唐 露, 胡 瓊, 趙瑞陽, 李 菁, 古麗帕日·艾克拜, 張俊杰

(新疆農(nóng)業(yè)大學(xué) 動物科學(xué)學(xué)院，新疆 烏魯木齊 830052)

白斑狗魚(Esoxlucius)隸屬鮭形目(Salmoniformes)狗魚亞目(Esocoidei)狗魚科(Esocidae)狗魚屬(Esox)，為冷水性肉食魚類，自然分布于亞洲、歐洲及北美洲北部的冷水水域。在我國主要分布于新疆額爾齊斯河流域[1-2]。白斑狗魚肉味鮮美，有很高的經(jīng)濟(jì)及營養(yǎng)價值，因此具有很大的市場價值及需求量[3]。白斑狗魚個體大小存在明顯的雌雄差異，雌魚生長速度明顯快于雄魚，培育全雌性苗種可大大提高白斑狗魚的養(yǎng)殖效益[4]。

FOXL2(ForkheadboxL2)屬于叉頭狀轉(zhuǎn)錄因子超家族中的一員，最初是從眼瞼下垂綜合征(BPES)患者中克隆獲得，其基因突變可以導(dǎo)致BPES綜合癥和卵巢早衰現(xiàn)象[5-7]。FOXL2基因在脊椎動物體內(nèi)有明顯的性別二態(tài)性，在卵巢中表達(dá)量高，參與卵巢的早期發(fā)育與分化，對卵巢發(fā)育和維持卵巢功能起主導(dǎo)作用，在精巢表達(dá)量很低或幾乎不表達(dá)[8-12]。對羅非魚[13]、南方鲇[14]、稀有鮈[15]、鯰魚[16]、裂腹魚[17]、烏鱧[18]等多種魚類研究發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)OXL2基因在這些魚類中也表現(xiàn)為明顯的二態(tài)性表達(dá)模式，而且主要在卵巢中表達(dá)。有關(guān)FOXL2基因在脊椎動物中已有初步研究，但有關(guān)白斑狗魚FOXL2基因的研究尚未見報道。研究通過克隆的方法獲得白斑狗魚FOXL2基因序列，再通過熒光定量PCR方法檢測FOXL2基因在白斑狗魚不同組織和不同發(fā)育時期的表達(dá)情況，旨在為白斑狗魚性別發(fā)育機(jī)制提供基礎(chǔ)資料。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

基因克隆用魚為白斑狗魚1+齡的健康雌魚，購自烏魯木齊北園春市場，體重(590±30)g，體長(46±2) cm，已經(jīng)達(dá)到排卵階段。熒光定量PCR試驗(yàn)用白斑狗魚為自育，分別于孵出后180 d[體重(245±5)g，體長(35±5)cm]和319 d[體重(410±10)g，體長(40±2)cm]取樣，每個時期的雌雄魚各取3尾，取其肌肉、頭腎、肝、性腺、鰓、腸、腎、腦等組織放入凍存管，迅速投入液氮中，最后置于-80℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

主要試劑有Trizol試劑(invitrogen)、反轉(zhuǎn)錄試劑盒和pMD18-T載體(TaKaRa)、熒光定量檢測試劑盒(SYBR Green，天根生化科技有限公司)、大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞EX5α和Taq DNA 聚合酶(北京莊盟國際生物基因科技有限公司)。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 RNA提取及cDNA模板制備 利用Trizol試劑提取各組織RNA，用瓊脂糖凝膠電泳檢驗(yàn)RNA的完整性，用酶標(biāo)儀(TECAN, Infinite M200)檢測RNA濃度及OD值。按照反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書將各組織RNA去除基因組DNA，并反轉(zhuǎn)錄得cDNA第1條鏈模板，cDNA保存于-20 ℃冰箱用于后續(xù)試驗(yàn)。

1.2.2FOXL2基因擴(kuò)張引物設(shè)計(jì)與合成 利用NCBI基因庫已有的白斑狗魚基因序列，運(yùn)用Primer Premer 5.0設(shè)計(jì)FOXL2基因克隆引物和熒光定量引物及內(nèi)參基因引物，設(shè)計(jì)的引物送往生工生物工程(上海)股份有限公司合成，引物序列見表1。

表1 白斑狗魚FOXL2 cDNA序列克隆及表達(dá)檢測引物

Table 1FOXL2 cDNA sequence cloning and expression detection primers inE.lucius

引物 Primers序列(5′-3′) Sequence功能 FunctionFOXL2-FTACCAAAACCCCGAGGATGAC基因克隆FOXL2-RACCCCAACTAAGGACGGTGAC基因克隆FOXL2-QFCATTTTCAGGTGCTACGAGTG熒光定量PCRFOXL2-QRGTGGACCATCAGTGCCATT熒光定量PCRβ-actin-FTGAAATCGCCGCACTGGTT內(nèi)參引物β-actin-RTCCGTGCTCGATGGGGTACT內(nèi)參引物

1.2.3FOXL2基因片段擴(kuò)增 以白斑狗魚卵巢cDNA為模板，利用引物FOXL2-F與FOXL2-R對目的基因片段進(jìn)行擴(kuò)增，PCR反應(yīng)體系50.0 μL，其中包括2.5 mM dNTP Mixture 4.0 μL、10×PCR Buffer 5.0 μL、FOXL2-F 2.0 μL、FOXL2-R 2.0 μL、TaKaRa TaqTM0.5 μL、模板cDNA 3.0 μL，用ddH2O加至體積50.0 μL。擴(kuò)增程序：94℃預(yù)變性5 min，94℃ 30 s，55℃ 30 s，72℃ 1 min，進(jìn)行35個循環(huán)；最后72℃再延伸10 min。

PCR擴(kuò)增產(chǎn)物用1.2%瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行檢測，切膠回收后與pMD18-T載體拼接，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化到EX5α感受態(tài)細(xì)胞，過夜培養(yǎng)后挑取單菌落，加入到600 μL含氨芐抗生素的LB液體培養(yǎng)基中，37℃過夜培養(yǎng)。用引物FOXL2-F/R進(jìn)行菌液PCR擴(kuò)增和凝膠電泳檢測，選取連接成功的菌液送生工生物工程股份有限公司測序。

1.2.4 FOXL2氨基酸序列分析 利用VECSREEN(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/vecscreen/)在線對測序結(jié)果查找并去除載體序列，并用DNAMAN拼接，然后ORF Finder(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/gorf/gorf.html)得白斑狗魚FOXL2蛋白的ORF氨基酸序列，并BLAST得到具有不同同源性的17種物種FOXL2蛋白氨基酸序列。利用Clustal X對這些氨基酸序列進(jìn)行同源性分析。最后利用Mega 4.0程序構(gòu)建基于Neighbor-joining方法的氨基酸序列系統(tǒng)進(jìn)化樹進(jìn)行親緣關(guān)系分析。

1.2.5 白斑狗魚FOXL2基因組織表達(dá) 以cDNA為qPCR模板，β-actin為內(nèi)參基因，利用CFX96定量PCR儀進(jìn)行不同時期、性別、組織的定量分析，每個發(fā)育階段雌雄各取3個樣品，每個樣品進(jìn)行3次重復(fù)。20 μL反應(yīng)體系包括2×SuperReal PreMix Plus 10 μL，正反向引物各0.6 μL，cDNA模板1 μL，反應(yīng)程序?yàn)?5℃預(yù)變性5 min，95℃變性30 s，59℃退火30 s，39個循環(huán)，然后95℃ 1 min，60℃ 1 min，并分析60～95℃的熔解曲線，每個循環(huán)升溫0.5℃。根據(jù)擴(kuò)增得到Ct值，通過2-ΔCt法計(jì)算FOXL2基因的相對表達(dá)量，采用SPSS 16.0進(jìn)行單因素方差分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 白斑狗魚FOXL2基因克隆與序列分析

以白斑狗魚卵巢cDNA為模板克隆得1 483 bp的FOXL2基因序列，分析得這段序列的ORF為878 bp，編碼FOXL2蛋白的全部292個氨基酸(圖1)。通過氨基酸序列比對和構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹發(fā)現(xiàn)，白斑狗魚FOXL2蛋白與其他物種FOXL2蛋白氨基酸具有較高的同源性，但與其他魚類的同源性更高(圖2和圖3)。

2.2 FOXL2基因在白斑狗魚各組織中的表達(dá)

實(shí)時熒光定量PCR對白斑狗魚FOXL2基因在各組織(肌肉、頭腎、肝臟、性腺、鰓、腸道、腎臟、腦)中的表達(dá)量水平檢測結(jié)果(圖4)顯示，F(xiàn)OXL2基因在白斑狗魚性腺、鰓和腦組織中均有不同程度的表達(dá)，在其他各組織中有微量表達(dá)或不表達(dá)。不同性別的白斑狗魚性別表達(dá)量差異大，卵巢表達(dá)量最高(P<0.01)，精巢只有少量表達(dá)，卵巢表達(dá)量是精巢表達(dá)量的12倍，呈明顯的性別二態(tài)性。孵出后320 d的雌魚性腺組織(卵巢大約發(fā)育至Ⅳ期)FOXL2基因的表達(dá)量是180 d(卵巢大約發(fā)育至Ⅲ期)的1.5倍，呈上升趨勢。

注：*表示終止子。

Note:* means terminator.

圖1 白斑狗魚FOXL2蛋白ORF的氨基酸序列

Fig.1 ORF amino acid sequence of FOXL2 protein inE.lucius

注：*為氨基酸序列相同，-表示用GAP獲得最大同源性。用于比對的各個物種序列g(shù)enebank序號：人Homosapiens(AAY21823.1)，小鼠Musmusculus(AAM21968.1)，豬Susscrofa(NP_001231594.1)，牛Bostaurus(NP_001026920.1)，山羊Caprahircus(AAM52099.1)，紅原雞Gallusgallus(AEE80502.1)，家鴿Columbalivia(PKK21606.1)，白斑狗魚Esoxlucius(XP_010900597.1)，大西洋鮭Salmosalar(XP_014018845.1)，虹鱒魚Oncorhynchusmykiss(NP_001117957.1)，深裂眶據(jù)雀鯛Stegastespartitu(XP_008301498.1)，蜂巢石斑魚Epinephelusmerra(ACD62374.1)，羅非魚OreochromisNiloticus(NP_001266707.1)，青鳉Oryziaslatipes(NP_001098358.1)，銀漢魚Odontestheshatcheri(ACL80211.1)，單麗魚Cichlamonoculus(AFU74229.)，南極鱈Nototheniacorilceps(XP_010786142.1)。

Note:* means the sequence of amino acid is the same. - means the maximum homology is obtained by using GAP. Genebank number used for comparison of individual species:Homosapiens(AAY21823.1),Musmusculus(AAM21968.1),Susscrofa(NP_001231594.1),Bostaurus(NP_001026920.1),Caprahircus(AAM52099.1),Gallusgallus(AEE80502.1),Columbalivia(PKK21606.1),Esoxlucius(XP_010900597.1,Salmosalar(XP_014018845.1),Oncorhynchusmykiss(NP_001117957.1),Stegastespartitu(XP_008301498.1),Epinephelusmerra(ACD62374.1),OreochromisNiloticus(NP_001266707.1),Oryziaslatipes(NP_001098358.1),Odontestheshatcheri(ACL80211.1),Cichlamonoculus(AFU74229.),Nototheniacorilceps(XP_010786142.1).

圖2 白斑狗魚FOXL2與其他物種FOXL2氨基酸序列比對結(jié)果

Fig.2 Amino acid sequence alignments of FOXL2 inE.luciusand other species

注：Mu為肌肉，He為頭腎，Li為肝臟，Go為性腺，Gi為鰓，In為腸道，Ki為腎臟，Br為腦；**表示組間差異極顯著(P<0.01)。

Note: Mu, muscle; He, head kidney; Li, liver; Go, gonad; Gi, gill; In, intestine; Ki, kidney; Br, brain.** means significane of difference atP<0.01 level.

圖4FOXL2基因在孵出后180d(a)和320d(b)雌雄白斑狗魚8個組織中的表達(dá)量

Fig.4 Expression ofFOXL2 gene in eight tissues of male and femaleE.luciusat 180 d(a) and 320 d(b) after hatching

3 結(jié)論與討論

克隆得到白斑狗魚FOXL2序列長為1 483 bp，ORF為879 bp，總共編碼292個氨基酸，序列比對發(fā)現(xiàn)FOXL2蛋白質(zhì)氨基酸序列不僅與同目魚類(大西洋鮭)同源性高，也與分類地位較遠(yuǎn)的鱸形目魚類(如單麗魚)具有很高的同源性，說明FOXL2蛋白氨基酸序列在不同魚類中非常保守。從FOXL2系統(tǒng)進(jìn)化樹看出白斑狗魚與大西洋鮭和虹鱒等鮭形目魚類遺傳距離相近且在同一分枝，說明其親緣關(guān)系最近；而與鱸形目魚類如單麗魚等距離較遠(yuǎn)且在不同分枝，說明其親緣關(guān)系較遠(yuǎn)。與鳥綱、哺乳綱反映的進(jìn)化關(guān)系與傳統(tǒng)分類學(xué)的進(jìn)化地位相同。系統(tǒng)進(jìn)化樹反映的進(jìn)化關(guān)系與傳統(tǒng)分類學(xué)的進(jìn)化地位相一致。

在哺乳動物和鳥類中，F(xiàn)OXL2都表現(xiàn)出明顯的性別二態(tài)性，在卵巢中高表達(dá)，在精巢中微量表達(dá)[8-10]。Uda等對小鼠研究發(fā)現(xiàn)FOXL2基因的突變，可能會導(dǎo)致卵巢早衰現(xiàn)象[19]。最新近的研究表明，F(xiàn)OXL2基因可能是山羊雌性性別決定基因[20]。在多種魚類的相關(guān)研究中，也發(fā)現(xiàn)該基因主要在魚類卵巢中表達(dá)[13-15,21-22]。如FOXL2基因在羅非魚卵巢發(fā)育早期開始表達(dá)，主要起參與性腺分化和維持卵巢功能的作用[13]。FOXL2在南方鲇性腺中的表達(dá)具有明顯的性別二態(tài)性表達(dá)模式[14]。在青鳉中，F(xiàn)OXL2也主要在成體卵巢中表達(dá)，而在精巢中未能檢測到表達(dá)[21]。在黃鱔(雌性階段)性逆轉(zhuǎn)前，F(xiàn)OXL2在卵巢中表達(dá)水平較高，在黃鱔卵巢發(fā)育和維持中起著關(guān)鍵的作用[22]。

對FOXL2基因進(jìn)行實(shí)時定量PCR研究結(jié)果表明，F(xiàn)OXL2雖然在白斑狗魚性腺、鰓和腦中均有一定程度表達(dá)，但在卵巢中的表達(dá)水平顯著高于其余組織，尤其遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于精巢中的表達(dá)水平，表現(xiàn)出明顯的性別二態(tài)性，這與稀有鮈[15]、鯰魚[16]、裂腹魚[17]和烏鱧[18]等的研究結(jié)果相似。通過兩個不同發(fā)育時期FOXL2在卵巢表達(dá)量的比對發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)OXL2基因在卵巢發(fā)育初期到接近成熟期略微升高，后者是前者的1.5倍，由此推測在雌魚性別發(fā)育過程中，該基因可能與卵巢的形成和卵巢功能維持有關(guān)，這與青鳉[21]和刀鱭[23]的表達(dá)趨勢類似。