汪笑宇，戴媛媛，賈磊，王群山，陳春秀

天津渤海水產(chǎn)研究所，天津 300457

全氟辛烷磺酸鹽(perfluorooctane sulfonate, PFOS)有穩(wěn)定的C—F化學(xué)結(jié)構(gòu)，具有化學(xué)穩(wěn)定性高、耐熱性高和表面活性高的特點(diǎn)，是一種持久性有機(jī)污染物。PFOS作為表面活性制劑在工業(yè)以及民用領(lǐng)域應(yīng)用十分廣泛，例如紡織業(yè)、皮革、食品包裝和洗滌劑等。這些產(chǎn)品的大量使用使PFOS以各種途徑進(jìn)入到環(huán)境及生物體內(nèi)，并通過食物鏈逐級(jí)累積傳遞。

海洋是PFOS類污染物的最終歸宿[1]。近年來，世界多地的海水和海洋生物體內(nèi)不斷檢出PFOS。Gulkowska等[2]測(cè)得來自廣東省和浙江省的包括魚類、螃蟹、小蝦、牡蠣、蚌和蛤等27個(gè)海洋樣品中，PFOS濃度范圍為0.3～13.9 ng·g-1濕重。近年來，毒理學(xué)研究表明，PFOS進(jìn)入生物體內(nèi)能夠影響基因表達(dá)，改變生物酶活性，導(dǎo)致胚胎發(fā)育畸形，致使生物體重下降，影響膽固醇水平等[3-7]。長(zhǎng)期暴露于低濃度PFOS中，可導(dǎo)致斑馬魚胚胎脊柱畸形，大型蚤(Daphniamagna)的繁殖受到抑制[8]，使黃海膽(Glyptocidariscrenulares)DNA甲基化水平升高[9]等。Houde等[10]還發(fā)現(xiàn)處于相對(duì)較高營(yíng)養(yǎng)級(jí)的動(dòng)物體內(nèi)PFOS濃度較高。這說明，水環(huán)境和水生生物體內(nèi)的PFOS可通過食物鏈的傳遞和生物富集作用影響到更高營(yíng)養(yǎng)級(jí)生物，威脅人類的健康。因此，各國(guó)相繼出臺(tái)了各種措施限制禁止了PFOS類物質(zhì)的使用[11]，PFOS也迅速成為近年來人們關(guān)注的熱點(diǎn)[12]。

半滑舌鰨(Cynoglossussemilaevis)生長(zhǎng)快，適應(yīng)范圍廣，營(yíng)養(yǎng)價(jià)值高，近年來已成為增殖放流和人工養(yǎng)殖的最佳品種之一；在我國(guó)的黃渤海、東海和南海均有分布，以渤海、黃海海域?yàn)槎郲13]，是一種典型的近岸海洋海區(qū)魚類。目前，對(duì)半滑舌鰨的研究主要集中在各種環(huán)境因子對(duì)其生長(zhǎng)發(fā)育的影響[14-15]，以及各種金屬離子對(duì)半滑舌鰨的毒性作用方面[16]。黨紅蕾等[17]從細(xì)胞水平研究了PFOS對(duì)半滑舌鰨肝細(xì)胞的毒性效應(yīng)，表明PFOS對(duì)半滑舌鰨肝細(xì)胞具有一定的生物毒性。

本實(shí)驗(yàn)以半滑舌鰨為研究對(duì)象，首次從基因表達(dá)水平上，運(yùn)用RT-PCR分析半滑舌鰨熱休克蛋白70(heat shock 70kDa protein1,hsp70)、熱休克蛋白90(heat shock 90kDa protein,hsp90)、C型凝集素(c-type lectin domain,c-typelectin)和細(xì)胞色素氧化酶(cytochrome c oxidase,cox)等4種免疫相關(guān)基因在半滑舌鰨不同組織器官中隨時(shí)間的表達(dá)變化，從mRNA轉(zhuǎn)錄水平上探討PFOS對(duì)半滑舌鰨的毒性影響。為研究PFOS污染對(duì)健康養(yǎng)殖和海洋生態(tài)環(huán)境的影響，以及保護(hù)重要水產(chǎn)經(jīng)濟(jì)種類提供更多的理論依據(jù)。

1 材料與方法(Materials and methods)

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

半滑舌鰨幼魚取自天津市興盛海淡水養(yǎng)殖有限責(zé)任公司。實(shí)驗(yàn)魚體長(zhǎng)范圍為12～16 cm，6月齡，在實(shí)驗(yàn)室暫養(yǎng)一周以上，暫養(yǎng)期間無死亡。實(shí)驗(yàn)前一天停止投餌。選擇體型正常，反應(yīng)靈敏，大小基本一致，外觀無異?，F(xiàn)象的幼魚進(jìn)行隨機(jī)分組。

1.2 主要試劑及儀器

全氟辛烷磺酸鉀(C8F17KO3S)，純度為AR級(jí)(Sigma公司，美國(guó))，溶解于純度>99%的二甲基亞砜(dimethyl sulfoxide，DMSO)(上海生工)，配成濃度為10 g·L-1的母液，使用時(shí)稀釋成所需要的濃度。

Trizol(Invitrogen)，cDNA第一鏈合成試劑盒All-in-OneTMFirst-Strand cDNA Synthesis Kit(GeneCopoeia公司)，Platinum?SYBR?Green qPCR SuperMix-UDG(Life Technologies公司)，其他試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

Epgiadients PCR儀(Eppendorf，德國(guó))，ABI 7500實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀(Life Technologies公司，美國(guó))

1.3 染毒與取樣方法

根據(jù)預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果，實(shí)驗(yàn)濃度設(shè)置為2 mg·L-1，設(shè)置3個(gè)平行組，同時(shí)設(shè)有DMSO對(duì)照組。實(shí)驗(yàn)容器為40 L透明玻璃缸，每缸水量25 L，放入半滑舌鰨幼魚6～10尾，供試海水取自自然海水，經(jīng)沉淀池沉淀和砂濾后待用。實(shí)驗(yàn)期間海水pH值為7.6～8.0，溫度18～22 ℃。實(shí)驗(yàn)過程中晝夜曝氣，每天換水1/2。實(shí)驗(yàn)期間各組未出現(xiàn)死亡現(xiàn)象。

實(shí)驗(yàn)中分別于24 h、48 h、96 h和7 d取出半滑舌鰨的肝、鰓、腸和肌肉組織，每次每個(gè)時(shí)間點(diǎn)隨機(jī)取出5尾，其中將3尾魚的組織隨機(jī)合成一個(gè)樣本進(jìn)行測(cè)定，每個(gè)時(shí)間點(diǎn)共有3個(gè)平行樣本。組織取出后，用預(yù)冷的0.9%生理鹽水沖洗，濾紙吸干，稱重后裝袋密封，放入-80 ℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4 總RNA提取和第一鏈cDNA合成

將保存于-80 ℃冰箱的樣品取出后于冰上融化，按Trizol試劑說明書提取總RNA，電泳檢測(cè)完整性，核酸定量?jī)x檢測(cè)其濃度和純度，保證其OD260/OD280=1.8～2.0。利用DNaseI處理RNA，去除殘留的基因組DNA污染。

以總RNA(約1 μg)為模板，按照All-in-OneTMFirst-Strand cDNA Synthesis Kit (GeneCopoeia Cat. No. AORT-0050)說明書對(duì)各組織的總RNA進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，合成第一鏈cDNA。反應(yīng)產(chǎn)物4 ℃?zhèn)溆?，或?20 ℃保存。

1.5 引物設(shè)計(jì)及熒光定量PCR擴(kuò)增

1.5.1 引物設(shè)計(jì)

根據(jù)NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)上半滑舌鰨的相關(guān)基因序列，分別設(shè)計(jì)各基因的熒光定量PCR引物，相關(guān)基因包括hsp70、hsp90、c-typelectin和cox。選擇基因穩(wěn)定表達(dá)及片段大小合適的β-actin(putative beta-actin,β-actin)為內(nèi)參基因。具體序列與產(chǎn)物大小如表1所示。

1.5.2 熒光定量PCR擴(kuò)增

按照Platinum?SYBR?Green qPCR SuperMix-UDG試劑盒說明書進(jìn)行操作，在熒光定量?jī)xABI 7500 Fast Real-Time PCR system上進(jìn)行熒光定量PCR擴(kuò)增。反應(yīng)體系為20 μL，含cDNA模板1 μL，上、下游引物各2 μL(終濃度為0.2 μmol·L-1)，SYBR?Green qPCR SuperMix(2×)10 μL，以ddH2O補(bǔ)足體積。PCR反應(yīng)程序?yàn)椋?5 ℃預(yù)變性10 min；循環(huán)條件為95 ℃、15 s，60 ℃、30 s，72 ℃、30 s，PCR循環(huán)40。擴(kuò)增結(jié)束后進(jìn)行熔解曲線分析，確定PCR質(zhì)量，熔解曲線條件為95 ℃、15 s，60 ℃、1 min，95 ℃、15 s，60 ℃、15 s。

相對(duì)定量參考Livak和Schmittgen的方法[18]，運(yùn)用2-△△CT法計(jì)算目的基因的表達(dá)倍數(shù)，△△CT=(CT目的基因-CT管家基因)實(shí)驗(yàn)組-(CT目的基因-CT管家基因)對(duì)照組。

采用SPSS 23.0軟件對(duì)組間數(shù)據(jù)進(jìn)行單因素方差分析(One-Way ANOVA)，P<0.05、P<0.01表明差異顯著。所有結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示。

2 結(jié)果(Results)

在PFOS暴露期間，各對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組均無實(shí)驗(yàn)魚死亡及行為異常，說明實(shí)驗(yàn)濃度范圍內(nèi)PFOS對(duì)半滑舌鰨無可觀測(cè)的急性毒性作用。

2.1 PFOS暴露下hsp70 mRNA在半滑舌鰨各組織中的相對(duì)表達(dá)量分析

PFOS暴露對(duì)半滑舌鰨不同組織hsp70 mRNA表達(dá)的影響如圖1所示。半滑舌鰨hsp70 mRNA相對(duì)表達(dá)量在各組織中幾乎均上調(diào)。半滑舌鰨肝組織中hsp70 mRNA相對(duì)表達(dá)量高于對(duì)照組，在24 h達(dá)到峰值(P<0.05)，隨后呈現(xiàn)下降趨勢(shì)，至7 d時(shí)已基本恢復(fù)至對(duì)照組水平(P>0.05)(圖1(a))。鰓組織hsp70 mRNA表達(dá)量呈現(xiàn)先升高、再下降的趨勢(shì)，在48 h達(dá)到峰值(P<0.05)，至7 d時(shí)與對(duì)照組無顯著差異(P>0.05)(圖1(b))。腸組織中hsp70 mRNA表達(dá)量在48 h內(nèi)與對(duì)照組并無顯著差異(P>0.05)，96 h升高達(dá)到最高值(P<0.05)，隨后呈現(xiàn)下降趨勢(shì)。肌肉組織hsp70 mRNA的相對(duì)表達(dá)量呈現(xiàn)先下降后升高的趨勢(shì)，48 h降至最低(P<0.05)，96 h升高至峰值(P<0.05)，隨后7 d時(shí)回落至對(duì)照組水平(P>0.05)。

表1 實(shí)驗(yàn)所用的引物序列Table 1 Primers used for all the expriments

2.2 PFOS暴露下hsp90 mRNA在半滑舌鰨各組織中的相對(duì)表達(dá)量分析

PFOS暴露對(duì)半滑舌鰨不同組織hsp90 mRNA表達(dá)的影響如圖2所示。肝組織中hsp90 mRNA的表達(dá)量與對(duì)照組相比呈顯著性差異(P<0.05)，呈現(xiàn)先降低后升高，再降低的趨勢(shì)，在48 h達(dá)到最高值(P<0.05)(圖2(a))。鰓組織hsp90 mRNA表達(dá)量48 h和7 d時(shí)與對(duì)照組呈顯著性差異(P<0.05)(圖2(b))。腸組織hsp90 mRNA表達(dá)量呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢(shì)，在48 h和96 h達(dá)到頂峰，7 d后與對(duì)照組無顯著差異(P>0.05)。肌肉組織hsp90 mRNA表達(dá)量與對(duì)照組相比呈現(xiàn)顯著下調(diào)(P<0.05)。

2.3 PFOS暴露下c-type lectin mRNA在半滑舌鰨各組織中的相對(duì)表達(dá)量分析

PFOS暴露對(duì)半滑舌鰨不同組織c-typelectinmRNA表達(dá)的影響如圖3所示。隨著PFOS暴露時(shí)間的延長(zhǎng)，各組織中c-typelectinmRNA表達(dá)量均呈下調(diào)表達(dá)或表達(dá)水平不變。肝組織中c-typelectinmRNA表達(dá)呈下調(diào)趨勢(shì)，在24 h下降至最低點(diǎn)，隨后48 h～7 d時(shí)恢復(fù)至對(duì)照組水平(P>0.05)(圖3(a))。鰓組織中c-typelectinmRNA呈下調(diào)表達(dá)，其表達(dá)量呈現(xiàn)先下降再升高，再下降的趨勢(shì)，在7 d時(shí)達(dá)到最低值，與對(duì)照組相比呈顯著差異(P<0.05)(圖3(b))。腸組織中c-typelectinmRNA表達(dá)量與對(duì)照組沒有明顯差異(P>0.05)(圖3(c))。肌肉組織中c-typelectinmRNA各時(shí)間段表達(dá)量下調(diào)(P<0.05)，其相對(duì)表達(dá)量在48 h達(dá)到最低值(圖3(d))。

圖1 半滑舌鰨不同組織熱休克蛋白hsp70 mRNA表達(dá)量隨全氟辛烷磺酸鹽(PFOS)暴露時(shí)間的變化注：(a)肝，(b)鰓，(c)腸，(d)肌肉；*表示與對(duì)照組相比差異顯著(P<0.05)。Fig. 1 Changes of hsp70 mRNA expression in Cynoglossus semilaevis after exposure to perfluorooctane sulfonate (PFOS)Note: (a) Liver, (b) Gill, (c) Intestine, (d) Muscle; *means significant difference between PFOS treatment group and control group at 0.05 level.

圖2 半滑舌鰨不同組織hsp90 mRNA表達(dá)量隨PFOS暴露時(shí)間的變化注：(a)肝，(b)鰓，(c)腸，(d)肌肉；*表示與對(duì)照組相比差異顯著(P<0.05)。Fig. 2 Changes of hsp90 mRNA expression in Cynoglossus semilaevis after exposure to PFOSNote: (a) Liver, (b) Gill, (c) Intestine, (d) Muscle; *means significant difference between PFOS treatment group and control group at 0.05 level.

2.4 PFOS暴露下cox mRNA在半滑舌鰨各組織中的相對(duì)表達(dá)量分析

PFOS暴露對(duì)半滑舌鰨不同組織coxmRNA表達(dá)的影響如圖4所示。隨著PFOS暴露時(shí)間的延長(zhǎng)，肝組織中cox基因表達(dá)下調(diào)，其24 h和48 h的相對(duì)表達(dá)量顯著低于對(duì)照組(P<0.05)，96 h時(shí)coxmRNA表達(dá)量恢復(fù)至對(duì)照組水平(P>0.05)(圖4(a))。鰓組織中coxmRNA表達(dá)量呈現(xiàn)先升高再降低的趨勢(shì)，48 h時(shí)coxmRNA表達(dá)量升至最高點(diǎn)，與對(duì)照組差異顯著(P<0.05)(圖4(b))。腸組織中coxmRNA表達(dá)出現(xiàn)下調(diào)，其相對(duì)表達(dá)量在24 h和48 h顯著低于對(duì)照組(P<0.05)，在96 h恢復(fù)至對(duì)照組水平(P>0.05)(圖4(c))。肌肉組織中coxmRNA表達(dá)量在24 h與對(duì)照組差異顯著(P<0.05)，隨后于48 h和96 h回落至對(duì)照組水平(P>0.05)(圖4(d))。

3 討論(Discussion)

目前，PFOS的毒性作用機(jī)制雖尚未完全闡明，但大量研究表明，PFOS能引起多種生物的基因轉(zhuǎn)錄表達(dá)發(fā)生變化[19-22]。本實(shí)驗(yàn)選擇了hsp70、hsp90、c-typelectin和cox等4種可能與PFOS免疫毒性相關(guān)的基因，其中，hsp70和hsp90屬于熱休克蛋白家族，是生物體應(yīng)對(duì)外界壓力的標(biāo)志性基因；c-typelectin是固有免疫系統(tǒng)中的重要模式識(shí)別受體；cox是線粒體呼吸鏈的重要組成部分，其基因表達(dá)量變化可以直接反映出受到外界壓力時(shí)機(jī)體的能量運(yùn)轉(zhuǎn)情況。本研究通過RT-PCR技術(shù)檢測(cè)PFOS暴露24 h、48 h、96 h和7 d后，半滑舌鰨各組織中基因表達(dá)的變化，初步探討PFOS對(duì)半滑舌鰨的免疫毒性作用。

熱休克蛋白的主要功能是維持生物體內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)態(tài)。當(dāng)機(jī)體暴露在重金屬、有機(jī)物和高溫等惡劣條件下，機(jī)體發(fā)生應(yīng)激反應(yīng)，熱休克蛋白會(huì)大量表達(dá)，從而幫助機(jī)體每個(gè)細(xì)胞維持正常的生理活動(dòng)，阻止影響細(xì)胞健康的蛋白質(zhì)相互作用[23-24]。San-segundo等[19]認(rèn)為hsp70的激活可以由化學(xué)物質(zhì)和蛋白質(zhì)之間的直接相互作用產(chǎn)生，也可以由氧化應(yīng)激、離子穩(wěn)態(tài)或能量代謝抑制劑引起的細(xì)胞氧化還原狀態(tài)的擾動(dòng)所造成的損傷而產(chǎn)生。因此，PFOS作為hsp70誘導(dǎo)劑，可能直接或間接與熱休克蛋白發(fā)生相互作用，誘導(dǎo)hsp70的大量表達(dá)。筆者推測(cè)PFOS進(jìn)入機(jī)體細(xì)胞后，通過與熱休克轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合，使hsp70基因第一時(shí)間被激活并大量表達(dá)，為機(jī)體提供了主要的防御機(jī)制。具體的結(jié)合及調(diào)節(jié)機(jī)制還需進(jìn)一步的證實(shí)。

圖3 半滑舌鰨不同組織c-type lectin mRNA表達(dá)量隨PFOS暴露時(shí)間的變化注：(a)肝，(b)鰓，(c)腸，(d)肌肉；*表示與對(duì)照組相比差異顯著(P<0.05)。Fig. 3 Changes of c-type lectin mRNA expression in Cynoglossus semilaevis after exposure to PFOSNote: (a) Liver, (b) Gill, (c) Intestine, (d) Muscle; *means significant difference between PFOS treatment group and control group at 0.05 level.

研究表明，魚類肝臟是PFOS的主要富集場(chǎng)所[20]。在本實(shí)驗(yàn)中，hsp70基因在肝組織中的相對(duì)表達(dá)在24 h達(dá)到峰值，達(dá)到對(duì)照組的23倍左右，表達(dá)高峰值的出現(xiàn)也早于其他組織，這表明，肝組織對(duì)PFOS脅迫反應(yīng)較為靈敏，在受到應(yīng)激反應(yīng)后迅速啟動(dòng)了hsp70基因的表達(dá)。Kr?vel等[20]也發(fā)現(xiàn)類似現(xiàn)象，將大西洋鮭的肝細(xì)胞體外分離后，將其暴露于15 mg·L-1的PFOS中24 h后，hsp70 mRNA表達(dá)量顯著增加。PFOS還能夠引起肝細(xì)胞結(jié)構(gòu)和細(xì)胞膜的交互功能損傷[25-27]。因此，在受到PFOS脅迫后，肝是發(fā)生免疫應(yīng)激反應(yīng)的主要器官，在應(yīng)對(duì)有毒物質(zhì)入侵的免疫反應(yīng)中占據(jù)重要地位。

通過實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)發(fā)現(xiàn)，半滑舌鰨鰓、腸和肌肉中的hsp70基因的相對(duì)表達(dá)在48 h或96 h達(dá)到峰值，表達(dá)量是對(duì)照組的2～5倍左右。而在長(zhǎng)時(shí)間受到PFOS脅迫后，hsp70基因的表達(dá)都呈現(xiàn)下降趨勢(shì)，肝、鰓和肌肉組織在PFOS脅迫7 d時(shí)hsp70基因表達(dá)量均已恢復(fù)至對(duì)照組水平，推測(cè)當(dāng)脅迫時(shí)間超過一定限度時(shí)，魚體免疫功能逐漸下降，從而導(dǎo)致hsp70表達(dá)慢慢回落；也可能是hsp70只參與了魚類機(jī)體對(duì)抗有毒物質(zhì)的應(yīng)急機(jī)制，隨著脅迫時(shí)間的延長(zhǎng)，機(jī)體啟動(dòng)另一套免疫機(jī)制來對(duì)抗有毒物質(zhì)的入侵。東亞三角渦蟲[28]和大西洋鮭[20]的暴露實(shí)驗(yàn)結(jié)果也表明，暴露于PFOS中24 h后，hsp70 mRNA表達(dá)顯著上升，暴露于PFOS中48 h后，其表達(dá)量明顯下降，與本實(shí)驗(yàn)的研究結(jié)果一致。

圖4 半滑舌鰨不同組織cox mRNA表達(dá)量隨PFOS暴露時(shí)間的變化注：(a)肝，(b)鰓，(c)腸，(d)肌肉；*表示與對(duì)照組相比差異顯著(P<0.05)。Fig. 4 Changes of cox mRNA expression in Cynoglossus semilaevis after exposure to PFOSNote: (a) Liver, (b) Gill, (c) Intestine, (d) Muscle; *means significant difference between PFOS treatment group and control group at 0.05 level.

熱休克蛋白hsp90在進(jìn)化上高度保守，廣泛分布于從原核到真核的各類生物體內(nèi)，在水生動(dòng)植物的誘導(dǎo)表達(dá)研究中發(fā)現(xiàn)，hsp90可以參與水生動(dòng)植物對(duì)熱激和冷激、高鹽和低鹽以及對(duì)低溶氧的耐受，還參與了疾病防御、發(fā)育調(diào)控等方面的生理過程[29]。本研究中，hsp90在半滑舌鰨肝、腸中均呈現(xiàn)了先升高再降低的趨勢(shì)，在48 h達(dá)到最大值，7 d后恢復(fù)至對(duì)照組水平。在脅迫條件下，hsp90通過降解變性蛋白和運(yùn)送蛋白質(zhì)而保護(hù)有機(jī)體免受不利環(huán)境脅迫傷害，因此，hsp90基因表達(dá)升高是機(jī)體對(duì)脅迫導(dǎo)致的變性蛋白質(zhì)增多做出的響應(yīng)。隨著脅迫時(shí)間進(jìn)一步延長(zhǎng)，機(jī)體組織細(xì)胞受到損傷，降低了正常細(xì)胞的代謝能力，導(dǎo)致了hsp90表達(dá)降低。鰓組織中hsp90基因的相對(duì)表達(dá)量在7 d后達(dá)到峰值，可能是由于全氟化合物具有生物積累作用，隨著積累量的增加，hsp90在7 d后表達(dá)才達(dá)高峰，一定程度上反映了PFOS積累量與鰓組織免疫機(jī)能的關(guān)系。肌肉組織hsp90基因的相對(duì)表達(dá)受到抑制，這可能與基因表達(dá)的組織特異性有關(guān)，肌肉組織不是關(guān)鍵的免疫器官，因此，在機(jī)體受到PFOS脅迫時(shí)，體內(nèi)的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)體系優(yōu)先上調(diào)或正常表達(dá)免疫相關(guān)的組織中的hsp90基因。

本研究結(jié)果也表明，hsp70和hsp90基因在半滑舌鰨各組織中出現(xiàn)時(shí)序性表達(dá)，肝組織中hsp70和hsp90達(dá)到最大值的時(shí)間點(diǎn)分別是24 h和48 h，hsp90較hsp70延遲；鰓組織中hsp70在48 h達(dá)到峰值，而hsp90在7 d后再次上升至峰值；腸組織中達(dá)到峰值的時(shí)間分別是96 h和48 h，hsp70較hsp90延遲。這表明，hsp70和hsp90雖都是熱休克蛋白家族的成員，但在半滑舌鰨受到PFOS脅迫過程中，它們?cè)诓煌M織中的響應(yīng)機(jī)制完全不同。本研究中，同一基因在不同組織的表達(dá)具有一定的組織特異性，這與組織的功能定位及基因參與不同的免疫通路等有關(guān)，具體的調(diào)節(jié)機(jī)制還有待進(jìn)一步研究。

c-type lectin是一類具有糖識(shí)別結(jié)構(gòu)域(carbon hydrate recognition domain, CRD)的蛋白超家族，在進(jìn)化中存在高度保守序列，作為模式識(shí)別蛋白參與了眾多動(dòng)物的先天免疫[30-34]。目前，關(guān)于c-typelectin基因表達(dá)的報(bào)道多集中于其在生物體感染致病微生物的過程中發(fā)揮重要的免疫功能[35-36]。Feng等[37]發(fā)現(xiàn)，羅氏沼蝦在受到副溶血弧菌和白斑綜合征病毒(WSSV)刺激后，鰓和腸中的MrLec基因表達(dá)量均上調(diào)。Wang等[38]發(fā)現(xiàn)，仿刺參在受到燦爛弧菌刺激后，體腔細(xì)胞中的CTL-2 mRNA表達(dá)水平顯著上升。

本研究中，c-typelectin基因表達(dá)量與對(duì)照組相比呈顯著下調(diào)或無明顯差異。肝、鰓和肌肉組織中c-typelectin基因表達(dá)水平在PFOS脅迫后都出現(xiàn)了顯著降低的情況，腸組織中c-typelectin基因表達(dá)水平在PFOS脅迫后沒有顯著性變化，與致病微生物刺激后c-typelectin的基因表達(dá)趨勢(shì)不同。趙芳芳等[39]單獨(dú)用鎘脅迫河南華溪蟹不同時(shí)間，肝胰腺、血淋巴中的ShLec21和ShLec23表達(dá)量沒有顯著性變化；而鎘脅迫河南華溪蟹后再經(jīng)細(xì)菌感染后，肝胰腺和血淋巴中ShLec21和ShLec23表達(dá)量在有些時(shí)間段上調(diào)。本研究中，除了腸組織，肝、鰓和肌肉組織中的c-typelectin基因在PFOS暴露后均有表達(dá)下調(diào)而后又上升的情況，可能是由于c-typelectin基因并不參與PFOS的免疫識(shí)別，暴露初期，魚體免疫系統(tǒng)為應(yīng)激防御有毒物質(zhì)，從而降低了不相關(guān)基因的表達(dá)，而PFOS暴露損傷了魚體的免疫系統(tǒng)，進(jìn)而導(dǎo)致水體中致病菌的入侵，c-typelectin基因此時(shí)才啟動(dòng)表達(dá)。綜上可知，不同的外源刺激對(duì)生物體內(nèi)c-typelectin基因表達(dá)的影響也不相同，C型凝集素作為一種模式識(shí)別受體，其特有的結(jié)構(gòu)域能夠識(shí)別、結(jié)合微生物并在其免疫防御過程中發(fā)揮重要作用，而對(duì)非生物因子刺激，C型凝集素扮演什么樣的角色還有待進(jìn)一步研究。

細(xì)胞色素c氧化酶(cox)是線粒體呼吸鏈電子傳遞的終末復(fù)合物，是線粒體呼吸鏈的主要限制酶，cox基因表達(dá)量的變化可以反映整條呼吸鏈的效率[40]。而機(jī)體在受到外來物質(zhì)刺激時(shí)，其蛋白質(zhì)利用及糖類的代謝都會(huì)大大增加，這些代謝的加快都需要依賴能量的供應(yīng)，因此，線粒體呼吸鏈的能量供應(yīng)與機(jī)體的免疫機(jī)能息息相關(guān)。黨紅蕾等[17]對(duì)半滑舌鰨肝臟細(xì)胞系進(jìn)行PFOS染毒，發(fā)現(xiàn)低濃度PFOS(20 μmol·L-1)進(jìn)入細(xì)胞后，通過與線粒體呼吸鏈輔酶結(jié)合，產(chǎn)生活性氧(ROS)并阻礙三磷酸腺苷(ATP)合成過程，產(chǎn)生一系列反應(yīng)從而誘導(dǎo)細(xì)胞啟動(dòng)DNA修復(fù)。本研究中，魚體暴露于PFOS后，鰓組織和肌肉中cox基因相對(duì)表達(dá)量分別在24 h和48 h上調(diào)至峰值，隨后回落。Achard-Joris等[41]認(rèn)為cox基因上調(diào)是為了更有效地消耗分子氧并彌補(bǔ)線粒體活力的下降，通過減少細(xì)胞中的活性氧來降低PFOS對(duì)機(jī)體細(xì)胞的損害。而肝和腸組織中cox基因相對(duì)表達(dá)量顯著下調(diào)，推測(cè)PFOS所造成的損傷超出細(xì)胞自身修復(fù)能力導(dǎo)致了cox基因表達(dá)的下降。以上結(jié)果表明，PFOS能夠?qū)ox基因表達(dá)產(chǎn)生影響，進(jìn)而影響魚體線粒體能量供應(yīng)以及細(xì)胞的正常運(yùn)轉(zhuǎn)。

PFOS可影響多種免疫相關(guān)基因的表達(dá)，本實(shí)驗(yàn)僅選取了其中4個(gè)基因?qū)FOS的免疫毒性進(jìn)行了初步探討，PFOS的對(duì)機(jī)體的免疫毒性機(jī)制還遠(yuǎn)不能被準(zhǔn)確闡述，還有待于大量實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)的積累，并需要結(jié)合功能蛋白的表達(dá)等多方面的研究結(jié)果進(jìn)行綜合分析。目前，PFOS的生產(chǎn)和使用已受到嚴(yán)格控制，其在自然水域中的濃度遠(yuǎn)低于本文中的實(shí)驗(yàn)濃度，但是PFOS在生態(tài)系統(tǒng)中的富集效應(yīng)會(huì)對(duì)食物鏈高端生物構(gòu)成潛在威脅，因此，對(duì)PFOS毒性仍需作進(jìn)一步研究。