的基因序列被Cas蛋白整合進(jìn)自身序列中的時(shí)候，需要靶序列后面跟隨PAM。在II型CRISPR系統(tǒng)中，NGG的三堿基序列通常構(gòu)成PAM，這是使用CRISPR技術(shù)的唯一限制條件，即細(xì)胞基因內(nèi)含有GG的堿基序列[4]。而在人體中，通過遺傳分析可知道，每8個(gè)堿基對(duì)就會(huì)出現(xiàn)一次GG堿基序列，所以可以認(rèn)為在人體上使用CRISPR技術(shù)并不受任何原理上的限制。

外顯子測(cè)序和全部基因編碼的測(cè)序極大的促進(jìn)了一些罕見遺傳病的研究進(jìn)程和對(duì)單基因突變的篩查。據(jù)研究顯示，絕大多數(shù)遺傳病是由其致病基因特定外顯子的點(diǎn)突變?cè)斐傻?。在基因轉(zhuǎn)錄的過程中，點(diǎn)突變可以將生物信號(hào)進(jìn)行剪切或者停止發(fā)出，從而阻礙對(duì)應(yīng)的mRNA或者蛋白質(zhì)的合成或特定功能的喪失。因此，通過CRISPR-Cas9系統(tǒng)在特定點(diǎn)突變位置附近引入DNA雙鏈切口，并且通過后續(xù)的同源或非同源修復(fù)作用，從而實(shí)現(xiàn)對(duì)突變引起的家族遺傳病進(jìn)行特定的修復(fù)。

1.3 CRISPR系統(tǒng)相關(guān)應(yīng)用

2014年，Yin等人發(fā)表了利用CRISPR/Cas9技術(shù)介導(dǎo)的HDR來(lái)修復(fù)Fah基因點(diǎn)突變治療遺傳性高酪氨酸血癥的研究。在該疾病的研究中，研究人員設(shè)計(jì)了多個(gè)靶向的Fah基因第8號(hào)外顯子的gRNA，其與Cas9基因序列共同構(gòu)建至質(zhì)粒，并成功表達(dá)。該治療策略取得了很大的成功。因此這個(gè)方案在類似的家族遺傳病的研究上也進(jìn)行了嘗試。例如對(duì)新生小鼠注射cas9系統(tǒng)和DNA模板有關(guān)病毒，成功地修復(fù)了小鼠OTC基因第4號(hào)外顯子的G→A的點(diǎn)突變。在上述實(shí)驗(yàn)中，通過cas9系統(tǒng)對(duì)目標(biāo)點(diǎn)突變進(jìn)行修復(fù)的效率并不相同[5]。一般認(rèn)為，雖然基因序列的修復(fù)效率與HDR的效率成正比，但后者的發(fā)生概率要遠(yuǎn)小于前者，因此設(shè)計(jì)合適的gRNA模版更為重要。

2 展望

CRISPR系統(tǒng)依靠sgRNA分子將目的基因?qū)蛱囟―NA位點(diǎn)，利用Cas9酶編輯DNA，以擾亂基因或插入目的基因。在實(shí)驗(yàn)時(shí)，研究人員需要訂購(gòu)的只是RNA片段，其他成分都是現(xiàn)成的。全部花費(fèi)只有30美元，這是該技術(shù)走進(jìn)更多實(shí)驗(yàn)室的重要原因。CRISPR方法幾乎完勝鋅指核酸酶技術(shù)和其他編輯工具。對(duì)一些研究人員來(lái)說，這意味著要放棄數(shù)年來(lái)完善的技術(shù)。一些研究人員嚴(yán)重依賴諸如小鼠、果蠅等模式生物。CRISPR使在更多生物體中編輯基因成為可能。

CRISPR基因編輯技術(shù)的發(fā)展已經(jīng)進(jìn)行到現(xiàn)代生物學(xué)各項(xiàng)領(lǐng)域，但也存在一定局限性。在2015年3月，一個(gè)研究小組在《自然》雜志發(fā)表公開信，提出“嚴(yán)重?fù)?dān)憂”編輯人類基因“種系”產(chǎn)生的倫理道德和安全問題。研究人員對(duì)此方面仍有所顧慮，他們認(rèn)為大量噬菌體侵入人體免疫系統(tǒng)會(huì)引發(fā)免疫系統(tǒng)的非正常反應(yīng)，或者會(huì)令一些細(xì)菌更快地產(chǎn)生耐藥性或者使耐藥性大幅增強(qiáng)。相信未來(lái)隨著科學(xué)研究逐漸進(jìn)步，會(huì)出現(xiàn)符合人類需求的手段對(duì)基因編輯技術(shù)有更加深入的探究。

參考文獻(xiàn)

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