葉 盈 劉志高 梁立軍 季夢成

(浙江農(nóng)林大學(xué)風(fēng)景園林與建筑學(xué)院，浙江 杭州 311300)

威靈仙 (Clematis chinensis) 為毛茛科(Ranunculaceae)鐵線蓮屬(Clematis.L)半常綠木質(zhì)藤本植物，廣泛分布于我國浙江、江蘇、安徽、四川和云南等省[1]。 其花序圓錐狀，腋生或頂生，萼片白色，花期6-9月，屬多花、繁花類型，可用于家庭園藝栽培和園林垂直綠化，是極具開發(fā)潛力的本土鐵線蓮屬觀賞植物。

輻射育種是植物新品種培育的重要方法，被廣泛應(yīng)用于觀賞植物育種和生長，并取得了一定成果。 在育種方面，蝴蝶蘭花粉經(jīng)80 Gy 劑量60Co-γ 射線輻射產(chǎn)生了一個黃花紅唇紅邊的變異株系[2]；宋恒等[3]用12 Gy 和16 Gy 劑量的60Co-γ 射線輻射杜鵑栽培種試管苗，獲得了2 個花色突變系；劉春貴等[4]發(fā)現(xiàn)低于200 Gy 劑量的60Co-γ 射線輻射對路易斯安那鳶尾花色分離具有促進作用。 在生長方面，60Co-γ 射線對洋紫荊幼苗的苗高、地徑和葉片分裂角度有明顯的抑制作用[5]。 試驗材料的成活率和變異性狀出現(xiàn)的概率直接受輻射劑量的影響，較高劑量的γ 射線具有抑制作用，而低劑量的γ 射線可以促進細胞增殖、萌發(fā)、細胞生長和促進酶活性等[6-8]，可見輻射對植物莖、葉及花的變異均有顯著誘導(dǎo)作用[9]。 依據(jù)《植物新品種特異性、一致性和穩(wěn)定性測試指南 鐵線蓮屬》[10]，葉、株型或花的形態(tài)變化均是新品種認定的重要指標。 觀賞鐵線蓮品種常通過雜交和多代選育獲得，僅有Nachitmusik 和Patorale 兩個品種經(jīng)輻射育種方法獲得[11]，但鮮見有關(guān)鐵線蓮輻射育種具體操作方法的研究報道。 本研究以威靈仙種子為試驗材料，比較不同劑量137Cs-γ 射線輻射對威靈仙種子萌發(fā)、幼苗莖、葉表型變異和生理指標的影響，旨在篩選適宜的輻射劑量，為促進我國觀賞鐵線蓮品種自主培育及種質(zhì)資源開發(fā)提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

2016年12月從浙江農(nóng)林大學(xué)鐵線蓮種質(zhì)資源圃采集健康、成熟的威靈仙種子，去除尾部宿存花柱后用牛皮紙袋封裝，4℃冰箱保存。 2017年1月在浙江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物和核技術(shù)利用研究所進行137Cs-γ 輻射處理，劑量率為1 Gy·min-1，分別設(shè)0(CK)、50、100、150、200 Gy 5 個輻射劑量水平，每個劑量輻射100 粒種子，重復(fù)3 次。 輻射后的種子在4℃冰箱放置1 周后，用200 mg·L-1赤霉素溶液浸泡24 h 后播種，以泥炭∶河沙(1 ∶1)作為栽培基質(zhì)。 幼苗長出真葉后，移栽至泥炭土∶珍珠巖∶蛭石(3 ∶1 ∶1)的基質(zhì)中，常規(guī)水肥管理。

1.2 試驗方法

1.2.1 發(fā)芽勢及發(fā)芽率統(tǒng)計 將兩片子葉出土視為發(fā)芽標志，自第一顆種子發(fā)芽起，測定10 d 內(nèi)萌發(fā)種子粒數(shù)和40 d 內(nèi)萌發(fā)種子總數(shù)。 按照公式計算相關(guān)發(fā)芽指標:

1.2.2 半致死輻射劑量估算 參照周小梅等[12]的方法，用不同劑量輻射種子的相對發(fā)芽率擬合直線回歸方程y=a + bx，計算半致死劑量(LD50)。

1.2.3 幼苗形態(tài)指標測定 觀察成活植株形態(tài)變異情況，各處理隨機選擇30 株幼苗(150 Gy 和200 Gy 輻射劑量測定全部29 和14 株幼苗)，在2018年5月10日、7月10 日和9月10 日分別測定不同劑量輻射處理幼苗分蘗數(shù)、株高、節(jié)數(shù)和節(jié)間長度，取平均值。2018年7月15-22 日，參照鐵線蓮屬植物新品種DUS測試標準[10]，對上述幼苗的葉形進行分類和統(tǒng)計，葉片位置以植株高度1/2 為界，分為“上部”和“下部”兩部分。 按照以下公式計算各類葉形比例:

1.2.4 葉片相對葉綠素含量及葉綠素?zé)晒鈪?shù)測定 使用SPAD-520 葉綠素儀(日本柯尼卡美能達控股株式會社)和LI-6400 便攜式光合測定儀(美國LICOR Biosciences 公司)，各處理隨機選擇9 株幼苗，每株選3 片成熟、健康葉片，分別在2018年5月10 日、7月10 日和9月10 日上午8:30-10:30，測定葉片相對葉綠素含量和PSⅡ原初光能轉(zhuǎn)化(Fv/Fm)、PSⅡ潛在活性(Fv/Fo)、非光化學(xué)淬滅系數(shù)(non-photochemical quenching coefficient，NPQ)、光化學(xué)淬滅系數(shù)(photochemical quenching coefficient，qP)、電子傳遞速率(electronic transfer efficiency，ETR)等葉綠素?zé)晒鈪?shù)。

1.3 數(shù)據(jù)處理

采用SPSS 22.0 進行數(shù)據(jù)分析，采用Microsoft Office Excel 2007 制圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 137Cs-γ 射線輻射對威靈仙種子發(fā)芽的影響

圖1 137Cs-γ 射線輻射對威靈仙種子萌發(fā)和成苗的影響Fig.1 Effects of 137Cs-γ radiation on the seed germination of Clematis chinensis

0 Gy 劑量處理組(CK)威靈仙種子播種后243 d開始萌發(fā)，50、100、150 和200 Gy 劑量處理組種子比CK 分別推遲5、10、10 和15 d 萌發(fā)。 由圖1 可知，低劑量(50 Gy)輻射可提高威靈仙種子發(fā)芽勢、發(fā)芽率和成苗率，較CK 分別增加3.47%，4.17%和6.37%；繼續(xù)增加輻射劑量，上述各指標均顯著下降。 將輻射劑量(y)與相應(yīng)的種子相對發(fā)芽率(x)進行回歸分析，得到回歸方程y=-1.670x+193(R2=0.911)，計算威靈仙種子輻射LD50為109.5 Gy。 就種子發(fā)芽而言，威靈仙種子輻射劑量以50 Gy 為宜。

2.2 137Cs-γ 射線輻射對威靈仙種子幼苗生長的影響

由表1 可知，137Cs-γ 射線輻射會造成幼苗分蘗數(shù)(圖2)和節(jié)數(shù)減少，節(jié)間長度和株高(圖3)減小。 CK幼苗分蘗數(shù)、株高、節(jié)數(shù)和節(jié)間長度變異系數(shù)均為最低，表明未經(jīng)過輻射處理的威靈仙幼苗長勢較整齊，且以上指標的最大值和最大均值都出現(xiàn)在CK 中，表明輻射對植株生長的影響主要表現(xiàn)為抑制作用。 輻射劑量對幼苗生長指標的變異效應(yīng)影響表現(xiàn)為100 Gy ＞150 Gy＞200 Gy＞50 Gy＞CK。

50 Gy 劑量處理組分蘗數(shù)變異植株比例在7月最高，達60%；100 Gy 劑量處理組分蘗數(shù)變異植株比例在7 和9月最高，均為80.00%；150 和200 Gy 劑量處理分蘗數(shù)變異植株比例在5-9月均達100%，表明較高的輻射劑量對幼苗分蘗能力的抑制效果顯現(xiàn)更早，且抑制作用和持續(xù)性都較強。 隨著輻射劑量的增加，植株矮化比例逐漸增加，200 Gy 劑量處理組植株矮化比例達到100%，表明高強度的輻射劑量對植株的矮化效應(yīng)更明顯。

圖2 5月威靈仙幼苗分蘗情況Fig.2 Tiller status of Clematis chinensis seedlings in May

圖3 5月威靈仙幼苗株高、節(jié)數(shù)、節(jié)間長度情況Fig.3 Seedling height，node number and internode length of Clematis chinensis seedlings in May

表1 137Cs-γ 射線輻射對威靈仙種子幼苗生長的影響Table 1 Effects of 137Cs-γ radiation on the growth of Clematis chinensis

2.3 137Cs-γ 射線輻射對威靈仙幼苗葉形變化的影響

依據(jù)鐵線蓮屬植物新品種DUS 測試指南對葉片形態(tài)的分類方法，將CK 葉形分為6 種(圖4、表2)，全株均有分布。 其中卵形葉(1 號)占比最高，占CK 葉片總數(shù)的60.71%，卵狀披針形葉(2 號)占比22.19%，具有以上2 種葉形的植株占比分別為93.33%和63.33%，卵形葉和卵狀披針形葉為威靈仙基礎(chǔ)葉形。按不同葉形的葉片數(shù)量由多到少排序為1 號＞2 號＞4號＞5 號＞6 號＞3 號，可見威靈仙植株自然葉形豐富。

輻射處理后幼苗出現(xiàn)了7 種變異葉型(圖5、表3)。其中倒卵狀橢圓形葉(8 號)占比最高(14.03%)，僅在50 Gy 劑量處理組出現(xiàn)。 圓形葉(13 號)占比最少(0.41%)。 按不同葉形的葉片數(shù)量由多到少排序為8號＞9 號＞11 號＞7 號＞10 號＞12 號＞13 號。 變異葉形中僅13 號葉邊全緣，表明輻射對葉緣鋸齒和葉裂的形成有促進作用。 7 號～13 號這7 種變異葉形主要出現(xiàn)在植株下部，其中7 號、11 號和12 號全部分布在植株下部，9 號在全株均有分布，其中有6.90%單獨分布在植株下部，10 號變異葉有42.11%單獨全部分布在下部，但8 號和13 號全部分布在植株上部。 表明多數(shù)葉形變異出現(xiàn)在幼苗生長的早期，隨生長期推進，輻射積累效應(yīng)有減弱的趨勢。

50 Gy 劑量處理組出現(xiàn)的變異葉形種類最多，有5種，占50 Gy 總?cè)~形種類的50%；150 Gy 劑量處理組出現(xiàn)的總?cè)~形種類最多，有11 種，其中變異葉形種類占比45.45%；100 Gy 劑量處理組變異葉形占比為40%。上述結(jié)果表明，在50 ～150 Gy 劑量范圍內(nèi)，葉形較易受輻射影響發(fā)生變異。

圖4 對照組(0 Gy)威靈仙葉形Fig.4 Leaf shape of Clematis chinensis without radiation dose treatment

表2 威靈仙幼苗葉形Table 2 Leaf shape of Clematis chinensis seedling

表3 137Cs-γ 射線輻射對威靈仙幼苗葉形變化的影響Table 3 Effects of 137Cs-γ radiation on the leaf shape change of Clematis chinensis seedling

2.4 137Cs-γ 射線輻射對威靈仙幼苗相對葉綠素含量的影響

相對葉綠素含量是定量描述葉片綠色度的指標[13]，其值高，植物能捕獲更多光能進行光合作用[14]。 由圖6 可知，50 ～200 Gy 劑量范圍內(nèi)，隨著輻射劑量的增加，威靈仙幼苗葉片的相對葉綠素含量呈下降趨勢，輻射劑量高于50 Gy 時，葉綠素合成受到抑制。 此外，葉片的相對葉綠素含量隨生育期推進整體呈增加趨勢，但其增幅隨輻射劑量增加而減小，50、100、150 和200 Gy 劑量處理組葉片相對葉綠素含量在9月分別較5月增加了2.41%、2.41%、1.12%和0。上述結(jié)果表明，隨著植株生長，137Cs-γ 射線輻射對葉綠素合成的抑制效應(yīng)呈消減趨勢。

圖5 輻射(50、100、150 Gy)處理后威靈仙變異葉形Fig.5 New leaf shape of Clematis chinensis after 50、100、150 Gy radiation dose treatment

圖6 137Cs-γ 射線輻射對威靈仙種子幼苗相對葉綠素含量的影響Fig.6 Effect of 137Cs-γ radiation on the relative chlorophyll content of Clematis chinensis

2.5 137Cs-γ 射線輻射對威靈仙幼苗葉綠素?zé)晒獾挠绊?/h3>

由表4 可知，隨著生長期的推移，各輻射處理的威靈仙幼苗Fv/Fm、Fv/Fo和ETR 均呈上升趨勢，表明植株光合能力在持續(xù)恢復(fù)和提升。 5、7 和9月的數(shù)據(jù)均值顯示，50 Gy 劑量輻射幼苗的Fv/Fm和ETR 較CK分別增加了0.99%和3.46%，輻射劑量繼續(xù)增加(100～200 Gy)，兩指標總體呈下降趨勢，說明低輻射劑量(50 Gy)對威靈仙PSⅡ利用光合的能力具有促進作用，而更高劑量(100～200 Gy)輻射下威靈仙的光合作用受到抑制。 NPQ 隨著輻射劑量的增加總體呈下降趨勢，相鄰處理中50 ～100 Gy 劑量輻射的降幅最大，達到14.11%；qP 在50 ～200 Gy 劑量范圍內(nèi)隨輻射劑量增加而增大，200 Gy 劑量輻射較CK 增加8.68%，表明在輻射導(dǎo)致的光抑制下，威靈仙會通過熱耗散的形式進行自我保護。 綜合各項指標認為，50 Gy 劑量輻射可以促進威靈仙利用光能，更高劑量輻射會使威靈仙光合作用受到抑制。

3 討論

LD50是指植物受到輻射后導(dǎo)致半數(shù)植物死亡的輻射劑量，輻射臨界劑量(LD40)是指受輻射植物存活率為對照組40%的輻射劑量[15]，是確定該植物(器官)適宜輻射劑量的重要參考標準。 目前LD50沒有統(tǒng)一的測定方法，通常采用種子發(fā)芽率、幼苗成活率、營養(yǎng)和生殖生長的抑制程度等指標來確定[16]。 適宜輻射劑量的選取也無統(tǒng)一標準，主要以植株成活率和有益變異性狀出現(xiàn)的概率進行綜合考量。 如熊云海等[17]將相對出苗率測算得到的LD50作為桂花輻射育種的適宜劑量；李奎等[18]用γ 射線照射黃牡丹種子后，發(fā)現(xiàn)經(jīng)40～60 Gy 處理的苗高是對照組的50%，因此將40～60 Gy 作為適宜劑量范圍；蔡春菊等[19]測定得到毛竹的LD40為175 Gy，毛竹對照組生長量70%的輻射劑量在100 Gy 左右，于是取100 ～175 Gy 為最適劑量范圍。 根據(jù)前人研究結(jié)果，本研究依據(jù)LD50兼顧變異比例和生長情況，來確定威靈仙的適宜劑量范圍。本研究中，輻照劑量在50～100 Gy 之間時，莖、葉變異比例高，且生長和光合系統(tǒng)運作狀況良好，此外，根據(jù)相對發(fā)芽率測定的威靈仙LD50為109.5 Gy，因此將威靈仙的適宜劑量范圍選為50～109.5 Gy。

表4 137Cs-γ 射線輻射對威靈仙幼苗葉綠素?zé)晒鈪?shù)的影響Table 4 Effects of 137Cs-γ radiation on chlorophyⅡfluorescence parameters of Clematis chinensis

輻射導(dǎo)致植物葉片形態(tài)變異較豐富，主要為單/復(fù)葉類型改變、葉緣改變和葉色改變。 如波士頓蕨在高劑量60Co-γ 射線輻射下葉片從一回羽狀復(fù)葉突變?yōu)槎赜馉顝?fù)葉[20]；板栗接穗經(jīng)10 ～40 Gy 劑量輻射后葉片面積增大，且葉片出現(xiàn)卷曲[21]；海州常山經(jīng)15 ～45 Gy 劑量輻射后葉面出現(xiàn)缺綠和葉斑[22]；鐵線蓮屬植物葉片形態(tài)多樣，且一個種類同時具有多種葉形的情況十分普遍[23]。 本研究中137Cs-γ 射線輻射誘導(dǎo)共得到7 種變異葉形，主要表現(xiàn)在葉緣、葉基部、葉先端和質(zhì)地，說明輻射對威靈仙葉形變異效應(yīng)顯著，對新品種選育具有積極作用。 但輻射對威靈仙花型、花色等觀賞性狀的影響還有待進一步深入探究。

葉綠素是捕獲光能的物質(zhì)基礎(chǔ)，其含量在一定程度上可反映植物同化物質(zhì)的能力[24]。60Co-γ 射線輻射使越南油茶璠龍無性系葉綠素含量降低[25]，廖安紅等[26]和桂仁意等[27]也證明60Co-γ 和137Cs-γ 射線輻射會破壞葉片光合色素含量，刺梨和毛竹幼苗的葉綠素含量均隨著輻射劑量增加而下降。 本研究中，與對照相比，威靈仙經(jīng)50 Gy 劑量輻射后其相對葉綠素含量并未出現(xiàn)顯著降低，表明低劑量輻射對葉綠素合成影響不顯著，而高于100 Gy 劑量的輻射會增加對葉綠素合成的抑制作用，這與白刺花幼苗受輻照后類似[28]。 葉綠素?zé)晒馀c光合作用中各個反應(yīng)過程緊密相關(guān)，逆境對光合作用各過程的影響都可通過植物體內(nèi)葉綠素?zé)晒庹T導(dǎo)動力學(xué)變化反映出來[29]，同時葉綠素?zé)晒鈪?shù)更能反映植物“內(nèi)在性”的特點[30]。 多花野牡丹Fv/Fm和Fv/Fo在0 ～55 Gy 劑量范圍內(nèi)均隨輻照劑量的增加呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢[31]，表明PSⅡ光能轉(zhuǎn)化率先上升后下降，下降的原因可能是輻射導(dǎo)致PSⅡ反應(yīng)中心運轉(zhuǎn)情況不良，這與本試驗中威靈仙受輻照后表現(xiàn)相同。 但何嶺等[22]對海州常山進行60Co-γ 輻射，發(fā)現(xiàn)Fv/Fm和Fv/Fo均隨輻射劑量的增加而降低，這可能是由于研究的材料有差別，或者試驗的輻射劑量不同。 qP 可以反映植物光合活性，電子傳遞活性越大，qP 越大。 輻射處理增加了葡萄葉片的qP[32]，本研究也得到相似結(jié)果，威靈仙受輻射后qP較對照組也有所增加。 結(jié)合各葉綠素?zé)晒鈪?shù)的表現(xiàn)，低劑量輻射可能會刺激植物中光合酶類的活性，使各指標表現(xiàn)提升，但過高的輻射劑量會破壞植物光合反應(yīng)中心，導(dǎo)致植物生長受阻。

4 結(jié)論

本研究利用137Cs-γ 射線輻射威靈仙種子，發(fā)現(xiàn)50～200 Gy 劑量范圍內(nèi)，低劑量(50 Gy)輻射會促進威靈仙種子發(fā)芽，幼苗成活和生長；輻射劑量高于50 Gy 時威靈仙種子受損，成活率下降，幼苗光合能力減弱，生長受到抑制。 50～109.5 Gy 劑量范圍內(nèi)，威靈仙幼苗莖、葉變異比例較高，矮化現(xiàn)象明顯，植株光合生理狀態(tài)與長勢較好，可作為威靈仙輻射育種適宜輻射劑量。