龍立慧，黃興龍，李新建，馬子力，張麗艷*，羅 君

(1.貴州中醫(yī)藥大學(xué)，貴州 貴陽550025；2.貴州中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院，貴州 貴陽 550001)

忍冬最早出現(xiàn)于《名醫(yī)別錄》中，被列為上品[1]，《新修本草》中有關(guān)于忍冬葉、藤描述：“其嫩莖有毛，葉似胡豆亦上下有毛，花白蕊紫?！薄侗静萁?jīng)集注》中以“十二月采，陰干”描述忍冬，而忍冬花的花期在春夏季，因此可以推理出當(dāng)時用的是葉或藤。在宋代時期之前多以忍冬的葉、藤入藥。而在宋代以后，才開始使用忍冬花，如李時珍在《本草綱目》中認(rèn)為忍冬莖葉與花功效相同，說明此時忍冬的花葉一同入藥[2]?，F(xiàn)有研究多集中在花和藤的化學(xué)成分、藥理作用上，對于其他部位的研究較少。有研究報道，忍冬葉的藥理活性與金銀花相當(dāng)或優(yōu)于金銀花，其功效除受綠原酸含量的影響外，還與其他活性成分有關(guān)[3]。

忍冬葉為忍冬科(Caprifoliaceae)忍冬屬(Lonicera)植物忍冬(LonicerajaponicaThunb.)的干燥葉[4]，收載于2002年版《山東省中藥材標(biāo)準(zhǔn)》，與《中國藥典》(2015年版)中金銀花是同科、同屬、同種，不同的用藥部位，忍冬花和忍冬藤均被載入中國藥典，而忍冬葉目前尚未收載入《中國藥典》[5]。《山東省中藥材標(biāo)準(zhǔn)》對忍冬葉中綠原酸的TLC鑒別、含量測定進(jìn)行了研究，而木犀草苷的研究尚未收載。此外，貴州省地區(qū)(龍里、安順、興義、畢節(jié)、六盤水等地)忍冬葉的產(chǎn)量、使用量較大，但并未被納入《貴州省中藥材質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)》之中。

基于此，本研究建立貴州省不同產(chǎn)地忍冬葉藥材的完整薄層定性鑒別方法，一方面可避免忍冬資源的浪費，為最大程度地合理利用忍冬資源提供科學(xué)依據(jù)。另一方面可為貴州省中藥材、民族藥材的新增藥材奠定研究基礎(chǔ)。

1 材料與儀器

1.1 藥材

樣品于2017年采自貴州省各區(qū)縣，陰干。藥材經(jīng)貴州中醫(yī)藥大學(xué)植物栽培教研室魏升華教授鑒定為忍冬科植物忍冬LonicerajaponicaThund.的干燥葉。藥材信息見表1。

表1 藥材來源

1.2 儀器

HH-6電熱恒溫水浴鍋(北京科偉永興儀器有限公司)；ZF7紫外分析儀(鞏義市予華儀器有限責(zé)任公司)；XS105DU電子分析天平(梅特勒-托利多儀器上海有限公司)。

1.3 試藥

乙酸乙酯、乙酸丁酯、丙酮、甲酸、水(蒸餾水)、甲醇、乙醇、均為分析純；硅膠G板(批號：20151012、20180404；廠家：青島海洋化工廠、煙臺江友硅膠開發(fā)有限公司)；綠原酸對照品(批號：110753-201716)、木犀草苷對照品(批號：1172-201609)均購于中國食品藥品檢定研究院。

2 實驗方法

2.1 對照品及供試品溶液制備

2.1.1 綠原酸對照品溶液 取綠原酸對照品適量，精密稱定，加甲醇制成約1 mg/mL的溶液，作為對照品溶液1。

2.1.2 木犀草苷對照品溶液 取木犀草苷對照品適量，精密稱定，加70%乙醇制成約40 μg/mL的溶液，作為對照品溶液2。

2.1.3 供試品溶液 取干燥至恒重的忍冬葉藥材粉末0.5 g，精密稱定，用50 mL甲醇溶劑進(jìn)行超聲(功率：250 W，頻率為40 kHz)提取45 min后濾過，提取液水浴蒸干，殘渣加入5 mL甲醇溶解作為供試品溶液。

2.2 展開體系

綠原酸展開劑為乙酸乙酯∶丙酮∶甲酸∶水(7∶3∶1∶1.2)；木犀草苷展開劑為乙酸丁酯∶甲酸∶水(7∶2.5∶2.5)取上層溶液，均采用1%三氯化鐵為顯色劑。

2.3 耐用性考察

2.3.1 薄層板考察 參照薄層色譜法2015年版中國藥典四部通則0502試驗。取供試品溶液10 μL、對照品溶液5 μL，依次點于硅膠G板上，采用“2.2”項下展開體系，分別對自制、青島、煙臺硅膠G板進(jìn)行考察。結(jié)果顯示，忍冬葉綠原酸與木犀草苷在不同硅膠G板上所呈現(xiàn)的色譜行為基本一致，表明該方法對不同廠家生產(chǎn)的硅膠G板均具有良好的適應(yīng)性。如圖1、圖2所示。

注：1.綠原酸；2-5.樣品

注：1.木犀草苷；2-5.樣品

2.3.2 溫度考察 參照薄層色譜法2015年版中國藥典四部通則0502試驗。取供試品溶液10 μL、對照品溶液5 μL，依次點于硅膠G板上，采用“2.2”項下展開體系，分別在40 ℃、5 ℃下對該方法進(jìn)行考察。經(jīng)考察，在高溫和低溫狀態(tài)下均可達(dá)到較好的分離效果，表明溫度對該薄層色譜的影響較小。如圖3、圖4所示。

注：1.綠原酸；2-5.樣品

注：1.木犀草苷；2-5.樣品

2.3.3 相對濕度考察 參照薄層色譜法2015年版中國藥典四部通則0502試驗。取供試品溶液10 μL、對照品溶液5 μL，依次點于硅膠G板上，采用“2.2”項下展開體系，分別在相對濕度86%、54%、24%環(huán)境下對該方法進(jìn)行考察。結(jié)果在不同相對濕度下，所呈現(xiàn)的色譜行為基本一致，表明濕度對該薄層色譜的影響較小。如圖5、圖6所示。

注：1.綠原酸；2-5.樣品

注：1.木犀草苷；2-5.樣品

3 實驗結(jié)果

3.1 綠原酸薄層鑒別

參照薄層色譜法2015年版中國藥典四部通則0502試驗。吸取上述供試品溶液10 μL，對照品溶液5 μL，分別點于同一硅膠G薄層板上，以乙酸乙酯∶丙酮∶甲酸∶水(7∶3∶1∶1.2)為展開劑，展開，取出，晾干，噴以1%三氯化鐵溶液，在105 ℃加熱至斑點顯色清晰。薄層色譜圖中，供試品與對照品色譜相應(yīng)的位置上顯相同顏色的斑點。如圖7所示。

注：1.綠原酸對照品；2-16.樣品

3.2 木犀草苷薄層鑒別

參照薄層色譜法2015年版中國藥典四部通則0502試驗。吸取上述供試品溶液10 μL，對照品溶液5 μL，分別點于同一硅膠G薄層板上，以乙酸丁酯∶甲酸∶水(7∶2.5∶2.5)上層溶液為展開劑，展開，取出，晾干，噴以1%三氯化鐵溶液，在105 ℃加熱至斑點顯色清晰。在薄層色譜圖中，供試品與對照品色譜相應(yīng)的位置上顯相同顏色的斑點。如圖8所示。

注：1.木犀草苷；2-16.樣品

4 討論

薄層色譜鑒別是中藥質(zhì)量控制常用的定性鑒別方法，具有快速、直觀、信息量大的特點，能夠辨別藥材真?zhèn)渭耙欢ǔ潭壬戏从乘幉牡馁|(zhì)量。本研究前期對超聲、回流提取兩種方法進(jìn)行了考察，結(jié)果超聲與回流處理的薄層色譜斑點相差不大，供試品與對照品在相應(yīng)的位置上有相同顏色的斑點，且分離效果較好，但超聲處理操作簡便、快捷，因此，最終選擇超聲為忍冬葉的提取方法。樣品經(jīng)超聲處理后，可同時用于綠原酸、木犀草苷的薄層鑒別，同時也是本研究的優(yōu)勢之一，且該提取方法操作簡單，可作為忍冬葉薄層鑒別的提取方法。通過考察綠原酸、木犀草苷的不同展開系統(tǒng)，最后確定了綠原酸以乙酸乙酯∶丙酮∶甲酸∶水(7∶3∶1∶1.2)為展開劑，1%三氯化鐵溶液為顯色劑；木犀草苷以乙酸丁酯∶甲酸∶水(7∶2.5∶2.5)上層溶液為展開劑，1%三氯化鐵溶液為顯色劑。二者薄層色譜圖中供試品與對照品在相應(yīng)的位置均顯示相同顏色的斑點，斑點分離度較好，且清晰、圓整、明顯。本研究建立的忍冬葉薄層鑒別方法操作簡便、專屬性強(qiáng)、重現(xiàn)性好、結(jié)果可靠，進(jìn)一步完善了忍冬葉藥材的定性鑒別，為黔產(chǎn)忍冬葉的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)建立提供了實驗基礎(chǔ)，豐富了貴州省中藥材、民族藥材的應(yīng)用種類。