陳竑明，徐 杰

(1.福建中醫(yī)藥大學 中醫(yī)學院，福建 福州 350100；2.福建醫(yī)科大學附屬福建省立醫(yī)院，福建 福州 350001)

骨質(zhì)疏松癥是由于多種原因?qū)е碌墓橇肯陆?，結(jié)構(gòu)破壞，脆性增加，跌倒和骨折發(fā)生風險升高的一種全身性骨病。多見于絕經(jīng)后女性和老年人。近年來對于骨質(zhì)疏松的研究大多集中在對骨的“質(zhì)”和“量”的方面，而忽視了骨骼肌。早期有對絕經(jīng)后婦女的臨床研究表明[1]：老年人的骨骼-肌肉系統(tǒng)的退行性變會造成骨量減少，進而引起運動能力下降、骨脆性增加，增加骨折的發(fā)生概率，最終導致老年人生活質(zhì)量下降。肌肉的協(xié)調(diào)性紊亂或平衡性障礙是導致摔倒、骨質(zhì)疏松骨折的主要誘因。近期也有國內(nèi)專家提出[2]，肌肉和骨骼共同組成運動系統(tǒng)，兩者的分泌因子和應(yīng)力關(guān)系對對方有重要的影響，故骨質(zhì)疏松的治療上也應(yīng)該二者共同著手。Akt蛋白是一種絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，參與調(diào)控細胞的代謝、增值、凋亡、生存等。Akt在哺乳動物有3個家族基因(Akt1、Akt2、Akt3)，有研究表明[3]Akt1、Akt2基因敲除的大鼠表現(xiàn)為骨骼、肌肉的發(fā)育不全，故Akt基因、蛋白與肌肉骨骼的發(fā)育密切相關(guān)。另外，國內(nèi)近年有研究表明[4-5]，2.5月齡雌性大鼠去勢3月后，骨組織Akt1、Akt2基因、蛋白表達水平相對空白組反而升高，考慮破骨細胞活性大于成骨細胞，但肌肉組織表達水平是下降的。因此，提出檢測骨質(zhì)疏松大鼠的骨骼肌Akt蛋白、基因水平也是很有意義的。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

健康的雌性未孕清潔級SD大鼠40只，體重(200～220 g)，3月齡，購于上海萊克斯動物實驗公司，生產(chǎn)許可證號：SCXK(滬)2012-0002，委托福建省中醫(yī)藥研究院清潔級動物房正常喂養(yǎng)至6月齡，體重約(270～300 g)，后續(xù)繼續(xù)喂養(yǎng)、干預于福建省中醫(yī)藥研究院清潔級動物房。實驗過程完全符合福建省中醫(yī)藥研究院倫理委員會標準。

1.2 主要儀器及試劑

總Akt多克隆鼠抗、總p-Akt(Ser-473)多克隆鼠抗以及β-actin多克隆鼠抗(均購于美國Proteintech公司)，R401-RNA分離液總RNA提取試劑(購于南京諾維贊公司)，拜耳戊酸雌二醇片(批號：J20171038)；龜鹿二仙膠各藥配伍為：鹿角膠6 g，龜甲9 g，枸杞子9 g，人參6 g，藥材購自福建中醫(yī)藥大學國醫(yī)堂濃縮中藥顆粒劑藥房(濃縮比例分別為鹿角膠1∶1，龜甲1∶10，人參1∶5，枸杞子1∶5)。

1.3 模型制備及分組

將喂養(yǎng)至6月齡的40只SD大鼠，按隨機數(shù)字表法分為假手術(shù)組(n=10)、模型組(n=10)、中藥組(n=10)，雌激素組(n=10)。四組大鼠均腹腔注射：①動物稱重，用2%戊巴比妥鈉片40 mg/kg腹腔注射麻醉；②腹部正中切口，探及左右端卵巢，假手術(shù)組切除卵巢周圍適量脂肪，行結(jié)扎切除術(shù)，往術(shù)口內(nèi)滴入少量青霉素溶液，縫合傷口，碘伏消毒術(shù)口；③術(shù)后3天連續(xù)給予肌注青霉素預防感染(8萬單位/只)；④縫合切口后普通飼料喂養(yǎng)、自由飲水和活動。

1.4 干預方法

術(shù)后第二周開始灌胃。按人與大鼠體表面積換算法給藥，人與大鼠給藥比約為1∶6.3，使用人臨床用藥的中劑量(鹿角膠 540 mg/kg、龜甲 81 mg/kg、人參108 mg/kg、枸杞 162 mg/kg)中藥組給方劑量為 5.1 g/kg，雌激素組采用戊酸雌二醇片，生理鹽水稀釋，以 0.104 mg/kg灌胃，固定每天早晨9點。假手術(shù)組、模型組與等量生理鹽水灌胃。連續(xù)干預12周。

1.5 指標檢測

1.5.1 活體骨密度(BMD)和骨礦含量(BMC)測定 應(yīng)用福建省中醫(yī)藥研究院小動物雙能X線(美國HOLOGIC DISCOVER W型雙能X線骨密度儀)，10%水合氯醛麻醉，對各組大鼠腰椎和雙下肢進行活體BMC和BMD的測量。

1.5.2 標本采集 雙能X線檢測后，隔天用2%戊巴比妥鈉片40 mg/kg腹腔注射麻醉，迅速分離大鼠雙層腓腸肌，生理鹽水沖洗數(shù)秒，放入凍存管后迅速移動至液氮罐中保存，24 h后移至-80 ℃冰箱保存。

1.6 指標檢測

1.6.1 RT-PCR檢測腓腸肌Akt-1的mRNA的表達量 預先制備好瓊脂糖凝膠，從-80 ℃取出組織塊，切取約50 mg組織塊，放入2 mL EP管中，加入1 mL Trizol和兩顆直徑0.3 mm磁珠，放入研磨機研磨60 s，頻率60 Hz。研磨后加入氯仿200 mL離心，取上清400 mL移至新EP管，加入異丙醇400 mL離心、沉淀、棄上清液。加入75%乙醇離心、沉淀、棄上清液，重復3次，加入約200 μL DEPC水稀釋。采用紫外分光光度計檢測提取的RNA質(zhì)量。進行反轉(zhuǎn)錄：50 ℃ 15 min，85 ℃ 2 min，進行PCR反應(yīng)：94 ℃ 3 min→(94 ℃10 s→55 ℃ 15 s→72 ℃ 1 min)×35個循環(huán)→72 ℃ 5 min，在凝膠中每孔上樣8 μL，橫流100 mA電泳。Bio-rad成像儀拍攝圖像，Image Lab 3.0分析熒光強度。引物序列見表1。

表1 引物序列

1.6.2 Western Blot檢測骨骼肌總Akt表達量及Akt磷酸化水平 預先在每個2 mL EP管中加入1 mL增強型RIPA裂解液、10 μL廣譜蛋白酶抑制劑、10 μL廣譜磷酸化酶抑制劑、2顆直徑3 mm磁珠，切取約100 mg腓腸肌組織，低溫迅速勻漿、離心、沉淀，取上清800 μL，分裝。加入上樣緩沖液后，95 ℃變性10 min，10%濃度SDS-PAGE凝膠電泳。電泳后取出凝膠，220 mA橫流轉(zhuǎn)膜60 min至0.45 μm聚偏二氟乙烯膜(polyvinylidene fluoride，PVDF膜)。3%牛血清蛋白封閉液室溫搖床封閉2 h。一抗用一抗稀釋液稀釋1∶5 000，4 ℃搖床孵育16～17 h；TBST搖床清洗(3×10 min)，二抗用二抗稀釋液稀釋1∶5 000，室溫搖床孵育1 h。TBST搖床清洗(3×10 min)。均勻在PVDF膜上滴加高效化學發(fā)光顯影液，靜置1 min，用bio-rad成像系統(tǒng)在暗室下曝光20 s，曝光20張圖，間隔1 s，保存圖像。以β-actin為內(nèi)參，用Image Lab 3.0分析圖像并計算光密度值。

1.7 統(tǒng)計學分析

運用SPSS 19.0統(tǒng)計學軟件進行實驗數(shù)據(jù)分析，結(jié)果以(均值±標準差)表示，組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較則采用LSD多重檢驗分析。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠活體腰椎及下肢骨密度

治療12周后，模型組BMD明顯低于假手術(shù)組(P<0.05)，說明骨質(zhì)疏松大鼠模型成功，中藥組和雌激素組BMD明顯高于模型組(P<0.05)，中藥組和雌激素組骨密度無明顯差異(P>0.05)。說明雌性去勢骨質(zhì)疏松大鼠造模成功。結(jié)果見表2。

組別BMD(g/cm2)假手術(shù)組2.10±0.03#模型組1.92±0.04龜鹿二仙膠組2.01±0.05#?雌激素組2.00±0.04#&

注：#與模型組比較(P<0.05)；*與雌激素組比較(P>0.05)；&與中藥組比較(P>0.05)。

2.2 各組大鼠腓腸肌組織Akt1mRNA表達量

模型組Akt1mRNA表達量明顯低于假手術(shù)組(P<0.05)，雌激素組和龜鹿二仙膠組高于模型組(P<0.05)，而雌激素組和龜鹿二仙膠組無明顯差異(P>0.05)。結(jié)果見表3。

組別Akt1/GAPDH假手術(shù)組0.995±0.055#模型組0.5065±0.095龜鹿二仙膠組0.7625±0.1025#?雌激素組0.7315±0.0615#&

注：#與模型組比較(P<0.05)；*與雌激素組比較(P>0.05)；&與中藥組比較(P>0.05)。

2.3 各組大鼠腓腸肌組織Akt蛋白表達量

模型組Akt以及p-Akt蛋白表達量明顯低于假手術(shù)組(P<0.05)，雌激素組和龜鹿二仙膠組高于模型組(P<0.05)，而雌激素組和龜鹿二仙膠組無明顯差異(P>0.05)。結(jié)果見表4、表5。

組別Akt/β-actin假手術(shù)組0.806±0.053#模型組0.321±0.034龜鹿二仙膠組0.551±0.044#?雌激素組0.522±0.066#&

注：#與模型組比較(P<0.05)；*與雌激素組比較(P>0.05)；&與中藥組比較(P>0.05)。

組別p-Akt/β-actin假手術(shù)組0.456±0.030#模型組0.194±0.024龜鹿二仙膠組0.329±0.060#?雌激素組0.323±0.052#&

注：#與模型組比較(P<0.05)；*與雌激素組比較(P>0.05)；&與中藥組比較(P>0.05)。

3 討論

骨質(zhì)疏松癥最嚴重的并發(fā)癥是骨質(zhì)疏松骨折，而肌肉的協(xié)調(diào)性紊亂或平衡性障礙是導致摔倒、骨質(zhì)疏松骨折的主要誘因[6]。而目前大多數(shù)治療集中于提高骨密度和改善骨骼微觀結(jié)構(gòu)上，近年來一些基礎(chǔ)研究開始關(guān)注骨骼肌，但臨床研究仍比較少。骨骼-肌系統(tǒng)的發(fā)育、功能及衰老是一個有機整體，骨骼肌數(shù)量是決定骨密度的重要因素，骨骼肌的丟失可導致骨密度下滑；肌肉萎縮、肌力下降和肌肉功能減退會導致骨皮質(zhì)吸收加速、變薄、對抗外力能力變?nèi)?。骨骼所承受的力學刺激轉(zhuǎn)化為生化信號調(diào)節(jié)骨密度。骨密度下降正是骨骼-肌肉系統(tǒng)調(diào)節(jié)失衡的結(jié)果。肌肉與骨骼二者位置相鄰，功能相輔，并受到神經(jīng)、內(nèi)分泌、免疫、營養(yǎng)、力學刺激的系統(tǒng)調(diào)節(jié)，以及兩者間內(nèi)分泌、旁分泌和機械力學的局部相互調(diào)節(jié)[2]。

國內(nèi)前期研究顯示，去勢骨質(zhì)疏松大鼠的骨骼肌凋亡程度明顯高于假手術(shù)組[7]。Akt參與多途徑調(diào)控細胞的凋亡[8]：激活I(lǐng)KKα降解NF-κB的抑制劑IκB、抑制BAD與Bcl-2結(jié)合、減弱Caspase-9活性、磷酸化FoxOs來抑制促凋亡基因的轉(zhuǎn)錄以及通過磷酸化鼠微粒蛋白增加P53蛋白的降解等。Akt在參與調(diào)控多途徑的細胞凋亡通路時，能活化Akt激活mTOR蛋白[9]，活化的Akt/mTOR通路能夠誘導骨骼肌細胞的肥大。Akt發(fā)揮其功能主要依靠其磷酸化程度[8]，Thr308位點的磷酸化表示Akt的部分活化，而Ser473位點的磷酸化程度表示Akt是否完全活化，以此來調(diào)控細胞的生長和增殖。

中醫(yī)認為“脾主四肢肌肉”，脾主運化，是氣血生化之源，后天之本。年老體衰，或大病，久病之后，元氣未復，失于調(diào)養(yǎng)，均可使脾氣虧虛，運化功能失常，導致氣血生化乏源，筋骨形體失養(yǎng)，形體瘦削。骨質(zhì)疏松的主要病機是腎虛、脾虛。《難經(jīng)》有云：“足少陰氣絕，則骨枯。少陰者，冬脈也，伏行而濡骨髓者也，故骨不濡，則肉不能著也；骨肉不相親，則肉軟卻；肉軟卻，故齒長而垢，發(fā)無澤；發(fā)無澤者，骨先死?！薄蹲⒔鈧摗肥觯骸捌⒑蠘s氣，榮養(yǎng)骨髓，實肌肉，濡筋絡(luò)。”脾主運化，運輸水谷精微，外充肌肉，內(nèi)滋骨髓。腎陽亦可溫煦脾陽，脾氣充足則氣血旺盛。龜鹿二仙膠出自《醫(yī)便》，功用為滋陰填精，益氣壯陽。方中鹿角、龜板二味最能補陰陽生精血，共為君藥。配伍枸杞子益肝腎，補精血，更用人參補后天，益中氣，增強氣血化生之源。縱觀全方，陰陽并補，氣血兼顧，既能滋補肝腎，又能補益脾胃。近年來有相關(guān)臨床研究證實，龜鹿二仙膠能減輕絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松患者骨痛、提高患者骨密度，并且能提高患者血液雌二醇、睪酮[10]水平。骨骼與肌肉二者雖是高度分化的組織，但同由間充質(zhì)干細胞分化而來，在治療上可能存在一些共同的靶點。雌激素[11]可以激活Akt上游因子PI3K進而活化Akt蛋白發(fā)揮生物效能，早期也是作為提高骨密度和骨骼肌力量的經(jīng)典用藥[12]。本研究提示龜鹿二仙膠能提高骨骼肌Akt蛋白、基因水平，抑制骨骼肌細胞凋亡并且促進其增殖、肥大，為龜鹿二仙膠從肌肉-骨骼系統(tǒng)上治療骨質(zhì)疏松癥提供了新的依據(jù)。