元正菊，李楠，何于雯，孟錦昕，王靜林

(云南省畜牧獸醫(yī)科學(xué)院云南省熱帶亞熱帶動(dòng)物病毒病重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，云南 昆明 650224)

西藏環(huán)狀病毒 (Tibet orbivirus, TIBOV)屬于環(huán)狀病毒屬,該病毒2009年于我國西藏自治區(qū)林芝市墨脫縣采集的蚊蟲標(biāo)本圓斑按蚊中首次分離到[1],隨后在廣東致倦庫蚊 (D181/2008)[2]和云南蠓蟲標(biāo)本中分離到西藏環(huán)狀病毒 (YN12246和DH13C120)[3，4]。在云南省多個(gè)地區(qū)采集到的牛、羊血清標(biāo)本中檢測到西藏環(huán)狀病毒的中和抗體,并在雙份血清中存在4倍以上中和抗體的升高, 在江城和德宏等邊境地區(qū)牛西藏環(huán)狀病毒中和抗體陽性率較高，表明云南省家養(yǎng)動(dòng)物(牛、羊)廣泛存在西藏環(huán)狀病毒感染，西藏環(huán)狀病毒可能是當(dāng)?shù)丶茵B(yǎng)動(dòng)物不明原因發(fā)熱甚至流產(chǎn)的潛在致病病原, 可能對(duì)當(dāng)?shù)丶茵B(yǎng)動(dòng)物的健康帶來一定危害[4]，但目前缺乏TIBOV核酸檢測方法。鑒于此，本研究根據(jù)云南省新分離的TIBOV DH13C120株Seg-7片段序列設(shè)計(jì)1套巢式引物，優(yōu)化反應(yīng)體系和條件，建立一種高效、靈敏、特異的用于檢測TIBOV的巢式RT-PCR方法，并對(duì)不同時(shí)間不同地區(qū)分離的 9株TIBOV進(jìn)行檢測，準(zhǔn)確地對(duì)TIBOV感染做出診斷，為TIBOV的臨床檢測及流行病學(xué)調(diào)查提供有效手段。

1 材料與方法

1.1 研究背景及來源

MJC1-1、DH13C120、JCC12-9、JCC12-12、JCC11-5、JCC28-2、MJ1-3、MJ1-1、JC-7等9株病毒分離自2013—2018年云南省采集的蠓蟲和蚊蟲，經(jīng)分子生物學(xué)鑒定為TIBOV；JCC12-7株病毒分離自2018年云南省采集的蠓蟲，經(jīng)分子生物學(xué)鑒定為藍(lán)舌病毒(Bluetongue virus,BTV)，JCC673株分離自2013年云南省采集的庫蠓，經(jīng)分子鑒定為鹿流行性出血熱病毒(Epizootic hemorrhagic disease virus,EHDV)，以上11株病毒鑒定后-85℃冰箱保存?zhèn)溆?。BTV4標(biāo)準(zhǔn)株由國外引進(jìn)后在本實(shí)驗(yàn)室傳代保存。

1.2 病毒稀釋和陰性對(duì)照

從-85℃冰箱取出MJC1-1、DH13C120、JCC12-9、JCC12-12、JCC11-5、JCC28-2、MJ1-3、MJ1-1、JC-7、JCC12-7、JCC673和BTV4標(biāo)準(zhǔn)株等12株病毒，用細(xì)胞培養(yǎng)液(pH 7.4 MEM培養(yǎng)基)稀釋病毒細(xì)胞培養(yǎng)液，病毒液終濃度為100 TCID50。采用細(xì)胞培養(yǎng)液為陰性對(duì)照。

1.3 引物

根據(jù)云南省新分離TIBOV DH13C120株Seg-7片段序列(KU754032)采用Primer 5.0設(shè)計(jì)引物，由生工生物工程(上海)股份有限公司合成，引物的靶基因、位置、序列和擴(kuò)增產(chǎn)物的大小見表1。

表1 西藏環(huán)狀病毒Seg-7片段巢式RT-PCR檢測引物信息

1.4 病毒RNA提取

采用RNAiso Plus試劑 (TaKaRa，中國大連)，按照試劑盒說明書操作提取病毒RNA。簡單步驟如下：分別取出稀釋好的(終濃度為100 TCID50)MJC1-1、DH13C120、JCC12-9、JCC12-12、JCC11-5、JCC28-2、MJ1-3、MJ1-1、JC-7和JCC12-7等10株病毒上清液以及陰性對(duì)照培養(yǎng)液各200μL于1.5mL離心管中，再分別加入800μL RNAiso Plus，劇烈振蕩混勻15s，靜止20min；加入200μL三氯甲烷，振蕩混勻15s，靜置15min；12000r/min，4℃離心15min，取600μL上層水相轉(zhuǎn)移至新的1.5mL離心管中，加入等體積異丙醇(-20℃預(yù)冷)，輕輕顛倒混勻，靜置20min；12000r/min，4℃離心15min，棄上清液，加入75%乙醇1mL洗滌沉淀，12000r/min離心5min，棄上清液；干燥RNA沉淀后加入100μL DEPC處理過的水溶解。立即進(jìn)行RT-PCR反應(yīng)或-80℃保存。

1.5 反轉(zhuǎn)錄

采用Reverse Transcriptase M-MLV (RNase H-)試劑盒(TaKaRa，中國大連)，按照說明書進(jìn)行cDNA的合成。RNA/引物混合液：提取的RNA 8μL，隨機(jī)六聚體引物pd(N)6 1μL，10mM dNTP Mixture 1μL，混勻，65℃ 10min，立即置于冰浴中2min；反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)液：5X Reverse Transcriptase M-MLV Buffer 4μL，RNase Inhibitor(40U/μL)1μL，Reverse Transcriptase M-MLV (RNase H-)(200U/μL) 0.5μL，RNase free H2O 4.5μL，上述模板 RNA/引物變性溶液 10μL，輕敲管壁以混勻反應(yīng)體系，短暫離心；反應(yīng)條件：30℃ 10min，42℃ 1h，70℃ 15min。將cDNA儲(chǔ)存于-20℃條件。

1.6 PCR擴(kuò)增反應(yīng)

以2.5μL cDNA為模板，在反應(yīng)體系中依次加入Premix Taq(Ex Taq Version 2.0)12.5μL、引物120S7F1(20pmol/μL)、120S7R1(20pmol/μL)各0.5μL、用雙蒸水補(bǔ)足體積至25μL，充分混勻。PCR反應(yīng)條件：首先94℃ 預(yù)變性5min； 94℃ 30s，52℃ 30s，72℃ 70s，35個(gè)循環(huán)；最后72℃延伸10min。以1μL PCR產(chǎn)物為模板，在反應(yīng)體系中依次加入Premix Taq(Ex Taq Version 2.0)12.5μL、引物120S7F2(20pmol/μL)、120S7R2(20pmol/μL)各0.5μL、用雙蒸水補(bǔ)足體積至25μL，充分混勻。巢式PCR反應(yīng)條件：首先94℃ 預(yù)變性5min； 94℃ 30s，54℃ 30s，72℃ 35s，35個(gè)循環(huán)；最后72℃延伸10min。用1%瓊脂糖凝膠電泳分析PCR產(chǎn)物。

2 結(jié)果

2.1 西藏環(huán)狀病毒方法建立

根據(jù)云南省新分離TIBOV DH13C120株Seg-7片段序列設(shè)計(jì)1套巢式引物，外引物為120S7F1/R1，退火溫度為52℃，擴(kuò)增片段大小為1050bp；內(nèi)引物為120S7F2/R2，退火溫度為54℃，擴(kuò)增片段大小為500bp。用DEPC水溶解、稀釋，終濃度為20 pmol/μL。先用外引物120S7F1/R1對(duì)TIBOV DH13C120株和藍(lán)舌病毒 JCC12-7進(jìn)行第一輪擴(kuò)增，設(shè)1個(gè)陰性對(duì)照，用第一輪PCR擴(kuò)增作為模板，采用內(nèi)引物120S7F2/R2進(jìn)行第二輪擴(kuò)增，結(jié)果TIBOV DH13C120株第一輪擴(kuò)增在1050bp處觀察到電泳條帶，第二輪擴(kuò)增在500bp處觀察到電泳條帶，而藍(lán)舌病毒JCC12-7和陰性對(duì)照兩輪均未擴(kuò)增到目的條帶，見圖1。

1-3.一次PCR擴(kuò)增產(chǎn)物(120S7F1/R1)；4-6.二次PCR擴(kuò)增產(chǎn)物(120S7F2/R2)。M.2000 bp；1.DH13C120; 2.JCC12-7; 3.陰性對(duì)照；4.DH13C120; 5.JCC12-7; 6.陰性對(duì)照。

圖1 DH13C120西藏環(huán)狀病毒Seg-7片段巢式RT-PCR擴(kuò)增結(jié)果

2.2 對(duì)9株TIBOV巢式RT-PCR檢測

分別采用外引物(120S7F1/R1)、內(nèi)引物(120S7F2/R2)對(duì)9株TIBOV(MJC1-1，MJ1-2，JCC12-9，JCC12-12，JCC11-5，JCC28-2，MJ1-3，MJ1-1，JC-7)、2株藍(lán)舌病毒(JCC12-7和BTV4標(biāo)準(zhǔn)株)和1株鹿流行性出血熱病毒(JCC673)進(jìn)行擴(kuò)增，檢測結(jié)果見圖2。9株TIBOV第一輪擴(kuò)增和第二輪擴(kuò)增分別在1050bp和500bp處觀察到目的條帶，提示TIBOV擴(kuò)增均為陽性(表2)，而藍(lán)舌病毒JCC12-7株、BTV4標(biāo)準(zhǔn)株和鹿流行性出血熱病毒JCC673株兩輪均未觀察到目的條帶，提示擴(kuò)增陰性，見圖2。以上結(jié)果再次表明了該方法能夠用于目前流行TIBOV核酸檢測。

表2 9株TIBOV巢式RT-PCR檢測

注：“+”為PCR擴(kuò)增陽性；“-”為PCR擴(kuò)增陰性；BTV：藍(lán)舌病毒；EHDV：鹿流行性出血熱病毒。

a：一次PCR擴(kuò)增產(chǎn)物(120S7F1/R1)。M.2000bp DNA Marker；1.MJC1-1；2.MJ1-2；3.JCC12-9；4.JCC12-7；5.JCC12-12； 6.JCC11-5；7.JCC28-2； 8.MJ1-3；9.MJ1-1；10.JC-7；11.BTV；12.EHDV；13.H2O。 b：二次PCR擴(kuò)增產(chǎn)物(120S7F2/R2)。M.2000bp DNA Marker；1.MJC1-1；2.MJ1-2；3.JCC12-9；4.JCC12-7；5.JCC12-12； 6.JCC11-5；7.JCC28-2； 8.MJ1-3；9.MJ1-1；10.JC-7; 11.BTV；12.EHDV；13.H2O。

圖2 TIBOV Seg-7設(shè)計(jì)引物擴(kuò)增結(jié)果

3 討論

環(huán)狀病毒具有廣泛宿主動(dòng)物, 包括家養(yǎng)及野生反芻動(dòng)物、有袋目哺乳動(dòng)物、馬、蝙蝠、樹獺、鳥類和人類[5]，以蠓、蚊、白蛉、蜱等為傳播媒介。環(huán)狀病毒屬中包含多種重要的可導(dǎo)致動(dòng)物疾病的病毒, 如通過庫蠓等傳播的BTV, 可引起羊等反芻動(dòng)物出血性疾病[6];通過庫蠓等傳播的非洲馬瘟病毒可以造成馬匹嚴(yán)重的心血管疾病及肺部疾病, 該病毒在地中海地區(qū) (特別是北非和南歐) 曾多次流行, 給馬匹的生長和飼養(yǎng)帶來巨大危害[7];通過庫蠓等傳播的EHDV造成北美的白尾鹿等家養(yǎng)和野生有蹄類動(dòng)物出現(xiàn)血管損傷等類似藍(lán)舌病的癥狀[8]。此外, Palyam病毒、秘魯馬病病毒等也是重要的致動(dòng)物流行性疾病的病毒[4]。近年來，在我國西藏、云南、廣東等地分離到多株TIBOV，經(jīng)序列分析發(fā)現(xiàn)TIBOV病毒是蠓傳病毒，與對(duì)家養(yǎng)動(dòng)物致病性較高的BTV關(guān)系密切，而且在當(dāng)?shù)嘏Ｑ蛑写嬖谳^高的TIBOV感染率，且病毒感染滴度較高，提示TIBOV可能是對(duì)家養(yǎng)的牛羊致病或潛在致病的病原，需要建立一種準(zhǔn)確、快速檢測西藏環(huán)狀病毒的方法，加強(qiáng)開展家養(yǎng)動(dòng)物的TIBOV監(jiān)測與檢測。本研究根據(jù)云南省新分離TIBOV DH13C120株第七節(jié)段保守區(qū)設(shè)計(jì)一套巢式引物建立了巢式RT-PCR檢測方法，TIBOV DH13C120株第一輪和第二輪均擴(kuò)增出與預(yù)期設(shè)計(jì)相一致的目的條帶，而BTV JCC12-7株和陰性對(duì)照兩輪均未擴(kuò)增到目的條帶，提示該引物可以用于TIBOV的核酸檢測。為了進(jìn)一步檢驗(yàn)該引物是否能用于更多TIBOV檢測，采用該方法對(duì)云南省新分離的9株TIBOV、2株BTV和1株EHDV進(jìn)行檢測，9株TIBOV擴(kuò)增均為陽性，而BTV、EHDV和陰性對(duì)照均為陰性，提示根據(jù)TIBOV DH13C120株第七節(jié)段保守區(qū)設(shè)計(jì)引物建立的巢式RT-PCR方法能用于云南省目前動(dòng)物或媒介中流行的TIBOV核酸檢測。

巢式RT-PCR克服了單次擴(kuò)增平臺(tái)期效應(yīng)的限制，使擴(kuò)增倍數(shù)提高，從而極大地提高了PCR的敏感性；而內(nèi)側(cè)引物擴(kuò)增模板是外側(cè)引物擴(kuò)增的產(chǎn)物，第二階段的反應(yīng)，也是對(duì)第一階段反應(yīng)正確性的鑒定，可以保證整個(gè)反應(yīng)的準(zhǔn)確性。因此，本研究設(shè)計(jì)了一套外引物和內(nèi)引物進(jìn)行巢式RT-PCR擴(kuò)增，提高檢測方法的靈敏度和準(zhǔn)確性；此外，本研究在建立方法時(shí)還采用同屬而且遺傳進(jìn)化關(guān)系較為密切的藍(lán)舌病毒JCC12-7株、BTV4標(biāo)準(zhǔn)株和鹿流行性出血熱病毒JCC673株作為病毒對(duì)照，同時(shí)設(shè)有陰性對(duì)照，保證了反應(yīng)的特異性。在本研究中這些樣品兩輪擴(kuò)增均為陰性，結(jié)果表明該方法具有較好的特異性，可用于家養(yǎng)動(dòng)物西藏環(huán)狀病毒感染的診斷，為西藏環(huán)狀病毒的臨床檢測及流行病學(xué)調(diào)查提供有效手段，對(duì)蟲媒病的防治具有重要意義。