嚴(yán)紅亞，李廷翠，，李珂，趙蓉，字吉祥，常志順，信愛國*

(1．云南省畜牧獸醫(yī)科學(xué)院養(yǎng)禽與禽病研究所，云南 昆明 650224；2.云南農(nóng)業(yè)大學(xué)動物醫(yī)學(xué)院，云南 昆明 650201)

副禽嗜血桿菌(Avibacterium paragallinarum，Apg)，即副雞嗜血桿菌( Haemophilus paragallinarum，Hpg)，又稱為雞傳染性鼻炎(Infectiuns coryza，IC)，為革蘭氏陰性桿菌，該菌對生長環(huán)境要求較高，大部分菌株都有NAD(輔酶I)依賴性[1]。雞感染副禽嗜血桿菌后，臨床大多會出現(xiàn)眼睛腫脹，鼻腔和鼻竇有漿液性或黏液性分泌物，面部水腫和結(jié)膜炎，肉垂出現(xiàn)明顯腫脹等特征。近年來，我國集約化養(yǎng)雞業(yè)蓬勃發(fā)展，此病的發(fā)病率呈上升趨勢。該病主要集中流行于繁殖雞和蛋雞，其他禽類也有感染該病的報道[2]。該病的發(fā)生一般是受飼養(yǎng)環(huán)境條件、營養(yǎng)水平、氣候變化等因素影響，不同日齡雞群混養(yǎng)常常導(dǎo)致該病的爆發(fā)。本文對2019 年春季送檢的臨床疑似副禽嗜血桿菌感染的家禽病例進(jìn)行臨床診斷和病理剖檢，采集病樣進(jìn)行細(xì)菌分離鑒定，確診為副禽嗜血桿菌感染。

1 材料與方法

1.1 樣品來源

2019年3月采集自云南省某規(guī)?；B(yǎng)殖場發(fā)病雞群，主要表現(xiàn)為流鼻涕、面部腫脹、鼻腔與竇腔黏膜發(fā)炎，產(chǎn)蛋率下降，臨床診斷疑似副禽嗜血桿菌感染。

1.2 主要試劑

普通營養(yǎng)瓊脂、血瓊脂、1%煙酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD)血瓊脂培養(yǎng)基按常規(guī)方法制備，SS瓊脂、麥康凱瓊脂購自北京奧博興生物科技有限公司。革蘭氏染液、細(xì)菌微量生化反應(yīng)管、抗生素藥敏紙片購自杭州天河微生物試劑有限公司。細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒、2×Taq PCR Master Mix、DNA marker DL2000等購自天根生化科技(北京)有限公司。

1.3 細(xì)菌分離鑒定

無菌棉簽深入病死雞鼻竇腔深部無菌采集病料，畫線接種在血瓊脂、1% NAD血瓊脂培養(yǎng)基上，37℃ 5%二氧化碳恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h；接種環(huán)無菌采集肝、肺等器官分別畫線接種在血瓊脂培養(yǎng)基上，37℃恒溫培養(yǎng)24h，觀察細(xì)菌的生長狀況。挑取單個菌落革蘭氏染色、鏡檢，觀察形態(tài)。對分離菌株進(jìn)行單菌落劃線培養(yǎng)純化后，對分離菌株進(jìn)行生理生化鑒定[3]。

1.4 細(xì)菌血凝活性測定

用滅菌 PBS(pH 7.2 0.01 mol/L)清洗F3代純化培養(yǎng)細(xì)菌菌落，離心收集菌落，洗滌3次，通過比濁法將細(xì)菌濃度調(diào)節(jié)至1×1010CFU/mL，反復(fù)凍融3次后作為待測抗原[4]。通過常規(guī)方法檢查其雞紅細(xì)胞的凝集活性。

1.5 細(xì)菌基因組DNA提取和PCR擴(kuò)增

細(xì)菌基因組DNA提取按照DNA提取試劑盒說明書進(jìn)行。根據(jù)細(xì)菌16S rDNA 鑒定菌株的標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程，將細(xì)菌16S rDNA分成3段首尾重疊片段進(jìn)行擴(kuò)增，片段1(引物對16S-27F /16S-519R)預(yù)計擴(kuò)增片段500bp，片段2(引物對16S-357F /16S-1115R)預(yù)計擴(kuò)增片段750bp，片段3(引物對16S-926F /16S-1492R)預(yù)計擴(kuò)增片段560bp，引物序列信息如表1所示[5]。擴(kuò)增產(chǎn)物送昆明碩擎生物有限公司測序，測序結(jié)果采用Vecter NTI 軟件進(jìn)行拼接，得到大約1500bp的16S rDNA序列。將序列提交GenBank進(jìn)行Blast比對，確定細(xì)菌的種屬分類。

表1 PCR 擴(kuò)增引物序列信息表

2 結(jié)果

2.1 發(fā)病雞臨床癥狀

發(fā)病雞精神萎靡，產(chǎn)蛋率降低，食欲減退，眼睛腫脹，膿液流動，鼻腔和鼻竇有漿液性分泌物，堵塞鼻孔而出現(xiàn)呼吸困難和甩頭等現(xiàn)象，呼吸啰音，面部腫脹，眼結(jié)膜發(fā)紅，眼瞼水腫，鼻竇腫脹隆起，流鼻涕、打噴嚏(圖1、2)。

圖1 眼瞼水腫 圖2 面部腫脹

2.2 分離菌形態(tài)特征、生化試驗(yàn)、血凝活性試驗(yàn)結(jié)果

通過細(xì)菌分離及單菌落純化，該細(xì)菌在NAD血瓊脂平板上形成半透明、邊緣整齊、中等大小的露珠狀菌落(圖3)。菌株在普通營養(yǎng)瓊脂、SS瓊脂、麥康凱瓊脂、血瓊脂等培養(yǎng)基上未觀察到菌落生長，因此，可判定該菌落為NAD依賴性細(xì)菌。革蘭氏染色為紅色短桿菌，兩極染色嚴(yán)重，沒有芽孢，表明該分離株是革蘭氏陰性細(xì)菌(圖4)。菌株具有紅細(xì)胞凝集活性，血凝效價為4log2；分離菌葡萄糖、麥芽糖、甘露醇陽性；蔗糖、尿素陰性；分離菌符合副禽嗜血桿菌的生化培養(yǎng)特征，初步判斷為副禽嗜血桿菌。

圖3 分離菌在NAD血瓊脂平板上的形態(tài)

圖4 分離菌革蘭氏染色結(jié)果

2.3 分離菌株P(guān)CR檢測及16S rDNA擴(kuò)增結(jié)果

使用16S rDNA通用引物擴(kuò)增分離純化得到細(xì)菌，并通過2%瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR擴(kuò)增產(chǎn)物。擴(kuò)增的DNA片段分別為500bp、750bp和560bp，擴(kuò)增片段與預(yù)期的片段長度一致。陰性對照沒有條帶，表明擴(kuò)增結(jié)果是目標(biāo)結(jié)果，如圖5示。PCR產(chǎn)物凝膠純化后，采用產(chǎn)物對應(yīng)的擴(kuò)增引物進(jìn)行雙向測序。

M.分子量標(biāo)準(zhǔn)DL2000；1-3.分離菌16S rDNA片段1、2、3擴(kuò)增產(chǎn)物。圖5 分離菌16S rDNA 3個片段的PCR擴(kuò)增結(jié)果

2.4 分離菌16S rDNA序列比對鑒定與分類結(jié)果

上述3個核酸片段序列通過Vector NTI 軟件拼接，獲得1495bp 16S rDNA核酸序列(圖略)。將分離菌核酸序列提交GenBank數(shù)據(jù)庫進(jìn)行Blast 比對分析，結(jié)果顯示分離菌株屬于副禽嗜血桿菌(圖6)。

圖6 分離菌株16S rDNA基因片段Blast比對進(jìn)行分類鑒定結(jié)果

2.5 藥物敏感性試驗(yàn)結(jié)果

通過藥敏試紙法測定分離菌對17種藥物的敏感性，試驗(yàn)結(jié)果顯示，分離株對妥布霉素、阿奇霉素、慶大霉素、阿米卡星敏感，對恩諾沙星、新霉素、環(huán)丙沙星、左氟沙星等4種藥物中度敏感，對頭孢氨芐、阿莫西林、四環(huán)素、青霉素G、頭孢他啶、氯霉素、卡那霉素、復(fù)方新諾明、氨芐西林具有耐藥性(表2)。

3 討論

副雞嗜血桿菌是引起雞傳染性鼻炎的病原體，可導(dǎo)致肉雞生長緩慢、蛋雞產(chǎn)蛋率下降，對養(yǎng)殖場造成重大的經(jīng)濟(jì)損失。據(jù)調(diào)查，2019年云南省蛋雞和土雜雞養(yǎng)殖中，雞傳染性鼻炎呈高發(fā)態(tài)勢，占細(xì)菌性疫病臨床病例首位，檢出率為15.87%[6]。該病全年均有發(fā)生，尤以秋冬季節(jié)發(fā)病率較高，受環(huán)境等因素的影響，該病極易反復(fù)，一旦與其他疾病如大腸桿菌或支原體混感后可增加該病的嚴(yán)重程度，且持續(xù)時間會比較長，治愈效果較差。另外，蛋雞產(chǎn)蛋期易發(fā)生本病，藥物治療造成的藥殘及食品安全問題不容忽視。

表2 藥敏試驗(yàn)結(jié)果

注：S敏感；R耐藥；I中度敏感。

本研究從云南蛋雞中分離出一株依賴于NAD血瓊脂生長的灰白色、圓形、邊緣整齊的光滑型小菌落，而在普通瓊脂、血瓊脂、SS瓊脂平板上未見生長，革蘭氏染色為紅色短桿菌，過氧化氫酶試驗(yàn)結(jié)果為陰性，具有紅細(xì)胞凝集活性等，符合副雞嗜血桿菌生物學(xué)特性；16S rDNA序列測定、GenBank數(shù)據(jù)庫比對分析證明該分離菌為副雞嗜血桿菌。

2019年云南省發(fā)病雞分離鑒定的31株雞副嗜血桿菌代表菌株藥敏試驗(yàn)結(jié)果顯示副雞嗜血桿菌云南分離株大多為敏感型菌株[6]。本實(shí)驗(yàn)中分離菌株對頭孢氨芐、阿莫西林、四環(huán)素、青霉素G、頭孢他啶、氯霉素、卡那霉素、復(fù)方新諾明、氨芐西林等藥物具有耐藥性，說明該菌株存在一定的耐藥性。確診后立即使用敏感的藥物對雞群進(jìn)行緊急治療，但由于飼養(yǎng)環(huán)境、飼養(yǎng)密度等原因未能及時控制病情，仍有少量雞群死亡。目前針對副雞嗜血桿菌已有有效的商業(yè)疫苗，除了使用敏感藥物外，針對雞群制定有效合理的免疫程序是預(yù)防該病發(fā)生的有效方法。但是，對于多價疫苗或全價疫苗的研究和開發(fā)還任重道遠(yuǎn)。

副雞嗜血桿菌發(fā)病率可達(dá) 20%～50%，死亡率可達(dá) 5%～20%，一旦發(fā)病，產(chǎn)蛋率下降10%～70%不等[7]。對于該病的防治應(yīng)注意飼養(yǎng)環(huán)境，防寒、防濕，使雞群有一個適度干燥、通風(fēng)良好、溫度適中的生活環(huán)境。尤其在氣候多變季節(jié)，更應(yīng)注意雞舍環(huán)境，防止雞舍的溫度驟降，尤其是育雛欄轉(zhuǎn)到育成欄時，要控制兩雞舍間的溫差。同時，調(diào)整雞群飼養(yǎng)密度，使雞群有足夠的活動空間；注意飼料的全價營養(yǎng)，可在飼料或飲水中添加維生素，增強(qiáng)機(jī)體抵抗力。此外，還應(yīng)做好雞舍的環(huán)境消毒，一旦發(fā)生該病應(yīng)立即對養(yǎng)殖場進(jìn)行封鎖、隔離，防止疫情進(jìn)一步擴(kuò)散，以便更好的控制疫情。