蔡小蕾，郭 鵬，賴國(guó)松

(湖北師范大學(xué)化學(xué)化工學(xué)院，湖北 黃石 435002)

凝血酶(Tb)在人體凝血級(jí)聯(lián)反應(yīng)及許多生理調(diào)節(jié)過(guò)程中都起著十分重要的作用，其濃度異常變化通常可有效反映疾病的發(fā)生或發(fā)展?fàn)顩r[1]。因此，發(fā)展各種可方便準(zhǔn)確檢測(cè)血清等復(fù)雜基質(zhì)中Tb的分析方法對(duì)于臨床疾病診斷具有十分重要的意義。與其它方法相比，基于免疫等高特異性生物識(shí)別反應(yīng)發(fā)展起來(lái)的生物傳感器具有成本低、樣品消耗量少、靈敏度高、無(wú)需大型儀器等獨(dú)特優(yōu)點(diǎn)，因而近年來(lái)被人們廣泛研究和關(guān)注[2]。盡管目前國(guó)內(nèi)外研究人員已圍繞Tb生物傳感開(kāi)展了不少成功工作，但是這些傳感方法大多是基于傳統(tǒng)的異相分析模式而構(gòu)建的[3-5]，因而通常涉及到固相基底繁瑣的界面修飾及多步反應(yīng)、洗滌和分離步驟，不僅操作復(fù)雜、分析時(shí)間長(zhǎng)，而且還有可能在一定程度上影響方法的重復(fù)性。

與抗體相比，基于SELEX技術(shù)篩選出來(lái)的核酸適配體由于具有成本更低、穩(wěn)定性更好、靶向識(shí)別范圍更廣等優(yōu)異性能[6]，近年來(lái)被人們廣泛用作一類“人工抗體”來(lái)發(fā)展各種性能優(yōu)良的生物傳感方法。更重要的是，作為一段具有特定堿基序列的寡核苷酸片段，核酸適配體還非常有利于與其高特異性靶向物識(shí)別反應(yīng)引起的相關(guān)核酸結(jié)構(gòu)變化相結(jié)合來(lái)發(fā)展各種均相生物傳感方法[7]，從而有效避免傳統(tǒng)異相分析操作繁瑣、智能化程度不高等缺陷。同時(shí)，上述核酸結(jié)構(gòu)變化還為在此基礎(chǔ)上結(jié)合催化發(fā)夾組裝、鏈置換反應(yīng)、雜交鏈反應(yīng)等各種核酸信號(hào)放大技術(shù)，來(lái)有效提高生物傳感方法的分析靈敏度提供了可能[8-9]。

為此，作者在核酸設(shè)計(jì)的基礎(chǔ)上，有機(jī)結(jié)合靶向物的高特異性核酸適配體識(shí)別作用及鏈置換反應(yīng)來(lái)進(jìn)一步觸發(fā)雜交鏈反應(yīng)，成功實(shí)現(xiàn)均相溶液中具有優(yōu)良類過(guò)氧化酶性質(zhì)的G-四鏈體DNA酶[10]活性結(jié)構(gòu)的雙向自組裝，進(jìn)而利用該DNA酶的靈敏催化顯色反應(yīng)發(fā)展一種可方便用于Tb均相檢測(cè)的比色生物傳感新方法。

1 實(shí)驗(yàn)

1.1 試劑與儀器

Tb、人血清白蛋白(HSA)、牛血清白蛋白(BSA)、2,2′-連氮基-雙-(3-乙基苯并二氫噻唑啉-6-磺酸)(ABTS)，Sigma-Aldrich公司；血紅素(hemin)，阿拉丁化學(xué)試劑公司；人IgG(HIgG)，武漢博士德生物技術(shù)公司。

H1、H2、H3、H4等DNA均由生工生物工程(上海)有限公司根據(jù)作者設(shè)計(jì)及定制要求合成，其堿基序列如下：

H1:5′-AGTCCGTGGTAGGGCAGGTTGGGGT GACTACTTTATCTACCACGGACTTTATCTGTG GGTGGT-3′

H2:5′-CCGTGGTAGATAAAGTAGTCACCCC AACCTGCCCTACCACGGACTACTTTATCTGTG GGTGGT-3′

H3:5′-AGGGCGGGTGGGTGGTGGTTGGGTATTT CACCACCCACAGATAAAGTTGGGT-3′

H4:5′-TGGGTGAAATACCCAACCACCACTT TATCTGTGGGTGGTTGGGTAGGGCGGG-3′

工作溶液為25 mmol·L-1pH值7.4的HEPES緩沖溶液；DNA稀釋液為含200 mmol·L-1NaCl、2 mmol·L-1MgCl2、20 mmol·L-1KCl的20 mmol·L-1pH值7.4的Tris-HCl緩沖溶液；hemin稀釋液為含0.2 mmol·L-1KCl和2 mmol·L-1NaCl的DMSO溶液。

UV-1901型紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)，北京普析通用儀器有限責(zé)任公司；JN100-4型恒溫混勻儀，蘇州吉米諾儀器公司；DYY-600C型電泳儀，東方瑞利科技有限公司。

1.2 均相反應(yīng)及檢測(cè)方法

首先，將濃度為10 μmol·L-1的DNA H1、H2、H3、H4分別于95 ℃水浴加熱10 min，之后緩慢降溫以形成穩(wěn)定的發(fā)夾結(jié)構(gòu)。然后，在離心管中分別加入10 μL的 0.5 μmol·L-1H1、0.5 μmol·L-1H2、2.5 μmol·L-1H3、2.5 μmol·L-1H4以及10 μL不同濃度的目標(biāo)物Tb溶液，37 ℃振蕩反應(yīng)3 h。接下來(lái)，繼續(xù)向各離心管中加入120 μL工作溶液和10 μL 10 μmol·L-1的hemin溶液，置于恒溫混勻儀上25 ℃反應(yīng)1 h。最后，向所得的反應(yīng)混合液中加入20 μL 5 mmol·L-1的H2O2溶液和10 μL 40 mmol·L-1ABTS溶液，振蕩反應(yīng)4 min后利用紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)在390～480 nm波長(zhǎng)范圍內(nèi)記錄吸收光譜，根據(jù)其吸光度大小構(gòu)建Tb定量分析關(guān)系。

2 結(jié)果與討論

2.1 均相分析體系設(shè)計(jì)與傳感機(jī)制研究

設(shè)計(jì)了4個(gè)發(fā)夾DNA H1、H2、H3、H4。其中，H1包含了Tb核酸適配體序列及可與H2互補(bǔ)配對(duì)的堿基序列；H3與H4之間可以發(fā)生雜交鏈反應(yīng)，并且可使序列中兩個(gè)劈開(kāi)的G-四鏈體片段頭碰頭組裝結(jié)合形成一個(gè)完整的G-四鏈體DNA酶活性結(jié)構(gòu)[10]。

基于G-四鏈體DNA酶雙向自組裝作用的Tb均相比色生物傳感機(jī)制如圖1所示。

圖1 基于G-四鏈體DNA酶雙向自組裝作用的Tb均相比色生物傳感機(jī)制示意圖Fig.1 Schematic illustration of Tb homogeneous colorimetric biosensing mechanism based on bidirectional self-assembly of G-quadruplexe DNAzymes

當(dāng)沒(méi)有目標(biāo)物Tb時(shí)，4個(gè)DNA均可保持穩(wěn)定的發(fā)夾構(gòu)型，從而使得該分析方法具有較弱的背景信號(hào)。當(dāng)Tb存在時(shí)，H1可特異性識(shí)別Tb并由發(fā)夾結(jié)構(gòu)變?yōu)榫€性結(jié)構(gòu)，進(jìn)而溶液中的發(fā)夾H2可通過(guò)堿基互補(bǔ)配對(duì)原則與上述反應(yīng)形成的線性單鏈核酸進(jìn)行雜交。這樣不僅可以通過(guò)鏈置換反應(yīng)使得Tb競(jìng)爭(zhēng)釋放出來(lái)，進(jìn)一步參與同H1的識(shí)別反應(yīng)從而實(shí)現(xiàn)目標(biāo)物循環(huán)，而且由H1和H2雜交產(chǎn)生的雙鏈DNA(dsDNA)前后兩端都設(shè)計(jì)有部分區(qū)域可與H3、H4進(jìn)行堿基序列互補(bǔ)。因此，該反應(yīng)產(chǎn)生的dsDNA即可作為引物來(lái)觸發(fā)與H3、H4進(jìn)行雙向雜交鏈反應(yīng)[9]，從而自組裝生成含有大量G-四鏈體DNA酶活性結(jié)構(gòu)的雙向支路核酸結(jié)構(gòu)。

為了驗(yàn)證上述DNA雜交反應(yīng)的可行性，利用聚丙烯酰胺凝膠電泳(PAGE)分別對(duì)相關(guān)核酸樣品的電泳遷移速率進(jìn)行了表征，結(jié)果如圖2所示。

1～7：H1、H2、H1+H2+Tb、H3、H4、H1+H2+H3+H4、H1+H2+H3+H4+Tb

從圖2可以看出，與單獨(dú)的H1、H2、H3、H4相比，它們的混合樣品未出現(xiàn)新的遷移帶，而H1、H2和Tb混合后出現(xiàn)一個(gè)遷移率較低的新的亮帶。這一結(jié)果不僅說(shuō)明H1、H2、H3、H4在沒(méi)有Tb目標(biāo)物的情況下可在溶液中穩(wěn)定存在，而且證明了發(fā)夾H1可以特異性識(shí)別Tb并與H2發(fā)生雜交反應(yīng)形成dsDNA。當(dāng)將H1、H2、H3、H4與Tb混合后出現(xiàn)了一條遷移速率變慢且具有明顯拖尾現(xiàn)象的梯度電泳帶，這一結(jié)果充分證明了由H1和H2產(chǎn)生的dsDNA可作為H3和H4的引物來(lái)成功觸發(fā)其雜交鏈反應(yīng)。

在此基礎(chǔ)上，即可利用雜交鏈反應(yīng)產(chǎn)物上自組裝形成的大量G-四鏈體DNA酶的優(yōu)良催化顯色反應(yīng)來(lái)進(jìn)行該方法的方便比色信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)。為了進(jìn)一步驗(yàn)證該信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)策略的可行性，采用紫外可見(jiàn)吸收光譜法考察Tb目標(biāo)物在上述構(gòu)建的生物傳感體系中的吸光度響應(yīng)，結(jié)果如圖3所示。

圖3 試劑空白(a)與1 nmol·L-1 Tb(b)的紫外可見(jiàn)吸收光譜(內(nèi)插圖為相應(yīng)檢測(cè)溶液的圖像)Fig.3 UV-Vis absorption spectra of blank control(a) and 1 nmol·L-1 Tb(b)(the inset shows the photographs of corresponding detection solutions)

從圖3可以看出，與試劑空白微弱的吸光度響應(yīng)相比，1 nmol·L-1Tb在進(jìn)行生物識(shí)別及顯色反應(yīng)后所得的檢測(cè)產(chǎn)物在420 nm附近出現(xiàn)了一個(gè)較強(qiáng)的吸收峰；同時(shí)從插圖可以看到，該顯色產(chǎn)物與試劑空白相比發(fā)生了明顯的顏色變化。這一結(jié)果很好證明了將上述設(shè)計(jì)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)策略用于Tb比色生物傳感檢測(cè)是可行的。

2.2 均相反應(yīng)時(shí)間優(yōu)化

為了保證最佳分析性能，同時(shí)向反應(yīng)體系中加入發(fā)夾DNA、Tb目標(biāo)物及hemin溶液均相反應(yīng)不同時(shí)間，考察均相反應(yīng)時(shí)間對(duì)1 nmol·L-1Tb吸光度響應(yīng)的影響，結(jié)果如圖4所示。

圖4 均相反應(yīng)時(shí)間對(duì)1 nmol·L-1 Tb吸光度響應(yīng)的影響Fig.4 Effect of homogeneous reaction time on absorbance response of 1 nmol·L-1 Tb

從圖4可以看出，隨著均相反應(yīng)時(shí)間的延長(zhǎng)，1 nmol·L-1Tb的吸光度響應(yīng)不斷增強(qiáng)；當(dāng)均相反應(yīng)時(shí)間超過(guò)3.0 h后，吸光度響應(yīng)逐漸趨于一個(gè)穩(wěn)定值。表明，3.0 h可充分實(shí)現(xiàn)Tb的均相生物識(shí)別、鏈置換觸發(fā)雜交鏈反應(yīng)以組裝形成G-四鏈體DNA酶活性結(jié)構(gòu)，以及G-四鏈體DNA酶特異性結(jié)合hemin后進(jìn)行靈敏的催化顯色反應(yīng)。因此，確定Tb比色分析的最佳均相反應(yīng)時(shí)間為3.0 h。

2.3 分析性能評(píng)價(jià)

在優(yōu)化條件下，通過(guò)設(shè)計(jì)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)策略比較不同濃度Tb的紫外可見(jiàn)吸收光譜，結(jié)果如圖5所示。

圖5 不同濃度Tb的紫外可見(jiàn)吸收光譜(a)及該方法的校正曲線(b)Fig.5 UV-Vis absorption spectra of different concentrations of Tb(a) and calibration curve of the method(b)

從圖5a可以看出，隨著Tb目標(biāo)物濃度的增加(從1 pmol·L-1增至1 nmol·L-1)，其在420 nm附近的吸收峰強(qiáng)度不斷增強(qiáng)。從圖5b可以看出，在 1 pmol·L-1～1 nmol·L-1濃度范圍內(nèi)，吸光度與Tb目標(biāo)物濃度的對(duì)數(shù)值呈良好的線性關(guān)系。在信背比為3時(shí)，計(jì)算得到該方法的檢測(cè)限為0.82 pmol·L-1，該檢測(cè)限與文獻(xiàn)[3,5,8]報(bào)道的幾種Tb生物傳感方法相比都要低，從而很好證明了該方法的優(yōu)良分析性能。

2.4 特異性與可靠性考察

分別用HIgG、HSA和BSA等3種非同源蛋白代替Tb，采用相同的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)策略考察它們?cè)谒鶚?gòu)建的生物傳感體系中的交叉反應(yīng)情況，結(jié)果如圖6所示。

圖6 空白對(duì)照、100 nmol·L-1 BSA、HSA、HIgG和1 nmol·L-1 Tb的吸光度響應(yīng)Fig.6 Absorbance responses of blank control,100 nmol·L-1 BSA，HSA，HIgG，and 1 nmol·L-1 Tb

從圖6可以看出，與Tb目標(biāo)物明顯的吸光度響應(yīng)相比，100倍濃度的其它3種非同源蛋白都未產(chǎn)生與空白對(duì)照相比明顯的吸光度響應(yīng)。表明，所設(shè)計(jì)的生物傳感體系對(duì)Tb目標(biāo)物具有很高的特異性，該分析方法擁有很好的選擇性。

為了考察該生物傳感方法的分析可靠性及實(shí)際應(yīng)用前景，將其用于人血清樣品中Tb含量的檢測(cè)。由于在所考察的人血清樣品中沒(méi)有Tb檢出，進(jìn)一步將不同濃度的Tb標(biāo)準(zhǔn)溶液加入其中進(jìn)行回收實(shí)驗(yàn)，得到加標(biāo)回收率為96.8%～103.2%，5次平行測(cè)定結(jié)果的RSD<3.2%。表明，將該分析方法用于血清真實(shí)樣品中Tb檢測(cè)具有較好的可靠性和準(zhǔn)確度。

3 結(jié)論

基于高特異性核酸適配體識(shí)別及其觸發(fā)的核酸鏈置換與雜交鏈反應(yīng)來(lái)進(jìn)行G-四鏈體DNA酶活性結(jié)構(gòu)的雙向自組裝，成功發(fā)展了一種可用于Tb均相分析的比色生物傳感新方法。由于鏈置換反應(yīng)輔助的目標(biāo)物循環(huán)和雜交鏈反應(yīng)引起的雙向核酸自組裝均極大促進(jìn)了該DNA酶活性結(jié)構(gòu)的大量形成及其酶催化比色響應(yīng)信號(hào)的放大，使得該方法具很高的分析靈敏度。同時(shí)，該方法在均相分析過(guò)程中不需要進(jìn)行多步反應(yīng)、洗滌、分離操作或使用納米材料來(lái)進(jìn)行信號(hào)放大，操作十分方便，而且還具有優(yōu)良的重復(fù)性，有望在臨床診斷領(lǐng)域發(fā)揮重要的實(shí)用價(jià)值。