王飛兵 李 威 張 揚(yáng) 黨長(zhǎng)喜 葉玉秀 張 凡 陳新紅 周 青

(1淮陰工學(xué)院生命科學(xué)與食品工程學(xué)院，江蘇 淮安 223003；2江蘇省中國(guó)科學(xué)院植物研究所，江蘇 南京 210014)

土地鹽堿化是導(dǎo)致農(nóng)作物減產(chǎn)的主要原因之一，嚴(yán)重制約著現(xiàn)代農(nóng)業(yè)的高效發(fā)展[1-2]。 在耕地有限、人口不斷增長(zhǎng)的時(shí)代，如何開(kāi)發(fā)和使用鹽漬土壤發(fā)展農(nóng)業(yè)，提高農(nóng)作物產(chǎn)量已經(jīng)成為生物技術(shù)迫切需要解決的主要問(wèn)題之一，也是我國(guó)農(nóng)業(yè)生產(chǎn)需要解決的重要問(wèn)題[3]。

馬鈴薯(Solanum tuberosumL.)是我國(guó)繼小麥、水稻、玉米之后的第四大糧食作物，是世界上重要的糧食、菜用作物，也是重要的工業(yè)原料植物[4]。 研究發(fā)現(xiàn)，馬鈴薯屬鹽中度敏感植物，土壤高鹽脅迫已嚴(yán)重影響馬鈴薯產(chǎn)量，不利于其產(chǎn)業(yè)高效健康發(fā)展。 因此，研究馬鈴薯響應(yīng)高鹽脅迫分子機(jī)制，以及開(kāi)展馬鈴薯響應(yīng)鹽脅迫相關(guān)基因的克隆與功能研究具有重要意義。

蔗糖非發(fā)酵-1-型相關(guān)蛋白激酶-1(SnRK1)在植物體內(nèi)參與調(diào)節(jié)重要的生理活動(dòng)，在植物碳水化合物的代謝、發(fā)育及逆境脅迫響應(yīng)等多種生理過(guò)程中扮演著重要角色[5-8]。 研究表明，SnRK1 通過(guò)調(diào)控ADP-葡萄糖焦磷酸化酶(ADP-glucose pyrophosphorylase，AGPase)和蔗糖合酶( sucrose synthase，SUS)活性，參與植物體內(nèi)淀粉合成調(diào)控，進(jìn)而參與植物的生長(zhǎng)代謝[5，7-11]。 但關(guān)于SnRK1 在植物逆境脅迫方面研究報(bào)道較少。 桃PpSnRK1βγ1 基因過(guò)表達(dá)顯著提高擬南芥的萌芽率和抗氧化能力[12-13]。 張淑輝等[14]研究發(fā)現(xiàn)過(guò)表達(dá)桃PpSnRK1α基因可提高番茄植株耐鹽性；Wang 等[7]研究發(fā)現(xiàn)，從馬鈴薯中克隆得到StSnRK1 基因，過(guò)表達(dá)該基因可顯著上調(diào)煙草植株的淀粉合成途徑關(guān)鍵酶基因表達(dá)，增加相應(yīng)酶活性，從而顯著提高淀粉含量，調(diào)控?zé)煵葜仓甑奶妓衔锎x。 但有關(guān)馬鈴薯StSnRK1 在抗鹽脅迫方面的研究鮮見(jiàn)報(bào)道。

前期研究獲得了過(guò)表達(dá)馬鈴薯StSnRK1 基因的轉(zhuǎn)基因煙草植株[7]。 本研究以過(guò)表達(dá)株系和野生型煙草植株為材料，在鹽脅迫條件下，研究過(guò)表達(dá)馬鈴薯StSnRK1 基因提高煙草植株耐鹽性的分子及生理機(jī)制，以期為耐鹽馬鈴薯的分子育種提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 植物材料

江蘇省植物生產(chǎn)與加工實(shí)踐教育中心實(shí)驗(yàn)室2017年培育的過(guò)表達(dá)馬鈴薯StSnRK1 的煙草W38(Nicotiana tabacumvar. Winsconsin 38)轉(zhuǎn)基因植株[7]。 將轉(zhuǎn)基因植株和野生型植株于25℃組培室中培養(yǎng)，用于鑒定目的基因StSnRK1 響應(yīng)鹽脅迫的功能研究。

1.2 轉(zhuǎn)基因植株耐鹽性鑒定

根據(jù)陳新紅等[4]和Jiang 等[15]的方法，選用200 mmol·L-1NaCl 用于轉(zhuǎn)基因煙草的耐鹽性鑒定。將過(guò)表達(dá)轉(zhuǎn)基因煙草株系和野生型(WT)植株分別繼代于含有0 mmol·L-1NaCl 的正常條件和200 mmol·L-1NaCl 的1/2 MS 培養(yǎng)基上脅迫培養(yǎng)，培養(yǎng)條件為25±1℃，光照強(qiáng)度3 000 Lux，光照時(shí)間13 h，4 周后觀察并記錄植株生長(zhǎng)情況及表型變化，測(cè)量植物的鮮重、根數(shù)和根長(zhǎng)，鑒定其耐鹽性。 每個(gè)處理均設(shè)3 次生物學(xué)重復(fù)。

1.3 轉(zhuǎn)基因植株逆境脅迫相關(guān)基因表達(dá)分析

以正常條件培養(yǎng)4 周和鹽脅迫處理4 周的轉(zhuǎn)基因煙草株系葉片和WT 植株葉片為試驗(yàn)材料，利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR(quantitative real-time polymerase chain reaction，RT-qPCR)技術(shù)分析逆境脅迫相關(guān)基因的表達(dá)情況，參照RealMasterMix(SYBR Green)[天根生化科技(北京)有限公司]試劑盒方法進(jìn)行。 脅迫相關(guān)基因引物序列如下:NtP5CS-F: 5′-CTGATGGA AGATTAGCACTTGG-3′和NtP5CS-R:5′-CTCCTACAG CACCTGAAGTC-3′；NtLEA5-F:5′-TTGAATCTGGGGT TTTGGTT-3′和NtLEA5-R:5′-GGAAGCATTGACGAGC TAGG-3′；NtSOD-F:5′-CTCCTACCGTCGCCAAAT-3′和NtSOD-R:5′-GCCCAACCAAGAGAACCC-3′；NtPOD-F:5′-CTTGGAACACGACGTTCCTT-3′和NtPOD-R:5′-TC GCTATCGCCATTCTTTCT-3′。 內(nèi)標(biāo)基因選用煙草NtActin基因，NtActin-F:5′-AGCAGCATGAAGATTAAG GTTGTAGCAC-3′和NtActin-R:5′-TGGAAAATTAGAA GCACTTCCTGTGAAC-3′。 每個(gè)樣品均作4 個(gè)平行管。 PCR 熱循環(huán)儀為ABI7500(ABI，美國(guó))，操作軟件為7500 software V2.0.1，熒光染料為SYBR Green PCR Master Mix[天根生化科技(北京)有限公司]。采用2-ΔΔCT法[16]計(jì)算基因的相對(duì)表達(dá)量。 每個(gè)處理設(shè)3 次生物學(xué)重復(fù)。

1.4 轉(zhuǎn)基因植株相關(guān)抗性物質(zhì)含量的測(cè)定

正常條件培養(yǎng)和鹽脅迫處理4 周后，分別取0.50 g 轉(zhuǎn)基因煙草株系葉片和WT 植株葉片測(cè)定其超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)、過(guò)氧化物酶( peroxidase，POD ) 活性，脯氨酸、丙二醛(malondialdehyde，MDA) 和過(guò)氧化氫(H2O2) 含量。SOD 和POD 活性的測(cè)定均采用李合生等[17]的方法。脯氨酸、MDA 和H2O2含量測(cè)定按照Wang 等[18]的方法。 每個(gè)處理設(shè)3 次生物學(xué)重復(fù)。

1.5 數(shù)據(jù)分析

原始數(shù)據(jù)的處理采用Microsoft Office 2010 Excel軟件，統(tǒng)計(jì)分析采用SPSS17.0 軟件進(jìn)行方差分析和顯著性檢驗(yàn)。P＜0.05 或P＜0.01 被認(rèn)為在統(tǒng)計(jì)學(xué)上有顯著或極顯著差異。

2 結(jié)果與分析

2.1 過(guò)表達(dá)StSnRK1 轉(zhuǎn)基因煙草植株耐鹽性鑒定

將之前研究報(bào)道獲得的不同轉(zhuǎn)基因煙草植株(＃2、 ＃3 和＃4)[7]分別培養(yǎng)在含0 mmol·L-1NaCl 正常條件和200 mmol·L-1NaCl 的1/2 MS 培養(yǎng)基上，4 周后觀察轉(zhuǎn)基因植株和WT 植株的生長(zhǎng)狀態(tài)。 正常條件下，＃2、＃3 和＃4 轉(zhuǎn)基因植株的生長(zhǎng)狀態(tài)、鮮重、根數(shù)和根長(zhǎng)與WT 相比無(wú)顯著差異(圖1-A1 ～A4)；200 mmol·L-1NaCl 處理后，＃2、＃3 和＃4 轉(zhuǎn)基因植株的鮮重、根數(shù)和根長(zhǎng)均顯著或極顯著優(yōu)于WT 植株，分別較WT 提高了124% ～213%、222% ～368%和303% ～466%(圖1-B1～B4)。 此外，在200 mmol·L-1NaCl 處理下，WT 植株長(zhǎng)勢(shì)較差，生根困難；轉(zhuǎn)基因植株的生長(zhǎng)狀態(tài)和生根情況均優(yōu)于WT 植株；通過(guò)耐鹽離體鑒定結(jié)果表明，過(guò)表達(dá)StSnRK1 轉(zhuǎn)基因煙草植株的耐鹽性明顯優(yōu)于WT 植株。

2.2 鹽脅迫下轉(zhuǎn)基因煙草植株相關(guān)基因表達(dá)分析

由圖2 可知，200 mmol·L-1NaCl 處理后，轉(zhuǎn)基因植株的脯氨酸生物合成關(guān)鍵酶基因(吡咯琳-5-羧酸合酶NtP5CS)、 胚胎發(fā)育后期豐富蛋白基因(NtLEA5)、活性氧(reactive oxygen species，ROS)清除系統(tǒng)關(guān)鍵酶基因(超氧化物歧化酶NtSOD和過(guò)氧化物酶NtPOD)相對(duì)表達(dá)量均極顯著高于WT 植株，分別較WT 植株提高了122%～198%、205%～281%、255%～289%和161%～212%。 正常條件下，轉(zhuǎn)基因植株與WT 植株所有基因的表達(dá)量無(wú)顯著差異。 綜上，過(guò)表達(dá)StSnRK1 基因通過(guò)上調(diào)脯氨酸生物合成、脅迫響應(yīng)和ROS 清除系統(tǒng)基因表達(dá)，從而提高轉(zhuǎn)基因煙草植株的耐鹽性。

圖1 過(guò)表達(dá)StSnRK1 轉(zhuǎn)基因煙草植株耐鹽性表型鑒定(A1、B1)，鮮重測(cè)定(A2、B2)，根數(shù)測(cè)定(A3、B3)和根長(zhǎng)測(cè)定(A4、B4)Fig.1 Salt tolerance phenotype identification of transgenic StSnRK1 gene tobacco plants (A1，B1)，fresh weight determination (A2，B2)，root number determination (A3，B3) and root length measurement (A4，B4)

2.3 鹽脅迫下轉(zhuǎn)基因煙草植株SOD 和POD 活性分析

高鹽脅迫使植物體內(nèi)產(chǎn)生過(guò)多的ROS，而SOD 和POD 在降低超氧陰離子和過(guò)氧化氫對(duì)植物自身膜系統(tǒng)的損傷中扮演著重要作用。 由圖3 可知，200 mmol·L-1NaCl 脅迫下，轉(zhuǎn)基因煙草植株的SOD 和POD 活性極顯著高于WT 植株，分別提高了41%～68%、83%～107%。 正常條件下，轉(zhuǎn)基因植株和WT 植株的SOD 和POD 活性無(wú)顯著差異(圖3)。 表明過(guò)表達(dá)StSnRK1 基因顯著提高了ROS 清除系統(tǒng)關(guān)鍵酶(SOD 和POD)的活性，從而降低ROS 造成的損傷，提高轉(zhuǎn)基因煙草植株的耐鹽性。

2.4 鹽脅迫下轉(zhuǎn)基因煙草植株脯氨酸、MDA 和H2O2 含量分析

高鹽脅迫使植物體內(nèi)產(chǎn)生過(guò)多的ROS，促進(jìn)膜脂過(guò)氧化產(chǎn)生MDA，降低抗氧化物含量，加快細(xì)胞損傷。 由圖4 可知，200 mmol·L-1NaCl 處理下，轉(zhuǎn)基因植株的脯氨酸含量極顯著高于WT 植株，較WT 植株提高了71%～121%。 轉(zhuǎn)基因植株MDA 和H2O2含量極顯著低于WT 植株，分別較WT 植株降低了41%～58%、31%～47%。 正常條件下，轉(zhuǎn)基因煙草植株的脯氨酸、MDA 和H2O2含量與WT 植株無(wú)顯著差異。 表明過(guò)表達(dá)StSnRK1 基因顯著上調(diào)脯氨酸生物合成、脅迫響應(yīng)和ROS 清除系統(tǒng)基因表達(dá)，增加脯氨酸含量、激活ROS 清除系統(tǒng)，降低膜脂過(guò)氧化程度，維持細(xì)胞滲透平衡，從而顯著增強(qiáng)轉(zhuǎn)基因煙草植株的耐鹽性。

3 討論

研究表明，SnRK1 基因在植物碳水化合物代謝途徑中具有重要作用，通過(guò)調(diào)控途徑中關(guān)鍵酶活性和基因表達(dá)，參與植物體內(nèi)的生理代謝過(guò)程[5，7-11]。 一些研究報(bào)道發(fā)現(xiàn)，SnRK1 基因在應(yīng)答非生物脅迫響應(yīng)過(guò)程中也扮演著重要作用[12-14]。 本研究通過(guò)轉(zhuǎn)基因煙草植株耐鹽性鑒定、耐鹽相關(guān)基因表達(dá)分析和抗性相關(guān)物質(zhì)含量測(cè)定發(fā)現(xiàn)，StSnRK1 過(guò)表達(dá)能夠顯著提高煙草植株的耐鹽性。

圖2 鹽脅迫下轉(zhuǎn)基因煙草植株逆境脅迫相關(guān)基因表達(dá)分析Fig.2 Expression analysis of the stress related genes in transgenic tobacco plants under salt stress

高鹽脅迫會(huì)誘導(dǎo)植物體內(nèi)產(chǎn)生大量的ROS，打破ROS 產(chǎn)生與清除的平衡狀態(tài)，引起細(xì)胞膜脂過(guò)氧化，產(chǎn)生大量MDA，破壞植物細(xì)胞結(jié)構(gòu)[4，18-19]。 SOD 和POD 作為植物ROS 清除系統(tǒng)中的關(guān)鍵作用酶，能夠迅速將H2O2轉(zhuǎn)化為H2O 和O2，以抵抗逆境脅迫[18-20]。SOD、POD 活性，MDA 和H2O2含量等生理指標(biāo)可作為判定植物耐鹽性的重要指標(biāo)[21-23]。 張淑輝等[14]研究發(fā)現(xiàn)，過(guò)表達(dá)PpSnRK1α番茄植株在鹽脅迫處理后具有較高活性的抗氧化酶，表明轉(zhuǎn)基因番茄植株具有較強(qiáng)的ROS 清除能力，PpSnRK1α過(guò)表達(dá)通過(guò)增強(qiáng)ROS清除系統(tǒng)能力，提高了轉(zhuǎn)基因番茄植株的耐鹽性。 本研究中，200 mmol·L-1NaCl 脅迫后，過(guò)表達(dá)StSnRK1煙草植株的SOD 和POD 活性極顯著提高，MDA 和H2O2含量極顯著降低。 同時(shí)，過(guò)表達(dá)植株ROS 清除系統(tǒng)的重要酶基因NtSOD和NtPOD上調(diào)表達(dá)，過(guò)表達(dá)StSnRK1 激活了ROS 清除系統(tǒng)，引起ROS 清除基因的上調(diào)表達(dá)，降低H2O2和MDA 含量，進(jìn)而提高轉(zhuǎn)基因煙草植株的耐鹽性，這與前人研究結(jié)果相似。

在鹽脅迫處理下，植物體內(nèi)脯氨酸含量積累會(huì)迅速提升。 脯氨酸可以調(diào)節(jié)植物細(xì)胞內(nèi)外的滲透平衡，同時(shí)保護(hù)細(xì)胞膜的完整性，從而緩解逆境脅迫給植物帶來(lái)的傷害，因此脯氨酸積累可作為植物耐鹽性的重要判斷指標(biāo)[21]。 研究表明，植物耐鹽相關(guān)基因?qū)胫参镏?，影響脯氨酸生物合成，積累較多的脯氨酸，進(jìn)而提高轉(zhuǎn)基因植株的耐鹽性[18，24-31]。 本研究中，轉(zhuǎn)基因煙草植株在200 mmol·L-1NaCl 處理后積累較多的脯氨酸，且脯氨酸生物合成關(guān)鍵酶基因NtP5CS上調(diào)表達(dá)，推測(cè)過(guò)表達(dá)StSnRK1 基因上調(diào)了NtP5CS基因表達(dá)水平，轉(zhuǎn)基因煙草植株積累較多脯氨酸含量，調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)外的滲透平衡和保護(hù)細(xì)胞膜的完整性，從而提高了轉(zhuǎn)基因煙草植株的耐鹽性。 此外，脯氨酸在清除單線態(tài)氧和羥基氧等ROS 清除系統(tǒng)中扮演著重要作用[28，31-33]。 轉(zhuǎn)基因試驗(yàn)結(jié)果表明，耐鹽相關(guān)基因?qū)胫参镏刑岣吒彼岱e累，激活增強(qiáng)ROS 清楚系統(tǒng)能力提高轉(zhuǎn)基因植株耐鹽性[25-27]，這與本研究結(jié)果一致，積累較多的脯氨酸激活ROS 清除系統(tǒng)，引起ROS 清除基因的上調(diào)表達(dá)和關(guān)鍵酶活性的增強(qiáng)，導(dǎo)致轉(zhuǎn)基因煙草植株的耐鹽性提高。

4 結(jié)論

本研究結(jié)果表明，StSnRK1 的過(guò)表達(dá)顯著提高了煙草植株的耐鹽性，SOD、POD 活性，脯氨酸含量；顯著上調(diào)了脯氨酸生物合成、脅迫響應(yīng)和活性氧清除系統(tǒng)相關(guān)基因的表達(dá)，表明可能通過(guò)增加轉(zhuǎn)基因植株脯氨酸含量，以維持細(xì)胞滲透平衡和激活ROS 清除系統(tǒng)，從而顯著提高轉(zhuǎn)基因植株的耐鹽性，說(shuō)明馬鈴薯StSnRK1 基因在改良植物耐鹽性中發(fā)揮著重要作用。本研究為馬鈴薯分子抗鹽育種提供了理論依據(jù)，對(duì)于使用和開(kāi)發(fā)鹽漬土壤，提高農(nóng)作物產(chǎn)量具有重要意義。

圖3 鹽脅迫下轉(zhuǎn)基因煙草植株SOD(A)和POD 活性(B)分析Fig.3 The activities of SOD (A) and POD (B) in the transgenic tobacco plants under salt stress

圖4 鹽脅迫下轉(zhuǎn)基因煙草植株脯氨酸(A)、MDA(B)和H2O2(C)含量分析Fig.4 The content of proline (A)，MDA (B) and H2O2(C) in the transgenic tobacco plantsunder salt stress