劉振玲

天津市薊州區(qū)人民醫(yī)院檢驗(yàn)科 301900

隨著我國(guó)人口老齡化的加劇，血栓性疾病已成為常見病和多發(fā)病,其發(fā)病率呈逐年上漲的趨勢(shì)?？寡“逅幬镌谥委熝ㄐ约膊≈邪l(fā)揮著重要的作用,其療效是肯定的，但在使用過程中存在著顯著的個(gè)體差異，伴隨著一定的出血風(fēng)險(xiǎn)。臨床希望實(shí)驗(yàn)室能夠?yàn)榭寡“逯委熖峁┛煽康脑囼?yàn)數(shù)據(jù)，確保治療的安全性和有效性?，F(xiàn)有的血小板功能試驗(yàn)對(duì)抗血小板治療的監(jiān)測(cè)具有重要的指導(dǎo)意義,但存在著一定的局限性。本文對(duì)目前臨床使用的血小板功能的檢測(cè)方法做一簡(jiǎn)單介紹，分析其檢測(cè)結(jié)果對(duì)臨床抗血小板治療的指導(dǎo)意義。

1 抗血小板藥物分類

抗血小板藥物是一類有效抑制血液中血小板釋放、聚集和黏附功能的藥物，能夠阻止血小板聚集，預(yù)防和治療血栓性疾病[1]。根據(jù)藥物作用靶點(diǎn)不同,在臨床上廣泛應(yīng)用的抗血小板藥物主要分為四大類：(1)環(huán)氧化酶抑制劑，其主要通過抑制血小板PGH2 合成酶而阻斷TXA2 的生成，進(jìn)而阻止血小板的聚集，預(yù)防血栓形成,代表藥物為阿司匹林[2]。(2)P2Y12受體拮抗劑，其主要通過抑制血小板膜P2Y12受體的表達(dá)、結(jié)合及其活性，從而抑制GPⅡb/Ⅲa 與纖維蛋白原的結(jié)合，通過活化血小板腺苷酸環(huán)化酶，升高血小板內(nèi)環(huán)磷酸腺苷(cAMP)水平而抑制血小板的聚集功能,代表藥物為氯吡格雷、普拉格雷、替格瑞洛等[3-4]。(3)血小板表面GPⅡb/Ⅲa受體拮抗劑，GPⅡb/Ⅲa受體拮抗劑能夠抑制血小板GPⅡb/Ⅲa受體與纖維蛋白原的結(jié)合，血小板不能發(fā)生交聯(lián)，阻止血小板聚集,代表藥物主要阿昔單抗、替羅非班、依替非巴肽等[5-6]。(4)磷酸二酯酶抑制劑，通過激活血小板環(huán)磷腺苷(如腺苷、前列腺素)，或抑制磷酸二酯酶對(duì)cAMP的降解，從而增高血小板內(nèi)cAMP濃度,抑制血小板的第一相聚集和第二相聚集,代表藥物主要有西洛他唑、雙嘧達(dá)莫等[6-8]?？寡“逅幈O(jiān)測(cè)試驗(yàn)見表1。

表1 抗血小板藥物監(jiān)測(cè)試驗(yàn)

2 血小板功能檢測(cè)試驗(yàn)

2.1 血小板聚集試驗(yàn)(PAgT) 血小板聚集試驗(yàn)按工作原理分為光學(xué)比濁法(Light transmission aggregometry，LTA)和電阻抗法(Multiple electrode aggregometry，MEA)。LTA法采用的是富含血小板血漿(PRP)，在富含血小板血漿中加入誘導(dǎo)劑誘導(dǎo)血小板生聚集，隨著血小板聚集的發(fā)生血漿濁度逐漸降低，透光度逐漸增加，這種光濁度變化轉(zhuǎn)換為電信號(hào)并記錄下來，形成血小板聚集曲線[9]。通過血小板聚集曲線反映血小板聚集的程度和速度。電阻抗法采用的是全血樣品，血小板經(jīng)誘導(dǎo)劑作用發(fā)生聚集，浸泡在全血樣品中電極探針間發(fā)生微小電流或電阻抗發(fā)生變化，從而反應(yīng)血小板聚集功能[10-11]。光學(xué)比濁法是目前應(yīng)用最廣泛的血小板功能檢測(cè)方法，是評(píng)估血小板功能的“金標(biāo)準(zhǔn)”。該方法是在低切變率的血漿環(huán)境中,血小板經(jīng)誘導(dǎo)劑作用下而發(fā)生聚集，不能真實(shí)地反應(yīng)血管壁損傷時(shí)血小板黏附、釋放和聚集的功能[12]。電阻抗法是在全血的環(huán)境下，血小板并經(jīng)誘導(dǎo)劑作用而發(fā)生聚集，更能真實(shí)地反映血小板在體內(nèi)的活性和黏附功能。血小板聚集試驗(yàn)常用于監(jiān)測(cè)的藥物有阿司匹林、P2Y12受體拮抗劑。該方法的優(yōu)點(diǎn)是價(jià)格低廉，易于推廣，與臨床事件相關(guān)性好。缺點(diǎn)是試驗(yàn)所需的標(biāo)本量較大，標(biāo)本預(yù)處理程序比較復(fù)雜。

2.2 Verify Now POCT檢測(cè) Verify Now POCT檢測(cè)是采用全血的床旁快速檢測(cè)方法，其檢測(cè)原理是使用血小板激活劑激活血液中的血小板，激活后的血小板與包被纖維蛋白原的珠子發(fā)生聚集反應(yīng)，以此來檢測(cè)血小板的活性，聚集的程度與血小板成功能呈正比。Verify Now POCT檢測(cè)法可用于監(jiān)測(cè)的藥物有阿司匹林、P2Y12受體拮抗劑、GPⅡb/Ⅲa受體拮抗劑，其優(yōu)點(diǎn)是采用全血作為標(biāo)本，方法簡(jiǎn)單易行,檢測(cè)結(jié)果重復(fù)好且與LTA法有較好的相關(guān)性[11]。缺點(diǎn)檢測(cè)成本較高，普及難度較大。

2.3 流式血小板功能分析 流式血小板功能分析是通過流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)血小板表面的活化標(biāo)志物，判斷血小板的活化狀態(tài)，可以檢測(cè)的血小板活化標(biāo)志物有：P-選擇素(CD62)、溶酶體顆粒膜糖蛋白(CD62)、血小板表面GPⅡb/Ⅲa受體等[9，11]。其中，P-選擇素活化的血小板分子標(biāo)志物，具有一定的特異性[11]。流式血小板功能分析的缺點(diǎn)是檢測(cè)成本和技術(shù)要求較高,普及難度較大。

2.4 血管舒張刺激磷蛋白(Vasodilator-stimulated phosphoprotein，VASP)檢測(cè) VASP是血小板細(xì)胞內(nèi)的蛋白質(zhì)，當(dāng)ADP與P2Y12受體結(jié)合，激活P2Y12受體，使cAMP減少，VASP脫磷酸化，激活血小板聚集；相反，氯吡格雷阻斷ADP與P2Y12受體結(jié)合，使cAMP增加，VASP磷酸化，抑制血小板聚集。目前VASP試驗(yàn)的常用檢測(cè)方法有ELISA法和流式細(xì)胞技術(shù)。流式細(xì)胞技術(shù)通過測(cè)量單克隆抗體來定量磷酸化的VASP，其檢測(cè)結(jié)果以血小板反應(yīng)指數(shù)(Platelet reactivity index，PRI)表示。該試驗(yàn)?zāi)軌蚋叨忍禺愋苑从陈冗粮窭缀推绽窭椎萈2Y12受體拮抗劑抑制血小板聚集效應(yīng)，有效抑制時(shí)PRI值處于低水平；如抑制效果差，PRI則處于高水平[13-14]。流式細(xì)胞技術(shù)對(duì)檢測(cè)時(shí)間的要求不高，要求檢測(cè)48h內(nèi)的血標(biāo)本，檢測(cè)結(jié)果與LTA法呈很好的相關(guān)性。VASP檢測(cè)的優(yōu)勢(shì)在于P2Y12信號(hào)通路的特異性和檢測(cè)結(jié)果的穩(wěn)定性，該試驗(yàn)不足是檢測(cè)過程相對(duì)復(fù)雜和成本較高[15]。

2.5 血栓彈力圖 血栓彈力圖(Thrombelastogram，TEG)是動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)血液在體外凝固的全過程，從血凝塊開始生成到纖維蛋白溶解，對(duì)凝血因子、纖維蛋白原、血小板聚集功能以及纖維蛋白溶解等方面進(jìn)行凝血全貌的檢測(cè)和評(píng)估。血栓彈力圖分析儀主要由一次性反應(yīng)杯、金屬探針及其上的扭力絲組成，一旦血栓形成，反應(yīng)杯中的金屬探針受到樣本中產(chǎn)生切變力的作用，左右旋轉(zhuǎn)。通過金屬探針和扭力絲將凝血過程中凝血塊機(jī)械阻抗的變化記錄到電腦上，并與時(shí)間相對(duì)應(yīng)，繪制成圖像，即為血栓彈力圖[11，16]。通過加入不同的血小板誘導(dǎo)劑(花生四烯酸或ADP)，可以繪制出TEG血小板圖，用于評(píng)估抗血小板藥物療效、指導(dǎo)個(gè)體化抗血小板治療，預(yù)測(cè)患者的出血和血栓風(fēng)險(xiǎn)[17]。TEG檢測(cè)方法的不足之處是價(jià)格昂貴，不能作為常規(guī)手段，往往作為L(zhǎng)TA結(jié)果無法解釋或無法獲得時(shí)的替代手段[15]。

2.6 PFA-100、PFA-200血小板功能分析儀 PFA-100、PFA-200血小板功能分析儀是在體外運(yùn)用血流動(dòng)力學(xué)原理，模擬體內(nèi)血管損傷時(shí)，高剪切應(yīng)力下血小板的黏附與聚集能力[18]。檢測(cè)試劑盒通常由毛細(xì)管、樣本池和帶有中央孔的生物活性膜組成。枸櫞酸鈉抗凝的全血注入試劑盒的貯存器中，在負(fù)壓作用下，從儲(chǔ)存器中的全血被抽吸，通過毛細(xì)管和和生物膜的中央孔，在高剪切應(yīng)力下，使血小板充分暴露，黏附和聚集到膠原包被的生物活性膜上。隨后，血小板接觸到激動(dòng)劑(如花生四烯酸或ADP)，高剪切力和激動(dòng)劑共同作用，使血小板凝結(jié)成塊，在孔膜中形成血小板血栓，最終堵塞了生物膜上的所有孔道。從全血被負(fù)壓抽吸到生物活性膜的孔被凝塊全部堵塞而血流停止的這段時(shí)間，被定義為封閉時(shí)間(CT)[19-20]。PFA-100血小板功能分析儀是模仿機(jī)體一期止血而設(shè)計(jì)的檢測(cè)裝置，對(duì)初期止血功能缺陷的血小板數(shù)量和功能異常、血管性血友病(von Willebrand disease，vWD)等有較高的檢測(cè)價(jià)值[17，21]。PFA-200血小板功能分析儀是PFA-100的升級(jí)版，可以監(jiān)測(cè)抗血小板藥物的療效。PFA-100和PFA-200血小板功能分析儀的優(yōu)點(diǎn)是可以在床旁進(jìn)行檢測(cè)，操作簡(jiǎn)單、耗時(shí)短、檢測(cè)樣本量少，標(biāo)本前期處理簡(jiǎn)單。缺點(diǎn)是缺乏公認(rèn)的參考范圍和療效評(píng)估標(biāo)準(zhǔn)[22]，在臨床應(yīng)用中仍處于摸索階段。

3 小結(jié)

大量循證醫(yī)學(xué)證明，抗血小板治療是預(yù)防和治療血栓性疾病的最重要手段，然而在治療過程中，不同的個(gè)體存差異，往往導(dǎo)致抗血小板治療不足或過度的現(xiàn)象，引發(fā)血栓或出血的不良事件發(fā)生。因此，對(duì)血小板功能監(jiān)測(cè)顯得尤為必要。血小板功能的檢測(cè)能夠?yàn)榕R床個(gè)體化抗血小板治療提供一定的數(shù)據(jù)支持，為預(yù)防出血和血栓等不良事件的發(fā)生提供一定的幫助。但是，由于血小板在體內(nèi)參與凝血反應(yīng)是一個(gè)復(fù)雜的過程，受多種物質(zhì)、多種因素的影響，而且體外模擬試驗(yàn)與體內(nèi)環(huán)境存在很大的差異，不能反映體內(nèi)凝血過程的復(fù)雜情況。況且血小板功能檢測(cè)方法多種多樣，試驗(yàn)原理各不相同，檢測(cè)結(jié)果的重復(fù)性和可比性差，而且缺乏公認(rèn)的權(quán)威的抗血小板治療診斷標(biāo)準(zhǔn)，臨床醫(yī)生在選擇抗血小板治療監(jiān)測(cè)方法和療效評(píng)估上存在著很大的困惑。相信隨著血小板功能實(shí)驗(yàn)研究的深入和新技術(shù)的不斷研發(fā)、臨床資料與經(jīng)驗(yàn)的不斷積累，未來抗血小板藥物的監(jiān)測(cè)一定能夠?qū)崿F(xiàn)規(guī)范化和標(biāo)準(zhǔn)化,實(shí)現(xiàn)個(gè)體化抗血小板治療，保證治療的安全性和有效性。