包 穎 李澤卿 魏琳燕 陳 超

(1唐山師范學(xué)院生命科學(xué)系，河北 唐山 063000；2中南林業(yè)科技大學(xué)風(fēng)景園林學(xué)院，湖南 長沙 410000)

月季(Rosa hybrida)薔薇科薔薇屬多年生半常綠低矮灌木，被譽(yù)為“花中皇后”，是我國十大傳統(tǒng)名花之一。 月季具有姿態(tài)優(yōu)美、色彩絢麗、品種繁多、芳香馥郁、適應(yīng)性強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn)，在園林綠化和鮮花市場上有著十分重要的地位，具有非常重要的經(jīng)濟(jì)價值[1]。 現(xiàn)代月季栽培品種多是通過薔薇屬野生原種間、品種間反復(fù)雜交、回交等手段選育而成[2]，狹窄的遺傳背景使大多數(shù)月季品種的抗性較差。 切花月季生產(chǎn)中設(shè)施內(nèi)土壤鹽漬化是影響月季切花品質(zhì)和產(chǎn)量的限制因素。同時，鹽堿地區(qū)的土壤環(huán)境嚴(yán)重制約了月季在當(dāng)?shù)貓@林綠化中的應(yīng)用。 高鹽脅迫導(dǎo)致大多數(shù)月季品種生長不良、病蟲害加重，影響了月季的生長發(fā)育和觀賞效果。 目前月季抗鹽性分子機(jī)理的研究較少[3-4]，遠(yuǎn)滯后于花色、花型、花香等其他農(nóng)藝性狀的研究。 因此，發(fā)掘月季抗鹽相關(guān)基因及解析月季鹽脅迫分子機(jī)理已成為當(dāng)下首要解決的問題。

通過轉(zhuǎn)錄因子調(diào)控功能基因的表達(dá)是植物應(yīng)答逆境脅迫的關(guān)鍵環(huán)節(jié)[5-6]。 作為植物體內(nèi)最大的轉(zhuǎn)錄因子家族之一，MYB 轉(zhuǎn)錄因子具有多種生物學(xué)功能，能夠廣泛參與植物的根、莖、葉、花的生長發(fā)育，同時參與鹽漬、冷害、干旱等非生物脅迫的響應(yīng)[7]。 MYB 類轉(zhuǎn)錄因子含有保守MYB 類型的DNA 結(jié)合域，且該結(jié)構(gòu)域由51 ～52 個氨基酸的肽鏈組成[8]。 根據(jù)所含MYB 結(jié)構(gòu)域的特點(diǎn)和數(shù)目，植物中的MYB 轉(zhuǎn)錄因子可分為4 個類型:4R-MYB、3R-MYB、R2R3-MYB 和4R-MYB，其中R2R3-MYB 類型的MYB 類轉(zhuǎn)錄因子數(shù)量較多，并且參與了植物的初生和次生代謝、植物細(xì)胞形態(tài)和模式建成以及植物生長發(fā)育等多個生命過 程 的 調(diào) 節(jié)[9-14]。 如擬南芥中的AtMYB21 和AtMYB24 基因的表達(dá)可促進(jìn)其花青素的積累[15]；在擬南芥中AtMYB37、AtMYB38 和AtMYB84 調(diào)控著擬南芥?zhèn)确稚M織的形成[16]；擬南芥中的AtMYB125基因在其生殖器官發(fā)育階段參與了雄性生殖細(xì)胞的分裂分化[17]。

隨著研究的不斷深入，越來越多的報道證實(shí)MYB轉(zhuǎn)錄因子與植物響應(yīng)高鹽脅迫密切相關(guān)。 在鹽脅迫處理下，甘薯中5 個R2R3-MYB 類型的MYB基因被誘導(dǎo)表達(dá)[18]；花生中有13 個MYB基因上調(diào)表達(dá)，5 個MYB基因下調(diào)表達(dá)[19]；檉柳中的7 個MYB基因均參與鹽堿脅迫的應(yīng)答[20]。 大量研究表明，MYB 轉(zhuǎn)錄因子還參與對植物激素的應(yīng)答反應(yīng)。 如，白樺中BpMYB21 基因的表達(dá)受到茉莉酸甲酯(methyl jasmonate， MeJA)和水楊酸(salicylic acid， SA)的誘導(dǎo)[21]；巴西橡膠樹中HbMYB62 基因在脫落酸(abscisic acid， ABA)和SA 處理下顯著上調(diào)[22]。

本研究依據(jù)前期已經(jīng)完成的高鹽脅迫下月季月月粉根系轉(zhuǎn)錄組測序數(shù)據(jù)結(jié)果，篩選獲得表達(dá)水平顯著上調(diào)的MYB類基因RcWER-like。 進(jìn)一步對月季RcWER-like的序列進(jìn)行生物信息學(xué)分析，并利用實(shí)時熒光定量PCR 分析月季RcWER-like基因在高鹽脅迫、SA 和MeJA 處理、鹽脅迫下外施SA 和MeJA 的表達(dá)模式，從而驗證該基因的生物學(xué)功能，以期為深入剖析月季的抗鹽機(jī)制和培育新的抗鹽堿品種提供重要的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 供試材料及前處理

中國二倍體古老月季品種月月粉(Rosa chinensisOld Blush)，購自昆明楊月季園藝有限責(zé)任公司，將其栽植于唐山師范學(xué)院溫室內(nèi)，并進(jìn)行扦插繁殖。 選用生長狀況良好、長勢一致、植株健壯、無病蟲害的當(dāng)年生月季幼苗進(jìn)行試驗。

首先在每個栽培槽中用10 L 的1/2 Hoagland 營養(yǎng)液緩苗一周，然后用全Hoagland 營養(yǎng)液進(jìn)行鹽脅迫處理(200 mmol·L-1NaHCO3)、激素處理(1 μmol·L-1MeJA、200 μmol·L-1SA)以及鹽與激素綜合處理(200 mmol·L-1NaHCO3＋1 μmol·L-1MeJA、200 mmol·L-1NaHCO3＋200 μmol·L-1SA)，分別于處理0、2、6、12、2、48 h 時采集月季根系和葉片，于-80℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 總RNA 提取與cDNA 合成

月季總RNA 的提取采用EASY spin 植物RNA 快速提取試劑盒(北京艾德萊生物科技有限公司)；按照Roche 公司反轉(zhuǎn)錄試劑盒操作步驟反轉(zhuǎn)錄獲得cDNA。

1.3 RcWER-like 基因的克隆

以月季月月粉cDNA 序列為模板設(shè)計CDS 全長擴(kuò)增引物(表1)，并進(jìn)行PCR 擴(kuò)增。 PCR 反應(yīng)體系:10×KOD Buffer 5 μL、2 mmol·L-1MgSO43 μL、25 mmol·L-1dNTPs 5 μL、cDNA 1 μL、(10 μmol·L-1)上下游引物各1.5 μL、KOD Plus 高保真酶1 μL，無菌ddH2O 補(bǔ)齊至20 μL。 混勻離心后放于ProFlexTMPCR儀(美國ABI 公司)中進(jìn)行擴(kuò)增。 反應(yīng)程序:94℃預(yù)變性2 min；94℃變性15 s，56.1℃退火30 s，68℃延伸1 min，共35 個循環(huán)；68℃延伸5 min，4℃反應(yīng)終止。將PCR 產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳檢測，利用Mini BESTAgarose Gel DNA Extraction Kit 試劑盒(大連TaKaRa 公司)回收目的條帶，并與pMD18-T 載體連接。 連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌，藍(lán)白斑篩選，挑取白色單菌落鑒定，根據(jù)菌落PCR 結(jié)果，將鑒定出的陽性克隆交由北京諾賽基因組研究中心有限公司測序。

1.4 月季轉(zhuǎn)錄因子RcWER-like 的生物信息學(xué)分析

根據(jù)前期鹽脅迫轉(zhuǎn)錄組測序數(shù)據(jù)(SRA accession:PRJNA587482；ID: SUB6482523)和月季全基因組[23]數(shù)據(jù)，獲取RcWER-like基因CDS 序列和基因全長序列。 根據(jù)所獲得的RcWER-like基因cDNA 和基因全長序列，使用DNAMAN 軟件分析RcWER-like 氨基酸序列同源性；使用clutaLX 進(jìn)行氨基酸序列比對分析，使用MEGA 6.0 軟件進(jìn)行系統(tǒng)進(jìn)化樹分析。

1.5 實(shí)時熒光定量PCR 分析

采用軟件Primer 5.0 設(shè)計RcWER-like的實(shí)時熒光定量引物，內(nèi)參基因為RcActin，引物序列見表1。RcWER-like基因的表達(dá)量在7500 熒光定量PCR 儀(美國ABI 公司)上進(jìn)行檢測。 PCR 反應(yīng)體系:cDNA模板3 μL、10 μmol·L-1上游引物1 μL、10 μmol·L-1下游引物1 μL、SYBR? Premix Ex Taq Ⅱ(2×)10 μL、ddH2O 5 μL。 反應(yīng)程序:94℃預(yù)變性30 s；94℃變性5 s，60℃退火、延伸2 min，40 個循環(huán)。 每處理進(jìn)行3 次生物學(xué)重復(fù)和3 次平行樣重復(fù)。 相對表達(dá)量采用2-ΔΔCt法計算，用SPSS 19.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計分析。

表1 試驗中所用的引物Table 1 The information of primers used in this study

2 結(jié)果與分析

2.1 月季轉(zhuǎn)錄因子RcWER-like 的生物信息學(xué)分析

從月季月月粉中獲得了RcWER-like基因的cDNA和基因序列全長(圖1)。 測序結(jié)果表明，RcWER-like基因全長882 bp，開放閱讀框(open reading frame，ORF)為669 bp，可編碼223 個氨基酸。

圖1 月季RcWER-like 基因的cDNA 擴(kuò)增Fig.1 cDNA amplification of R. chinensis RcWER-like

利用DNAMAN 軟件對RcWER-like 蛋白序列進(jìn)行同源性比對發(fā)現(xiàn)，RcWER-like 蛋白序列與桃PpWERlike、梅花PmWER-like 和蘋果MdWER-like 蛋白序列的相似度分別為63.36%、62.45%和59.62%；利用clutaLX 軟件對轉(zhuǎn)錄因子RcWER-like 進(jìn)行序列比對發(fā)現(xiàn)，RcWER-like 蛋白序列含有2 個MYB 家族特征結(jié)構(gòu)域(R2 和R3 結(jié)構(gòu)域)，分別由48 和46 個氨基酸構(gòu)成，且在結(jié)構(gòu)域中存在多個保守色氨酸殘基(圖2)。

為了進(jìn)一步驗證月季RcWER-like的基因功能，本研究利用MEGA 6.0 構(gòu)建了月季RcWER-like 蛋白與其他植物的氨基酸序列進(jìn)化樹。 結(jié)果顯示，RcWERlike 與薔薇科的梅花PmWER-like、蘋果MdWER-like和桃PpWER-like 的親緣關(guān)系較近(圖3)。

2.2 月季RcWER-like 在不同處理下的表達(dá)模式分析

2.2.1 鹽脅迫對RcWER-like基因表達(dá)的影響 對月季月月粉進(jìn)行高鹽脅迫處理時，與對照相比，鹽脅迫處理24 h 和48 h 的月季幼苗基部葉片明顯褐化(圖4)。對月季進(jìn)行高鹽脅迫處理后，RcWER-like基因表達(dá)明顯受到誘導(dǎo)(圖5)。RcWER-like基因在月季的葉和根均有表達(dá)，但在不同組織中的表達(dá)量存在顯著差異，且根中的相對表達(dá)量明顯高于葉中。 根中RcWER-like基因的相對表達(dá)量呈現(xiàn)上升趨勢，在處理24 h 時達(dá)到最高(18.93)；葉中RcWER-like基因的相對表達(dá)量呈現(xiàn)先升高后下降的趨勢，在處理12 h 時達(dá)到最高(2.35)。

2.2.2 外源激素對RcWER-like基因表達(dá)的影響 由圖6 可知，在外源激素SA 和MeJA 作用下，RcWER-like基因在葉和根中的表達(dá)模式無明顯差異。 在SA 處理12～48 h 時，根中RcWER-like相對表達(dá)量呈現(xiàn)持續(xù)上升的趨勢，在處理48 h 達(dá)到最高(8.13)；葉中RcWERlike相對表達(dá)量呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢，在處理24 h 時達(dá)到最高(4.78)。 在MeJA 處理下，根和葉中RcWER-like的表達(dá)均明顯受到誘導(dǎo)，且均在處理24 h時達(dá)到最高，分別為4.18 和3.58。 上述結(jié)果表明，外源激素SA 和MeJA 均可誘導(dǎo)月季RcWER-like基因的表達(dá)，且在根中的表達(dá)量相對較高，激素處理對RcWER-like的表達(dá)都具有明顯誘導(dǎo)作用。

2.2.3 高鹽脅迫和外源激素共處理對RcWER-like基因表達(dá)的影響 進(jìn)一步利用Real-time PCR 對RcWERlike在高鹽與激素同時處理下的表達(dá)量進(jìn)行分析。 由圖7 可知，在鹽脅迫下施用SA 時，RcWER-like在根和葉中的相對表達(dá)量呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢，且都在處理24 h 時達(dá)到最高，分別為55.26 和3.43；在鹽脅迫下施用MeJA 時，RcWER-like在根中的相對表達(dá)量呈現(xiàn)上升的趨勢，在處理48 h 時達(dá)到最高，為74.45；RcWER-like在葉中的相對表達(dá)量呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢，在處理6 h 時達(dá)到最高，為20.82。 上述結(jié)果表明，在高鹽脅迫與外源激素共同處理時，RcWER-like基因在葉和根中的表達(dá)模式存在顯著差異，且在根中的相對表達(dá)量明顯高于葉片。 此外，月季根系和葉片中RcWER-like基因的表達(dá)水平顯著高于單獨(dú)鹽脅迫和激素處理。

3 討論

圖4 不同處理下月季的生長形態(tài)Fig.4 The growth shape of R. chinensis under different treatments

圖5 鹽脅迫下月季RcWER-like 的表達(dá)特性Fig.5 Expression characteristics of RcWER-like in R. chinensis under salt stress

MYB 類轉(zhuǎn)錄因子是植物最大的轉(zhuǎn)錄因子家族之一[24]，參與植物多種生物和非生物脅迫過程，從而使植物適應(yīng)不同的逆境[25-26]。 本研究以月季月月粉為試驗材料，初步分析了MYB 類轉(zhuǎn)錄因子基因RcWERlike的生物學(xué)功能。 結(jié)果表明，月季RcWER-like 氨基酸序列具有R2 和R3 保守結(jié)構(gòu)域，屬于R2R3-MYB 轉(zhuǎn)錄因子。 大量研究表明，大部分響應(yīng)鹽脅迫的MYB基因均為R2R3 類型。 如擬南芥中的AtMYB73 基因調(diào)控著其對鹽脅迫的響應(yīng)[27]；將蘋果MdMYB73 基因遺傳轉(zhuǎn)化蘋果愈傷組織，抗鹽表型分析表明，MdMYB73 過量表達(dá)明顯降低了轉(zhuǎn)基因愈傷組織對鹽脅迫的抗性[28]；棉花GhMYB73 基因受高鹽脅迫誘導(dǎo)，抑制GhMYB73 在棉花中的表達(dá)增加了棉花對鹽脅迫的敏感性，且過表達(dá)棉花GhMYB73 基因的擬南芥幼苗對鹽脅迫的抗性增強(qiáng)[29]。 番茄MYB49 基因受鹽脅迫的誘導(dǎo)，過表達(dá)番茄MYB49 基因的轉(zhuǎn)基因植株對鹽脅迫有較強(qiáng)的耐受性[30]。 此外，鹽脅迫可以誘導(dǎo)切花月季中RhMYB96 基因的表達(dá)，過表達(dá)該基因的擬南芥轉(zhuǎn)基因植株耐鹽性增強(qiáng)[31]。 本研究中，高鹽脅迫可誘導(dǎo)月季月月粉RcWER-like基因的表達(dá)，說明RcWER-like參與了高鹽逆境脅迫的響應(yīng)過程。

WER 屬于R2R3 亞類成員，具有多種功能，在控制細(xì)胞分化、應(yīng)答激素調(diào)節(jié)和外界環(huán)境刺激等方面發(fā)揮著一定作用[32]。 本研究中，系統(tǒng)進(jìn)化樹結(jié)果顯示，月季月月粉 RcWER-like 與桃 PpWER-like、 梅花PmWER-like、蘋果MdWER-like 處于同一分支，屬于R2R3-MYB 類轉(zhuǎn)錄因子。 前人已從擬南芥中分離得與控制根毛發(fā)生有關(guān)的轉(zhuǎn)錄因子WER[33]。 由于WER位于調(diào)控根毛發(fā)生網(wǎng)絡(luò)的上游，調(diào)控著其他轉(zhuǎn)錄因子，所以一般認(rèn)為WER 是控制根毛發(fā)生的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子。 此外，Wang 等[34]發(fā)現(xiàn)擬南芥根毛的發(fā)育受鹽脅迫的高度調(diào)控，且鹽脅迫可以誘導(dǎo)擬南芥AtWER基因的表達(dá)。 以上結(jié)果均表明，轉(zhuǎn)錄因子RcWER-like 可能與月季抵抗鹽脅迫有著密切的關(guān)系。

圖6 不同激素處理下月季RcWER-like 的表達(dá)特性Fig.6 Expression characteristics of RcWER-like in R. chinensis under different exogenous hormones treatment

圖7 鹽與激素綜合脅迫下RcWER-like 的表達(dá)特性Fig.7 Expression characteristics of RcWER-like under salt stress and exogenous hormones treatment

大量研究表明，MYB 轉(zhuǎn)錄因子參與對植物激素的應(yīng)答過程。 在大豆中，ABA、赤霉素(gibberellins，GA3) 和荼乙酸(naphthylacetic acid， NAA) 可誘導(dǎo)GmMYBJ6 的表達(dá)，而GmMYBJ7 易被ABA 和NAA 誘導(dǎo)[35]；在柑橘中，ABA、氨基環(huán)丙烷羧酸(amino cyclopropane carboxylic acid， ACC)、SA、MeJA 均可誘導(dǎo)CitMYB40 的表達(dá)[36]；在小麥中，ABA 處理可上調(diào)TaMYB3R的表達(dá)，MeJA 對TaMYB3R的表達(dá)起到下調(diào)作用[37]；外源激素SA、ABA、MeJA 和GA3也可誘導(dǎo)白木香AsMYB1 和AsMYB2 基因的表達(dá)[38]。 本研究結(jié)果表明，外源激素SA、MeJA 均可誘導(dǎo)月季RcWER-like基因的表達(dá)，且在根中的表達(dá)量相對較高，這可能是由于根對于外源激素SA、MeJA 的刺激更為敏感。

植物激素除了參與植物的生長發(fā)育，還響應(yīng)非生物脅迫如冷害、高溫、高鹽和干旱等過程。 外源MeJA可以抑制H2O2積累從而提高煙草的耐冷性[39]；外源MeJA 可顯著提高冬小麥的抗寒性，且冬小麥葉片及分蘗節(jié)中TaPDF1.2、TaCOI1 和TaMYC2 基因的表達(dá)量顯著增加[40]。 茉莉酸類物質(zhì)(jasmonic acid， JAs)作為信號分子，可以激活植物逆境脅迫響應(yīng)中的某些信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑[41]。 本試驗結(jié)果表明，鹽脅迫與外施激素共同處理時，月季根和葉中RcWER-like基因的表達(dá)水平顯著高于單獨(dú)鹽脅迫和激素處理，且外施MeJA 較SA 的誘導(dǎo)效果更顯著。 由此推斷，RcWER-like基因可能通過MeJA 信號途徑參與月季鹽脅迫應(yīng)答。

4 結(jié)論

本研究克隆了月季RcWER-like基因，對該基因的生物學(xué)功能進(jìn)行驗證。 在鹽脅迫下，外施水楊酸和茉莉酸甲均可誘導(dǎo)RcWER-like的表達(dá)，且均高于單鹽或激素處理。 作為典型的R2R3-MYB 類轉(zhuǎn)錄因子，RcWER-like 可能在月季高鹽脅迫應(yīng)答中具有重要的作用，但對其功能的驗證及其耐鹽分子機(jī)制的揭示仍需進(jìn)一步的研究。

致謝:感謝北京林業(yè)大學(xué)國家花卉工程技術(shù)研究中心韓瑜老師給予的支持和幫助! 感謝中國科學(xué)院武漢植物園助理研究員廖燎給予的支持和幫助!