王興勝 林琪 曹龍 朱秋萍

摘? ?要：為豐富楊樹栽培品種的遺傳信息，收集了中國(guó)北方地區(qū)廣泛栽培的33個(gè)楊樹品種，進(jìn)行指紋圖譜構(gòu)建、系譜關(guān)系鑒定和遺傳多樣性分析。利用SSR技術(shù)對(duì)33份楊樹種質(zhì)進(jìn)行指紋圖譜構(gòu)建和系譜關(guān)系鑒定。從楊樹SSR數(shù)據(jù)庫(kù)中選取22對(duì)SSR引物，挑選出4 對(duì)擴(kuò)增條帶清晰、具有多態(tài)性且重復(fù)性好的引物，對(duì)33份楊樹種質(zhì)進(jìn)行篩選與鑒定，并構(gòu)建指紋圖譜，利用NTEDIT.LINK進(jìn)行聚類分析，其聚類結(jié)果與傳統(tǒng)分類學(xué)上的結(jié)果一致。研究表明，SSR 分子標(biāo)記技術(shù)在楊樹品種鑒定中具有一定的可靠性，同時(shí)為開展楊樹資源遺傳親緣關(guān)系分析和雜種優(yōu)勢(shì)等開發(fā)利用提供了重要的參考。

關(guān)鍵詞：楊樹品種;DNA指紋圖譜;特征

文章編號(hào)： 1005-2690（2020）10-0006-03? ? ? ?中圖分類號(hào)： S792.11? ? ? ?文獻(xiàn)標(biāo)志碼： B

楊樹是我國(guó)重要的綠化樹種和能源樹種之一。楊樹為落葉喬木，分布廣泛且種類多種多樣。近年來(lái)，由于國(guó)家對(duì)林木繁育種業(yè)的高度重視，育種技術(shù)和楊樹速生優(yōu)良新品種的選育速度也逐漸加快。但是，由于楊樹馴化歷史悠久，其生物學(xué)性狀受生長(zhǎng)發(fā)育階段和環(huán)境因素的影響，僅通過(guò)形態(tài)學(xué)不利于新品種權(quán)的保護(hù)，并且作為品種區(qū)分標(biāo)準(zhǔn)實(shí)為困難。因此，采取植物的幼嫩部位提取DNA[1-2]，利用SSR分子標(biāo)記技術(shù)進(jìn)行遺傳多樣性分析并構(gòu)建指紋圖譜，以此保證品種的特異性，為后期品種鑒定及良種審定提供有效信息。

1? ?材料和方法

1.1? ?材料

分布在新疆不同生態(tài)區(qū)域內(nèi)的33個(gè)楊樹品種。

1.2? ?DNA提取

提取DNA采用改良CTAB法[3]。具體操作步驟如下。

（1）取幼嫩真葉材料一小片，用蒸餾水沖洗干凈，置1.5 mL的離心管中，加液氮，快速冷卻。

（2）將材料快速研磨成粉末，然后加入 65 ℃預(yù)熱的CTAB提取緩沖液700 μL。

（3）放入 65 ℃水浴30～40 min，每10 min 輕輕地振蕩一次。

（4）加入等體積的氯仿/異戊醇（24∶1）700 μL，混勻5 min，12 000 rpm離心5 min。

（5）取上清液，轉(zhuǎn)入另一個(gè)1.5 mL新離心管中，加入預(yù)冷的無(wú)水乙醇800 μL， 放置于4 ℃靜置10 min左右，讓DNA充分沉淀。

（6）清除無(wú)水乙醇，加入預(yù)冷70%乙醇漂洗兩次。

（7）室溫晾干，輕輕彈離心管，至沒有水滴即可。

（8）將DNA溶于50 μL或100 μL的 0.1倍TE中，加入RNase（10 mg/mL）1 μL于37 ℃消化15～30 min。

（9）于-20 ℃或4 ℃條件下保存。

1.3? ?SSR標(biāo)記引物序列的獲得及合成

通過(guò)引物篩選，將多態(tài)性豐富且穩(wěn)定性好的SSR引物用于楊樹品種的鑒定及遺傳多樣性分析。具體篩選的引物組合見表1。

1.4? ?SSR反應(yīng)體系

1.4.1? ?SSR標(biāo)記技術(shù)楊樹擴(kuò)增反應(yīng)試劑反應(yīng)體系

1.0 μL 330 ng/μL DNA、2.33 μL 10×Buffer（含Mg2+）、1.6 μL dNTPs（2.33 mM each）、0.33 μL 10 pM Forward primer、0.33 μL 10 pM Reverse primer、0.233μL 33 U/μL Taq polymerase、18.633 μLddH20，將上述反應(yīng)物混勻后于PCR儀（PTC-200TM Peltiter thermal cycler）上進(jìn)行擴(kuò)增。

1.4.2? ?反應(yīng)程序

94 ℃ 5 min、94 ℃ 30 s、54 ℃ 45 s、72 ℃ 1 min，以上循環(huán)35次后，72 ℃ 10 min，最后放置10 ℃保存。

1.5? ?非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳

6%聚丙烯酰胺凝膠配方：6 mL聚丙烯酰胺膠母液，2 mL 10×TBE超純水10 mL，200 μL10%過(guò)硫酸胺，20 μL TEMED。

1.6? ?銀染

通過(guò)固定、染色、顯色、漂洗一次，自然晾干后掃描。

1.7? ?讀帶記錄并分析

取出干燥后的凝膠，對(duì)其形成的DNA多態(tài)性圖譜進(jìn)行讀帶，同一位置沒有條帶的記“0”，清晰的記“1”，生成“1”和“0”組成的原始矩陣。利用NTSYS-2.10e 軟件求Dice相似系數(shù)矩陣，用UPGMA方法進(jìn)行聚類分析，最后生成聚類圖通過(guò)Tree plot模塊。

2? ?結(jié)果與分析

2.1? ?品種鑒定

利用22對(duì)SSR 引物對(duì)33份楊樹品種進(jìn)行鑒定，挑選出了4對(duì)多態(tài)性較好的引物進(jìn)行篩選和鑒定。結(jié)果表明：引物PMGC2839、PMGC2885、PMGC571和ORPM206分別擴(kuò)增出（除15號(hào)和21號(hào)品種之外的）31個(gè)品種的特異性條帶。電泳結(jié)果見圖1，指紋圖譜見圖2。

2.2? ?遺傳多樣性分析

采用4對(duì)SSR引物對(duì)33份楊樹品種進(jìn)行聚類分析，結(jié)果見圖3。

3? ?結(jié)論

通過(guò)SSR分子標(biāo)記技術(shù)對(duì)33份楊樹種質(zhì)建立指紋圖譜和鑒定系譜關(guān)系，結(jié)果表明：4種引物，包括PMGC2839、PMGC2885、PMGC571和ORPM206能夠較好地區(qū)分33份楊樹品種（除111和171號(hào)品種）。這些 SSR標(biāo)記所構(gòu)建的指紋圖譜，可用于楊樹品種的區(qū)分和鑒定。

參考文獻(xiàn)：

[ 1 ] 李榮旗，張開春，尹淑萍，等.從蘋果、山楂等果樹韌皮部快速微量提取總DNA用于RAPD分析（簡(jiǎn)報(bào)）[J].農(nóng)業(yè)生物技術(shù)學(xué)報(bào)，1997，5（1）：98-99.

[ 2 ] 王孝安，肖婭萍，胡雅琴.太白紅杉3種不同材料總DNA的提取[J].西北植物學(xué)報(bào)，2003，23（4）：641-644.

[ 3 ] 黃烈健，蘇曉華，張香華，等.與楊樹木材密度、纖維性狀相關(guān)的SSR分子標(biāo)記[J].遺傳學(xué)報(bào)，2004，31（3）：299-304.