廖秀飛，姜 和，蘇春麗，廖洪利，萬陽裕

(1.成都醫(yī)學院，四川 成都 610500；2.四川科倫藥業(yè)股份有限公司，四川 成都 610071)

多肽作為生物體內調節(jié)各種細胞功能的活性物質，因其相對于小分子化學藥物有一定優(yōu)勢，已經(jīng)成為新藥研究的一個重要方向。但由于穩(wěn)定性差等原因，大大限制了其應用，而通過對多肽進行結構修飾，可以改善其理化性質，進而提高穩(wěn)定性，使其擁有更高的生物活性。修飾后的多肽具有更好的脂水分配系數(shù)，易于透膜吸收。研究[1-4]表明，修飾后的多肽可以明顯減小藥物的毒副作用，延長半衰期，提高藥物療效。

常見的多肽修飾有：磷酸化[5]，是一種翻譯后修飾方式，常見的磷酸化目標是絲氨酸、蘇氨酸和酪氨酸；糖基化[6]，參與生物發(fā)育、代謝等重要生命過程，比如蛋白質N-糖基化修飾；環(huán)化[7]，多肽的環(huán)化分為頭尾相連式、側鏈與終端連接、側鏈與側鏈連接，其側鏈一般通過二硫橋進行連接，是多肽提高穩(wěn)定性的常用方法。作者重點介紹了化學合成中多肽N端的修飾方法，為相關研究提供參考。

1 常用多肽N端修飾方法

1.1 乙?；?/h3>

乙?；嵌嚯暮铣芍凶畛Ｓ玫腘端修飾方法，一般采用醋酐對N端進行酰化保護，避免多肽N端氨基不穩(wěn)定而被氧化。

Yun等[8]研究血管內皮生長因子(VEGF)受體2拮抗劑四肽Arg-Leu-Tyr-Glu(RLYE)被不耐熱血清因子降解(圖1)時發(fā)現(xiàn)，由于氨基肽酶B和N的降解，使得RLYE在血清中的半衰期較短(1.2 h)。為了提高RLYE的穩(wěn)定性和效力，設計了N端乙?；疪LYE(Ac-RLYE)，與原始母體肽RLYE相比，Ac-RLYE在血清中具有8.8 h的穩(wěn)定半衰期，Ac-RLYE對血管內皮生長因子A(VEGF-A)誘導的內皮細胞遷移的IC50值從母體肽的89.1 pmol·L-1降至約37.1 pmol·L-1；并且使用小鼠異種移植腫瘤模型，證明了Ac-RLYE比RLYE在抑制腫瘤血管生成和生長、增強內皮細胞連接和腫瘤血管的周細胞覆蓋、改善血管完整性和正常化以及阻止巨噬細胞浸潤等方面更有效。

(a)RLYE的化學結構 (b)RLYE與磷酸鹽緩沖液(PBS)或健康人血清(serum)在37 ℃孵育不同時間后的濃度曲線。反應混合物通過反相高效液相色譜法分級，肽濃度通過220 nm處吸光度作為保留值的函數(shù)積分來分析(n=3)。內插圖是RLYE在健康人血清中孵育不同時間的典型HPLC圖譜 (c)健康人血清在不同溫度下預熱10 min，然后與RLYE在37 ℃孵育2 h的HPLC圖譜

圖1 RLYE被不耐熱血清因子降解曲線
Fig.1 Degradation curve of RLYE by heat-labile serum factor

1.2 PEG(聚乙二醇)修飾

PEG是一種中性、無毒、具有獨特理化性質和良好生物相容性的化學物質，被FDA批準可作為體內注射用藥。在多肽合成中常使用PEG對N端進行修飾[9]，經(jīng)PEG修飾過的蛋白質藥物[10-11]具有更強的生物活性。PEG修飾的脂質體[12]對腫瘤有更強的被動靶向作用、更長的半衰期、較低的最大血藥濃度，由于其血藥濃度波動較小，毒性減弱，溶解性提高，從而提高病人的依從性，提高生活質量，降低治療費用。

Wu等[13]研究用于治療身材矮小、腎衰竭和特納氏綜合癥兒童的人類生長激素(hGH)時發(fā)現(xiàn)，hGH的臨床應用受到其血漿半衰期短和生物利用度低的困擾，PEG修飾和與人血清白蛋白(HSA)結合是延長hGH血漿半衰期的兩種最有效方法，PEG和HSA的空間屏蔽作用會大大降低hGH的生物活性，這與藥代動力學相反。以PEG(3.5 kDa或10 kDa)為連接基，通過PEG-十六烷(HD)對hGH進行N端修飾，合理設計制備了具有明顯改善藥理作用的長效hGH-PEG-HD(圖2)。PEG修飾和與十六烷結合的HSA可以增加流體動力學體積并降低hGH的免疫原性，從而顯著增加hGH的pK值。

1.3 熒光試劑修飾

熒光試劑是在紫外-可見-近紅外區(qū)有特征熒光，并且其熒光性質(激發(fā)和發(fā)射波長、強度、壽命、偏振等)可隨環(huán)境(極性、折射率、黏度等)的改變而靈敏改變的一類熒光性分子，一般用于熒光免疫法中抗原或抗體的標記，還可用作熒光探針[14]。在多肽合成中使用熒光試劑對N端進行修飾，比如異硫氰酸熒光素(FITC)，使其具有熒光特性，可用于生物體內活性物質或者藥物分布的標記。

內皮細胞表達的血管細胞粘附分子-1(VCAM-1)是動脈粥樣硬化斑塊的重要標志。Xu等[15]研究了一種新型的磁性介孔硅納米粒子，該納米粒子能夠將藥物遞送并靶向動脈粥樣硬化斑塊，以此來診斷和預防動脈粥樣硬化。使用摻入到Fe3O4@SiO2中的FITC和VHPKQHR肽構建納米顆粒FITC-VHP-Fe3O4@SiO2，該納米顆粒在體外和體內均表現(xiàn)出良好的形態(tài)特征、優(yōu)異的靶向能力、低毒性和良好的生物相容性。體內實驗表明，F(xiàn)ITC-VHP-Fe3O4@SiO2是磁共振成像(MRI)的優(yōu)異造影劑，可用于診斷動脈粥樣硬化斑塊。

圖2 hGH-PEG3.5-HD和hGH-PEG10-HD的合成示意圖Fig.2 Synthetic diagram of hGH-PEG3.5-HD and hGH-PEG10-HD

1.4 多肽N端親水性基團修飾

多肽的水溶性大小在純化時非常重要。在多肽純化過程中，粗品的溶解需要低比例的有機相以獲得更適宜的水相與有機相濃度梯度范圍。對于疏水性較強的多肽，水溶性較差就會影響純化效果。Chandrashekar等[16]采用連接咪唑的吡喃葡萄糖氧羰基和吡喃半乳糖氧羰基在一定條件下與目標肽VVEKFLKRAE反應，不僅修飾多肽N端，還與多肽側鏈氨基進行反應(圖3)。由于碳水化合物具有多個親水基團，可提高目標肽的水溶性，因此利用碳水化合物作為保護基團時，后續(xù)反應還可以在含水條件下進行。

圖3 多肽N端親水性基團修飾示意圖Fig.3 Schematic diagram of N-terminal hydrophilic group modification of polypeptides

1.5 NCL、EPL連接反應

NCL連接反應又叫作自然化學連接反應[17]，是用C末端具有硫酯的肽和N末端為半胱氨酸的肽，在中性常溫條件進行反應。該方法利用多肽本身的官能團，延長肽鏈合成的長度，提高產(chǎn)率，反應機理是硫-氮?；D移。基于NCL連接反應，F(xiàn)lavell等[18]開發(fā)了EPL連接反應(圖4)，它是一種半合成技術，其中由內含肽融合蛋白硫解產(chǎn)生的重組蛋白硫酯與具有N末端半胱氨酸的合成或重組肽反應形成天然肽鍵。EPL與NCL的主要區(qū)別在于重組表達的蛋白質比多肽分子量更大，結構更復雜，硫酯與多肽的融合是通過重組蛋白剪接過程實現(xiàn)的，被廣泛用于生物物理探針的結合以及非天然氨基酸和蛋白質翻譯后修飾。

2 其它多肽N端修飾實例

2.1 2-氨基辛酸修飾抗菌肽AMP

脂肪酸的N端修飾有一定的限制，需要使用其它物質對多肽進行連接，過程較為復雜。Almahboub等[19]研究了一種脂肪酸——2-氨基辛酸(2-AOA)，使用來源于紫黃桿菌的轉氨酶，其轉化效率為52%～80%；2-氨基辛酸分別與乳鐵蛋白肽B衍生的抗菌肽的C端和N端結合，可將抗菌肽AMP(序列：RRWQWRMKK)的抗菌活性提高16倍以上；C末端修飾肽的最小抑制濃度總是低于N末端結合肽的，對大腸桿菌、枯草芽孢桿菌、鼠傷寒沙門氏菌、銅綠假單胞菌和金黃色葡萄球菌等有較好的抑制作用，其中對金黃色葡萄球菌的抑制作用最強，為2-氨基辛酸用于多肽N端修飾和提高抗菌肽的活性提供了研究基礎。

圖4 EPL連接反應示意圖Fig.4 Schematic diagram of EPL ligation reaction

2.2 丁烯酶1介導多肽N端修飾

Hemu等[20]發(fā)現(xiàn)天冬酰胺內蛋白酶(AEP)家族的半胱氨酸蛋白酶——丁烯酶1可以催化天冬酰胺與半胱氨酸形成硫酯中間體，通過N端胺的親核進攻發(fā)生硫-氮?；D移，從而形成新的肽鍵(圖5)。丁烯酶1是修飾肽和蛋白質的有效通用工具，可使用丁烯酶1進行位點特異性肽和蛋白質連接、N末端標記、硫酯的制備和樹枝狀大分子的生物偶聯(lián)。

特征識別信號NHV占據(jù)了S1-S1′-S2′空穴結構;R、R1和R2分別代表P2、P1″和P2″位殘基的氨基酸側鏈

2.3 N-脒基-焦谷氨酰苯丙氨酸的合成

Burov等[21]用Wang聚合物的α-胍基葡萄糖酸環(huán)化，再用三氟乙酸進行切割，可以得到N-脒基-焦谷氨酰苯丙氨酸(圖6)，為N-脒基-焦谷氨酸殘基用于合成短肽打下基礎。

2.4 N-terminal caps

圖6 N-脒基-焦谷氨酰苯丙氨酸的合成Fig.6 Synthesis of N-amidino-pyroglutamyl-phenylalanine

Juhl等[22]研究發(fā)現(xiàn)了一些N-terminal caps結構(圖7)。Apelin-APJ信號通路與高血壓、心血管疾病、免疫以及神經(jīng)系統(tǒng)有關，但是Apelin peptide代謝穩(wěn)定性低、半衰期短，經(jīng)N-terminal caps修飾后可以提高Apelin peptide的穩(wěn)定性，促進藥物開發(fā)和體內研究。

圖7 用作五元環(huán)和六元環(huán)的N-terminal capsFig.7 N-terminal caps used in five or six membered rings

3 展望

多肽固相合成法的成功開發(fā)與應用為多肽的化學合成帶來了革命性的突破，大大提高了多肽的合成效率。目前，針對多肽結構修飾的方法逐漸豐富，人們可根據(jù)不同目的選擇適宜的修飾方法，其中小分子保護基團的研究已經(jīng)較為成熟，F(xiàn)moc用于氨基酸的保護也普遍適用，但是對于親水性保護基團的研究仍顯不足，可以考慮從其它碳水化合物入手，如將六元環(huán)的吡喃糖換成五元環(huán)的呋喃糖，或者選用其它雜環(huán)替換咪唑基團。此外，多肽的儲存條件較為嚴苛，須低溫冷鏈運輸保存。開發(fā)提高多肽穩(wěn)定性的修飾方法是一個值得研究的領域。