周本益，戴 珊，陳 斌

鼻咽癌是我國(guó)較為常見的頭頸部腫瘤之一，發(fā)病主要多見于我國(guó)南方和東南亞地區(qū)[1]。目前在臨床上，鼻咽癌的治療手段主要以放療為主、化療為輔，但是對(duì)于復(fù)發(fā)或轉(zhuǎn)移的鼻咽癌患者而言，化療更為重要，有時(shí)甚至成為治療的唯一手段[2]。目前有大量臨床資料報(bào)道，由于鼻咽癌患者早期臨床癥狀并不明顯，故在確診時(shí)大部分已至中晚期；而且該類腫瘤具有較高的轉(zhuǎn)移風(fēng)險(xiǎn)，故其治愈率和遠(yuǎn)期生存率均較低[3-4]。曾有研究數(shù)據(jù)報(bào)道，鼻咽癌患者的5年總生存率可低于50%，嚴(yán)重危及患者的生命安全[5]。為進(jìn)一步提高鼻咽癌患者的預(yù)后生存率，有研究在臨床綜合治療中加入適當(dāng)?shù)妮o助藥物，以降低患者轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā)率，提高生存率。香葉木素具有抗氧化、抗炎癥、抗過敏、抗腫瘤、植物雌激素作用等多種藥理活性，是一種具有良好開發(fā)潛力的天然黃酮類化合物[6-7]。目前，國(guó)內(nèi)外有多項(xiàng)實(shí)驗(yàn)，在細(xì)胞水平和分子水平對(duì)香葉木素進(jìn)行研究[8-9]。本文以鼻咽癌CNE2細(xì)胞為研究對(duì)象，分析香葉木素的抗腫瘤作用及機(jī)制，為臨床抗腫瘤輔助藥物的研發(fā)提供新的思路、方法及依據(jù)。

1 材料與方法

1.1主要試劑與儀器 香葉木素(D485000)購(gòu)于北京百靈威科技有限公司。在干凈無菌環(huán)境中將香葉木素粉末溶解于二甲基亞砜(DMSO)，配制成100 mmol/L的高濃度儲(chǔ)備液，分裝后置于-20℃冰箱保存。臨用時(shí)以磷酸鹽緩沖液稀釋至所需濃度。胰酶購(gòu)自美國(guó)Gibco公司，DMEM高糖培養(yǎng)基購(gòu)自美國(guó)Gibco公司，氯化鈉(分析純)、氯化鉀(分析純)和磷酸二氫鉀(分析純)均購(gòu)自國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司，DMSO購(gòu)自美國(guó)Sigma公司。CO2培養(yǎng)箱(311)購(gòu)自賽默飛世爾科技(中國(guó))有限公司，熒光倒置顯微鏡(X-73P1F)購(gòu)自?shī)W林巴斯(中國(guó))有限公司，微量振蕩器購(gòu)自海門市其林貝爾儀器制造有限公司，酶標(biāo)儀(Synergy 2)購(gòu)自美國(guó)Bio-Tek公司，流式細(xì)胞儀購(gòu)自美國(guó)BD公司，電泳儀購(gòu)自美國(guó)BIO-RAD公司。

1.2細(xì)胞分組 人鼻咽癌CNE2細(xì)胞株購(gòu)自ATCC(美國(guó))。應(yīng)用血清培養(yǎng)液，在溫度為37℃、CO2濃度為5%的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。加入不同濃度香葉木素處理的人鼻咽癌CNE2細(xì)胞作為實(shí)驗(yàn)組，加入藥物溶解介質(zhì)的人鼻咽癌CNE2細(xì)胞作為對(duì)照組。

1.3MTT比色法檢測(cè)鼻咽癌CNE2細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制情況 選取處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的鼻咽癌CNE2細(xì)胞，加入適量的胰酶使其在CO2培養(yǎng)箱中消化。完成后將其置于倒置顯微鏡下進(jìn)行觀察，當(dāng)細(xì)胞變小變圓，細(xì)胞間出現(xiàn)裂隙時(shí)加入新的含血清培養(yǎng)液終止消化，用移液槍輕輕吹打制成單細(xì)胞懸液。置于倒置顯微鏡下使用血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)，加入新鮮的含血清培養(yǎng)液，制成細(xì)胞濃度為1.0×105/ml的單細(xì)胞懸液。按照每孔1 ml細(xì)胞懸液，接種于96孔板中，置于溫度為37℃、CO2濃度為5%的培養(yǎng)箱中孵育過夜。待細(xì)胞貼壁后，更換新鮮的含血清培養(yǎng)液，加入稀釋好的呈濃度梯度的香葉木素溶液，藥物的終濃度為3.125、6.25、12.5、25、50、100 μmol/L，每個(gè)濃度3個(gè)復(fù)孔。對(duì)照組加入相同體積的藥物溶解介質(zhì)。加藥后，置于37℃、5% CO2培養(yǎng)箱中孵育72 h。將MTT溶液在培養(yǎng)結(jié)束前4 h加入到各孔中，每孔50 μl(1 mg/ml)，加入MTT溶液后繼續(xù)培養(yǎng)4 h。孵育完成后從CO2培養(yǎng)箱中取出96孔板，吸去上清液，每孔加入100 μl的DMSO，微量振蕩器室溫下振蕩10 min，使甲瓚結(jié)晶充分溶解。使用酶標(biāo)儀檢測(cè)570 nm波長(zhǎng)處吸光度值。實(shí)驗(yàn)獨(dú)立重復(fù)3次然后進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，計(jì)算出不同濃度香葉木素對(duì)鼻咽癌CNE2細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制率。

1.4流式細(xì)胞儀檢測(cè)鼻咽癌CNE2細(xì)胞凋亡情況 選取處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的鼻咽癌CNE2細(xì)胞，按上述方法制成細(xì)胞濃度為1.0×105/ml的單細(xì)胞懸液。按照每孔1 ml細(xì)胞懸液，接種于6孔板中，置于溫度為37℃、CO2濃度為5%的培養(yǎng)箱中孵育過夜。分別加入濃度為20、40、60、80和100 μmol/L的香葉木素作為實(shí)驗(yàn)組，另外設(shè)對(duì)照組加入相同體積的藥物溶解介質(zhì)。均在CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。藥物孵育結(jié)束后繼續(xù)進(jìn)行染色孵育，然后進(jìn)行流式細(xì)胞儀檢測(cè)，其中Annexin V-FITC的綠色熒光信號(hào)使用FL1通道檢測(cè)，PI的紅色熒光信號(hào)使用FL2通道進(jìn)行檢測(cè)，最后進(jìn)行凋亡率的計(jì)算分析。

1.5鼻咽癌CNE2細(xì)胞周期檢測(cè) 鋪板同細(xì)胞凋亡檢測(cè)相同，鼻咽癌CNE2細(xì)胞藥物孵育實(shí)驗(yàn)中加入濃度為100 μmol/L的香葉木素，分為孵育0 h組、孵育6 h組、孵育18 h組、孵育24 h組、孵育30 h組、孵育42 h組。每組3個(gè)復(fù)孔。藥物孵育實(shí)驗(yàn)結(jié)束后進(jìn)行細(xì)胞收集、洗滌并固定細(xì)胞、染色孵育，最后應(yīng)用流式細(xì)胞儀檢測(cè)和分析結(jié)果。結(jié)果數(shù)據(jù)采用Flowjo軟件進(jìn)行分析。

1.6p38JNK信號(hào)通路蛋白表達(dá)測(cè)定 采用Western Blotting方法檢測(cè)磷酸化Erkl/2、p38、JNK蛋白的表達(dá)，實(shí)驗(yàn)組分別加入終濃度為0、12.5、25、50、100和150 μmol/L的香葉木素作為實(shí)驗(yàn)組，另外設(shè)對(duì)照組，加入相同體積的藥物溶解介質(zhì)。所有鼻咽癌CNE2細(xì)胞均放入CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。然后進(jìn)行細(xì)胞總蛋白提取、蛋白定量測(cè)定、制膠、電泳、轉(zhuǎn)膜，進(jìn)行免疫反應(yīng)，然后進(jìn)行顯影和定影，最后進(jìn)行數(shù)據(jù)處理和圖片分析，掃描保存的圖片采用Image J分析軟件進(jìn)行灰度分析。

2 結(jié)果

2.1生長(zhǎng)抑制率比較 對(duì)照組細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制率為(0.12±0.01)%，3.125、6.25、12.5、25、50和100 μmol/L濃度香葉木素實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制率分別為(18.24±0.46)%、(29.46±0.95)%、(46.68±2.31)%、(72.46±5.87)%、(76.98±6.05)%、(83.32±7.14)%。不同濃度香葉木素實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制率均高于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。不同濃度香葉木素對(duì)鼻咽癌CNE2細(xì)胞的生長(zhǎng)具有抑制作用，且隨著香葉木素濃度的上升，細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率逐漸上升，呈現(xiàn)濃度依賴性，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

2.2細(xì)胞凋亡率比較 鼻咽癌CNE2細(xì)胞加入香葉木素處理24 h后，對(duì)照組細(xì)胞凋亡率為(2.41±0.14)%，20、40、60、80和100 μmol/L濃度香葉木素實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞凋亡率分別為(13.26±0.06)%、(25.14±0.14)%、(32.38±0.06)%、(43.52±0.09)%、(55.80±0.19)%。不同濃度香葉木素實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞凋亡率均高于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。隨著香葉木素濃度的增加，鼻咽癌CNE2細(xì)胞凋亡率逐漸上升，呈現(xiàn)濃度依賴性，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)

2.3香葉木素對(duì)鼻咽癌CNE2細(xì)胞周期的影響 加入100 μmol/L香葉木素進(jìn)行處理后，與孵育0 h組比較，孵育6、18、24、30、42 h組G1期細(xì)胞比例顯著減少，而在G2/M期細(xì)胞比例顯著增加，且隨著加入香葉木素后孵育時(shí)間的延長(zhǎng)，G1期細(xì)胞比例逐漸減少，而G2/M期細(xì)胞比例逐漸增加，明顯改變了鼻咽癌CNE2細(xì)胞的周期分布，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見表1。

2.4磷酸化Erkl/2、p38、JNK蛋白表達(dá)水平比較 不同濃度香葉木素對(duì)鼻咽癌CNE2細(xì)胞磷酸化Erkl/2蛋白含量無明顯影響，其含量無明顯變化(P>0.05)；而隨著香葉木素濃度的增高，p38蛋白與JNK蛋白含量均呈逐漸上升趨勢(shì)，且呈現(xiàn)濃度依賴性(P<0.01)。見表2、圖1。

表1 香葉木素對(duì)鼻咽癌CNE2細(xì)胞周期的影響

注：與孵育0 h組比較，aP<0.05

表2 不同濃度香葉木素對(duì)鼻咽癌CNE2細(xì)胞中磷酸化Erkl/2、p38、JNK蛋白表達(dá)的影響

圖1 不同濃度香葉木素對(duì)鼻咽癌CNE2細(xì)胞磷酸化Erkl/2、p38與JNK蛋白表達(dá)的影響

3 討論

香葉木素是一種天然的黃酮類化合物，因具有較好的抗氧化、抗菌、抗炎、抗過敏、抗腫瘤和植物雌激素作用，被認(rèn)為是具有較好開發(fā)潛力的天然中草藥[10-12]。Androutsopoulos等[13]研究顯示，香葉木素對(duì)乳腺癌腫瘤細(xì)胞MDA-MB-468的增殖具有一定的抑制作用，但對(duì)正常乳腺組織細(xì)胞無明顯影響；該項(xiàng)研究還發(fā)現(xiàn)，乳腺癌細(xì)胞MDA-MB-468在香葉木素作用一定時(shí)間后，細(xì)胞周期明顯改變，有部分腫瘤細(xì)胞被阻滯于G1期，而對(duì)于正常乳腺組織細(xì)胞而言，并未出現(xiàn)細(xì)胞周期阻滯現(xiàn)象。此外，還有學(xué)者在肝癌腫瘤細(xì)胞的研究中發(fā)現(xiàn)，香葉木素可將肝癌HepG2細(xì)胞的生長(zhǎng)周期阻滯于G2/M期，從而抑制了肝癌細(xì)胞的增殖生長(zhǎng)，在采用香葉木素處理的肝癌細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)，相關(guān)抑癌因子如p53基因、p21蛋白的表達(dá)增加，p-ERK和p-JNK蛋白的含量也顯著上升[14-15]。因此，有學(xué)者認(rèn)為，香葉木素可能具有廣泛抗腫瘤效果，但關(guān)于其具體的機(jī)制通路還在繼續(xù)研究當(dāng)中[16-18]。

本組研究結(jié)果顯示，香葉木素對(duì)鼻咽癌CNE2細(xì)胞的生長(zhǎng)具有抑制作用，且隨著香葉木素濃度的上升，細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率和凋亡率均明顯上升，且呈現(xiàn)濃度依賴性。而在細(xì)胞周期檢測(cè)中發(fā)現(xiàn)，與孵育0 h組比較，香葉木素孵育的鼻咽癌CNE2細(xì)胞在G1期細(xì)胞比例顯著減少，而在G2/M期細(xì)胞比例明顯增加，且隨著香葉木素孵育時(shí)間的延長(zhǎng)，G1期細(xì)胞比例逐漸減少，G2/M期細(xì)胞比例逐漸增加。但在正常生理狀態(tài)下，由于G0期即細(xì)胞靜息期時(shí)間最長(zhǎng)，故位于G0/G1時(shí)期細(xì)胞比例最高[19]。但本研究結(jié)果顯示，香葉木素明顯明顯改變了鼻咽癌CNE2細(xì)胞的周期分布，可減少G0/G1期細(xì)胞比例，增加G2/M期細(xì)胞比例，由此將鼻咽癌CNE2細(xì)胞阻滯于G2/M期，抑制其增殖生長(zhǎng)，起到抗癌作用。

本研究結(jié)果還發(fā)現(xiàn)，不同濃度香葉木素均對(duì)鼻咽癌CNE2細(xì)胞中磷酸化Erkl/2蛋白的表達(dá)無明顯影響；而隨著香葉木素濃度的增加，p38蛋白和JNK蛋白含量的表達(dá)均呈現(xiàn)上升趨勢(shì)。上述結(jié)果提示，香葉木素誘導(dǎo)鼻咽癌CNE2細(xì)胞凋亡、改變細(xì)胞周期而抑制細(xì)胞增殖生長(zhǎng)可能是通過活化MAPK家族中p38JNK信號(hào)通路來實(shí)現(xiàn)。有研究表明，p38MAPK蛋白信號(hào)通路與細(xì)胞周期中G2/M期的阻滯有著一定聯(lián)系，其主要機(jī)制可能是p38MAPK信號(hào)通路被激活導(dǎo)致p38蛋白的活化磷酸化，而磷酸化的p38蛋白具有下調(diào)Cdc25B活性的作用，而Cdc25B蛋白的活性與Cdc25蛋白活性息息相關(guān)，前者的下調(diào)也會(huì)導(dǎo)致后者的下調(diào)，Cdc25又可激活Cdc2蛋白[20-22]。而細(xì)胞在G2期向M期的轉(zhuǎn)化過程中，Cdc2和Cyclin B的結(jié)合是必不可少的，一旦Cdc2減少，則缺乏與Cyclin B結(jié)合以及減少酶的活性，最終導(dǎo)致G2期向M期轉(zhuǎn)化阻滯，從而起到抑制腫瘤細(xì)胞增殖生長(zhǎng)的作用[23-24]。曾有文獻(xiàn)證實(shí)，在線粒體調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡的途徑中，JNK的激活也起著極為重要的作用[25]。有生物學(xué)研究發(fā)現(xiàn)，JNK的激活對(duì)抑癌基因Bcl-2和Bcl-xl蛋白的表達(dá)具有一定的上調(diào)作用，在發(fā)揮抑癌效果的同時(shí)，還可改變線粒體膜電位和細(xì)胞色素C的釋放，對(duì)caspase-9和caspase-3的表達(dá)具有上調(diào)效果，最終發(fā)揮促進(jìn)細(xì)胞凋亡的作用[26-27]。

綜上所述，香葉木素可促進(jìn)鼻咽癌CNE2細(xì)胞凋亡，通過改變細(xì)胞周期抑制其增殖生長(zhǎng)，具有抗腫瘤活性。其機(jī)制可能與香葉木素能引起細(xì)胞G2/M期阻滯和活化p38JNK信號(hào)通路有關(guān)。但關(guān)于p38JNK信號(hào)通路與細(xì)胞G2/M期阻滯之間的聯(lián)系還有待進(jìn)一步深入研究。