吳麗君 王僮

摘 要：目的：采用核磁共振（1H-NMR）代謝組學(xué)技術(shù)探討疲勞運(yùn)動(dòng)及蝦青素補(bǔ)充對(duì)疲勞運(yùn)動(dòng)大鼠血清代謝的影響。方法：將36只雄性SD大鼠隨機(jī)分為3組：對(duì)照組（C）、運(yùn)動(dòng)組（E）、運(yùn)動(dòng)加給藥組（EM）。EM組大鼠按每天6.6 mg/kg體重連續(xù)進(jìn)行蝦青素灌胃21天，E組與EM組大鼠進(jìn)行遞增負(fù)荷至疲勞的游泳運(yùn)動(dòng)。運(yùn)動(dòng)后即刻對(duì)大鼠進(jìn)行股動(dòng)脈取血并離心保存，對(duì)血樣進(jìn)行1H-NMR數(shù)據(jù)采集與處理后找出差異代謝物，并使用MetPA數(shù)據(jù)庫(kù)分析代謝通路，結(jié)合KEGG數(shù)據(jù)庫(kù)篩選出潛在標(biāo)志物。結(jié)果：1）E組相比C組大鼠血清差異代謝物共15種，其中甘油、檸檬酸、氧化三甲胺（P<0.05）、乳酸、乙酰乙酸（P<0.01）濃度顯著升高，葡萄糖、脂質(zhì)、亮氨酸（P<0.05）、肌酸、異亮氨酸、丙氨酸、纈氨酸、α-酮戊二酸、琥珀酸、甜菜堿（P<001）濃度顯著降低;15種代謝物共參與20條代謝通路，其中纈氨酸、亮氨酸與異亮氨酸的生物合成，酮體的合成與降解，丁酸代謝，乙醛酸與二羧酸代謝，甘油脂代謝，檸檬酸循環(huán)6條通路為疲勞干預(yù)潛在的靶標(biāo)代謝通路，潛在代謝標(biāo)志物為纈氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、乙酰乙酸、琥珀酸、甘油、α-酮戊二酸與檸檬酸;2）EM組相比E組大鼠血清差異代謝物共7種，其中葡萄糖（P<0.05）、亮氨酸、異亮氨酸、纈氨酸（P<0.01）濃度顯著升高，脂質(zhì)（P<0.05）、乳酸、甘油（P<0.01）濃度顯著降低;7種代謝物共參與9條代謝通路，其中包括纈氨酸、亮氨酸與異亮氨酸的生物合成，甘油脂代謝2條通路為蝦青素干預(yù)潛在的靶標(biāo)代謝通路，潛在標(biāo)志物為纈氨酸、亮氨酸、異亮氨酸與甘油。結(jié)論：1）疲勞運(yùn)動(dòng)可通過(guò)影響纈氨酸、亮氨酸與異亮氨酸的生物合成，酮體的合成與降解，丁酸代謝，三羧酸循環(huán)，乙醛酸與二羧酸代謝及甘油脂代謝等6條代謝通路對(duì)大鼠機(jī)體產(chǎn)生不利影響;2）疲勞運(yùn)動(dòng)前補(bǔ)充蝦青素可通過(guò)改變其中的纈氨酸、亮氨酸與異亮氨酸的生物合成及甘油脂代謝通路達(dá)到促進(jìn)機(jī)體脂質(zhì)代謝、節(jié)約BCAA利用、延緩運(yùn)動(dòng)疲勞的作用。

關(guān)鍵詞：疲勞運(yùn)動(dòng);蝦青素;血清;代謝組學(xué)

眾所周知，運(yùn)動(dòng)疲勞運(yùn)動(dòng)會(huì)損害運(yùn)動(dòng)員身心健康，影響其運(yùn)動(dòng)成績(jī)。國(guó)內(nèi)外學(xué)者在延緩運(yùn)動(dòng)疲勞的營(yíng)養(yǎng)補(bǔ)劑方面做了大量研究，包括牛磺酸[1]、參芪口服液[2]、維生素D[3]、蝦青素、多酚[4]等。蝦青素（Astaxanthin，ASTA）是一種強(qiáng)自由基清除劑，廣泛存在于蝦、蟹、魚(yú)、藻類以及鳥(niǎo)類羽毛中，具有超強(qiáng)抗氧化活性，可降低機(jī)體自由基水平，具有抗腫瘤、預(yù)防心腦血管疾病、保護(hù)神經(jīng)、保護(hù)肝腎臟等多種作用。1987年蝦青素被美國(guó)食品和藥品監(jiān)督管理局批準(zhǔn)用于水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)的飼料添加劑，并于1999年被批準(zhǔn)用于膳食補(bǔ)充劑[5]。在運(yùn)動(dòng)人體科學(xué)領(lǐng)域，蝦青素具有改善機(jī)體物質(zhì)代謝、增強(qiáng)免疫力、抵抗肌肉炎癥、提高身體耐力、緩解運(yùn)動(dòng)疲勞等功效[6]，是近年來(lái)的研究熱點(diǎn)之一。

代謝組學(xué)（metabonomics）是20世紀(jì)90年代末期繼基因組學(xué)、蛋白質(zhì)組學(xué)之后，迅速發(fā)展起來(lái)的以高通量檢測(cè)和數(shù)據(jù)處理為手段、以信息建模與系統(tǒng)整合為目標(biāo)、以群組指標(biāo)分析為基礎(chǔ)的一門生物學(xué)學(xué)科[7]。它主要以生物體液為研究對(duì)象，還可采用完整組織樣品進(jìn)行研究，可以在不預(yù)先設(shè)定將要檢測(cè)的具體指標(biāo)“全景式”掃描所有代謝物，從而反映藥物、環(huán)境污染、運(yùn)動(dòng)等外界因素對(duì)機(jī)體代謝的影響[8]，已廣泛應(yīng)用于藥物研發(fā)、疾病研究、食品檢測(cè)及運(yùn)動(dòng)或生活方式引起的干擾等領(lǐng)域[9]。基于疲勞運(yùn)動(dòng)對(duì)機(jī)體產(chǎn)生較大擾動(dòng)，本研究采用1H-NMR代謝組學(xué)技術(shù)研究疲勞運(yùn)動(dòng)及蝦青素補(bǔ)充對(duì)疲勞運(yùn)動(dòng)大鼠血清代謝的影響，試圖從代謝角度闡明疲勞運(yùn)動(dòng)及蝦青素補(bǔ)充對(duì)機(jī)體機(jī)能產(chǎn)生影響的作用途徑與機(jī)理。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)對(duì)象及分組

SPF級(jí)雄性SD健康大鼠36只，體重160～180 g，由北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司提供。大鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)4天后隨機(jī)分為3組，每組12只，分別為對(duì)照組（C）、運(yùn)動(dòng)組（E）、運(yùn)動(dòng)加給藥組（EM），室溫20℃～25℃，相對(duì)濕度為（50±10）%。

1.2 實(shí)驗(yàn)儀器與試劑

1.2.1 實(shí)驗(yàn)儀器

Brucker 600-MHz AVACNCEⅢ NMR譜儀，TGL-16高速臺(tái)式冷凍離心機(jī)（湖南長(zhǎng)沙），XW-80A旋渦混合器（上海），KQ5200E型超聲波清洗器等。

1.2.2 實(shí)驗(yàn)試劑

D2O（Norell，USA），PBS（Phosphate buffer saline）緩沖液，甲醇（分析純≥99.5%），蝦青素（湖北武漢雅士達(dá)生物科技有限公司生產(chǎn)）。

1.3 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)與運(yùn)動(dòng)方案

實(shí)驗(yàn)方案參照Kalantari[10]與侯莉娟[11]的大鼠游泳方案。運(yùn)動(dòng)大鼠適應(yīng)性游泳3天，水溫（30±2）℃，水深40 cm。第一天游泳40 mim，第二天50 mim，第三天60 mim。適應(yīng)性游泳結(jié)束后，正式開(kāi)始游泳與灌藥。EM組大鼠于上午8點(diǎn)進(jìn)行蝦青素灌胃，其余大鼠同時(shí)間灌服同劑量大豆油，連續(xù)給藥21天。運(yùn)動(dòng)分為三個(gè)階段：1）下午14：30游泳150 min，持續(xù)7天;2）下午14：30游泳180 min，持續(xù)7天;3）上午8：00、下午14：30游泳各180 min，持續(xù)7天。最后一周大鼠每次運(yùn)動(dòng)至力竭，最終積累導(dǎo)致疲勞。力竭判斷標(biāo)準(zhǔn)：大鼠持續(xù)下沉10 s不露出水面[12]。疲勞判斷標(biāo)準(zhǔn)：大鼠出現(xiàn)神情怠倦、皮毛蓬亂枯槁、脫毛，運(yùn)動(dòng)能力下降，對(duì)外界刺激反應(yīng)遲鈍等征狀[11]。

1.4 樣本采集與處理

1.4.1 樣本采集

最后一天游泳結(jié)束后即刻對(duì)3組大鼠進(jìn)行股動(dòng)脈取血，以6 000 rpm離心30 min后采集血清，保存于-80℃冰箱備用。

1.4.2 1H-NMR樣本處理

首先將血清樣本解凍處理，后用移液槍吸取450 ul血清放于EP管并加入350 ul D2O，渦旋30秒后以1300 rpm 4℃離心20 min，取550 ul上清液于5 mm核磁管中通過(guò)CPMG（Carr-Purcell- Meiboom-Gill）脈沖序列進(jìn)行1H-NMR檢測(cè)，自旋弛豫延遲320 ms，譜寬8KHz，自由感應(yīng)衰減64K數(shù)據(jù)點(diǎn)，進(jìn)行64次掃描。隨后用MestReNova軟件（Mesterlab Research， Santiago de compostella， Spain）處理樣本核磁信號(hào)圖譜，首先用肌酸化學(xué)位移3.04作為參考定標(biāo)，調(diào)整核磁譜圖偏差位移，手動(dòng)切除δ4.60-5.20水峰信號(hào)，用0.01 ppm作為分段單位，對(duì)圖譜0.6 ppm-9.0 ppm段分段積分與歸一化處理，保存數(shù)據(jù)到excel中。使用SIMCA-P13.0分析積分值，最終找出P0.05、VIP1的差異代謝物。

1.5 數(shù)據(jù)分析

采用SPSS17.0軟件對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析，采用t檢驗(yàn)與雙因素方差分析檢驗(yàn)樣本顯著性，從統(tǒng)計(jì)學(xué)角度分析補(bǔ)充蝦青素及疲勞運(yùn)動(dòng)對(duì)機(jī)體影響。最后將差異代謝物代入MetaboAnalyst 4.0數(shù)據(jù)庫(kù)（https：//www.metaboanalyst.ca）中分析可能的代謝通路變化，結(jié)合KEGG數(shù)據(jù)庫(kù)尋找潛在標(biāo)志物。

2 結(jié)果與分析

2.1 疲勞運(yùn)動(dòng)前后大鼠血清差異代謝物

由圖1可見(jiàn)，E組與C組樣本PLS-DA模型驗(yàn)證成立，score圖顯示兩組樣本間區(qū)分明顯，組內(nèi)樣本較集中，表明兩組樣本間具有顯著差異性，S-Plots圖上有些點(diǎn)明顯與其他多數(shù)點(diǎn)分離且離原點(diǎn)較遠(yuǎn)，為顯著性差異代謝物。由表1可見(jiàn)，疲勞運(yùn)動(dòng)后大鼠血清共15有種差異代謝物，E組比C組血清甘油、檸檬酸、氧化三甲胺（P<0.05）、乳酸、乙酰乙酸（P<0.01）濃度顯著升高，葡萄糖、脂質(zhì)、亮氨酸（P<0.05）、肌酸、異亮氨酸、丙氨酸、纈氨酸、琥珀酸、α-酮戊二酸、甜菜堿（P<0.01）濃度顯著降低。

由圖2可見(jiàn)，EM組與E組樣本PLS-DA模型驗(yàn)證成立，score圖顯示兩組間樣本差異明顯，組內(nèi)樣本較集中，表明兩組間具有顯著差異性，S-Plots圖上有些點(diǎn)明顯與其他多數(shù)點(diǎn)分離且離原點(diǎn)較遠(yuǎn)，為顯著性差異代謝物。由表2可知，蝦青素干預(yù)后兩組大鼠血清共有7種差異代謝物，EM組相比E組血清葡萄糖（P<0.05）、亮氨酸、異亮氨酸、纈氨酸（P<0.01）濃度顯著升高，脂質(zhì)（P<0.05）、乳酸、甘油（P<0.01）濃度顯著降低。

2.2 補(bǔ)充蝦青素前后疲勞運(yùn)動(dòng)大鼠血清差異代謝物

由圖2可見(jiàn)，EM組與E組樣本PLS-DA模型驗(yàn)證成立，score圖顯示兩組間樣本差異明顯，組內(nèi)樣本較集中，表明兩組間具有顯著差異性，S-Plots圖上有些點(diǎn)明顯與其他多數(shù)點(diǎn)分離且離原點(diǎn)較遠(yuǎn)，為顯著性差異代謝物。由表2可知，蝦青素干預(yù)后兩組大鼠血清共有7種差異代謝物，EM組相比E組血清葡萄糖（P<0.05）、亮氨酸、異亮氨酸、纈氨酸（P<0.01）濃度顯著升高，脂質(zhì)（P<0.05）、乳酸、甘油（P<0.01）濃度顯著降低。

2.3 代謝通路分析

將疲勞運(yùn)動(dòng)后與蝦青素干預(yù)運(yùn)動(dòng)后的差異代謝物分別輸入MetPA數(shù)據(jù)庫(kù)，對(duì)其所涉及的代謝通路進(jìn)行分析，可以看出大鼠疲勞運(yùn)動(dòng)前后涉及的通路共20條（表3），本研究以影響值>0.1為閾值，對(duì)這些代謝通路進(jìn)行篩選，高于此值為疲勞運(yùn)動(dòng)影響血清代謝的潛在靶標(biāo)通路（圖3A），代謝通路影響值大于0.1的靶標(biāo)代謝路中代謝通路圓點(diǎn)越大表示對(duì)代謝組學(xué)的重要性越大[13]，共篩選出靶標(biāo)通路6條，分別是：纈氨酸、亮氨酸與異亮氨酸的生物合成，丁酸代謝，酮體的合成與降解，檸檬酸循環(huán)，乙醛酸與二羧酸代謝及甘油脂代謝通路。蝦青素補(bǔ)充前后涉及的代謝通路共9條（表4），篩選出的靶標(biāo)通路共2條（圖3B），分別是：纈氨酸、亮氨酸與異亮氨酸的生物合成，甘油脂代謝通路。

3 討論

本研究采用1H-NMR代謝組學(xué)技術(shù)、MetPA代謝通路分析工具，探討疲勞運(yùn)動(dòng)及蝦青素補(bǔ)充對(duì)疲勞運(yùn)動(dòng)大鼠血清小分子代謝物及代謝通路的影響。

3.1 疲勞運(yùn)動(dòng)對(duì)大鼠血清代謝的影響

E組與C組大鼠血清差異代謝物共15種，分別參與20條代謝通路，其中纈氨酸、亮氨酸與異亮氨酸的生物合成，丁酸代謝，酮體的合成與降解，檸檬酸循環(huán)，乙醛酸與二羧酸代謝及甘油脂代謝6條通路為疲勞運(yùn)動(dòng)干預(yù)主要涉及的靶標(biāo)通路。參與以上6條通路的代謝物有纈氨酸（c00183）、亮氨酸（c00123）、異亮氨酸（c00407）、乙酰乙酸（c00164）、α-酮戊二酸（c00026）、琥珀酸（c00042）、檸檬酸（c00158）、甘油（c00116）。本研究將這8種代謝物視為影響疲勞代謝的潛在標(biāo)志物。

纈氨酸（c00183）、亮氨酸（c00123）和異亮氨酸（c00407）參與纈氨酸、亮氨酸與異亮氨酸的生物合成通路（圖4a）。這3種氨基酸均為人體必需氨基酸，統(tǒng)稱支鏈氨基酸（BCAA）。BCAA具有維持血漿游離氨基酸濃度，在長(zhǎng)時(shí)間耐力運(yùn)動(dòng)中參與肌肉氧化供能，調(diào)節(jié)肌肉蛋白質(zhì)合成代謝[14]，參與糖代謝，促進(jìn)乳酸糖異生等作用[15]。研究表明，補(bǔ)充BCAA還可抵消長(zhǎng)時(shí)間耐力運(yùn)動(dòng)導(dǎo)致的肌肉疲勞，減少肌細(xì)胞內(nèi)蛋白分解入血[16]，削弱延遲性肌肉酸痛，減少運(yùn)動(dòng)性肌肉損傷[17-18]，增強(qiáng)運(yùn)動(dòng)能力[19]，促進(jìn)運(yùn)動(dòng)員疲勞恢復(fù)[20]。Karl等基于代謝組學(xué)的研究表明，51公里/4天的越野滑雪運(yùn)動(dòng)后，士兵血漿中BCAA分解代謝增加[21]。Lewis等的研究也表明馬拉松運(yùn)動(dòng)后受試者血漿中纈氨酸濃度下降[22]。疲勞運(yùn)動(dòng)可降低BCAA轉(zhuǎn)氨酶或支鏈SymbolaA@-酮酸脫氫酶的活化從而導(dǎo)致血漿中BCAA水平的變化[23]。BCAA的轉(zhuǎn)氨作用主要發(fā)生在骨骼肌中，其轉(zhuǎn)氨作用的破壞會(huì)導(dǎo)致蘋果酸/天冬氨酸穿梭受損，從而減少丙氨酸和谷氨酰胺的形成，并增加乳酸與丙酮酸之比[24]，而谷氨酰胺減少是過(guò)度訓(xùn)練的標(biāo)志之一[25]。BCAA還可與抑制性神經(jīng)遞質(zhì)5-羥色胺（5-HT）前體-色氨酸競(jìng)爭(zhēng)同一載體進(jìn)入血腦屏障，血清BCAA濃度升高可抑制色氨酸入腦從而減少5-HT的生成與積聚，進(jìn)而達(dá)到延緩疲勞作用，反之亦然。本研究中疲勞運(yùn)動(dòng)大鼠血清異亮氨酸、亮氨酸與纈氨酸濃度均下降，表明疲勞運(yùn)動(dòng)可加快大鼠血清BCAA分解，或干擾其轉(zhuǎn)氨作用，致使血清BCAA濃度降低，相應(yīng)地增加了5-HT在腦中積聚，從而導(dǎo)致疲勞發(fā)生。

差異代謝物乙酰乙酸（c00164）、α-酮戊二酸（c00026）與琥珀酸（c00042）共同參與丁酸代謝通路（圖4b）。丁酸是通過(guò)腸道微生物群發(fā)酵膳食纖維產(chǎn)生的短鏈脂肪酸之一，可由碳水化合物經(jīng)α-酮戊二酸與琥珀酸生成。丁酸鹽通過(guò)補(bǔ)充腸道防御屏障的各種成分、抑制炎癥細(xì)胞因子形成及減少氧化應(yīng)激，對(duì)結(jié)腸炎和結(jié)腸癌產(chǎn)生強(qiáng)烈抑制作用[26]，并對(duì)大鼠脂肪細(xì)胞的儲(chǔ)存和動(dòng)員以及葡萄糖攝取有積極影響[27]。研究報(bào)道，低氧誘導(dǎo)因子脯氨酰羥化酶（PHD3）可通過(guò)與β2腎上腺素受體（ADRβ2）結(jié)合使其羥基化并降解，以上調(diào)肌肉中肌肉環(huán)狀指基因1（MuRF1）和肌肉萎縮F基因（MAFbx， atrogin-1）的表達(dá)導(dǎo)致肌肉萎縮，而α-酮戊二酸可特異性下調(diào)PHD3的表達(dá)以抑制肌肉萎縮，從而改善大鼠肌肉的運(yùn)動(dòng)耐力[28]。本研究中SymbolaA@-酮戊二酸濃度下降，可能導(dǎo)致大鼠肌肉耐力下降從而發(fā)生疲勞。乙酰乙酸是酮體的一種，是脂肪酸不完全氧化的產(chǎn)物，參與酮體的合成與降解通路（圖4c），此通路中β-羥基丁酸轉(zhuǎn)化為乙酰乙酸，乙酰乙酸轉(zhuǎn)化為乙酰CoA被氧化利用。在長(zhǎng)時(shí)間運(yùn)動(dòng)中，供能底物逐漸由葡萄糖轉(zhuǎn)變?yōu)楦视腿ズ图√窃?，酮體合成增加[29]。Connor等研究表明，耐力自行車運(yùn)動(dòng)員尿液乙酰乙酸濃度顯著增加，是由于長(zhǎng)時(shí)間耐力運(yùn)動(dòng)使機(jī)體糖原大量消耗，脂肪供能加強(qiáng)，而氧供不足使血清中酮體含量明顯升高[30]。Nozaki的研究也證實(shí)了疲勞運(yùn)動(dòng)后受試者血清酮體濃度增加[23]，與本研究中疲勞大鼠血液中乙酰乙酸顯著升高結(jié)果一致，表明本研究中運(yùn)動(dòng)供能方式已轉(zhuǎn)變?yōu)榇罅縿?dòng)用脂肪供能，且機(jī)體出現(xiàn)供氧不足，從而導(dǎo)致疲勞發(fā)生。

差異代謝物檸檬酸（c00158）、α-酮戊二酸（c00026）、琥珀酸（c00042）共同參與三羧酸循環(huán)（TCA循環(huán)）通路（圖4d）。TCA循環(huán)是機(jī)體氧化供能的最有效方式，TCA循環(huán)約產(chǎn)生機(jī)體總能量的2/3，是糖、脂質(zhì)、蛋白質(zhì)三大物質(zhì)代謝的聯(lián)絡(luò)與轉(zhuǎn)化樞紐，在糖異生、脫氨基與轉(zhuǎn)氨基和脂肪生成中起重要作用[31]。本研究中代謝差異物檸檬酸（CA）作為乙酰-CoA進(jìn)入TCA循環(huán)的起始物質(zhì)，其濃度大小反映著TCA循環(huán)代謝水平的高低。TCA循環(huán)中氧化應(yīng)激、質(zhì)子泄漏、離子易位和檸檬酸裂解酶活性改變等因素均可使檸檬酸合成過(guò)程及氧化磷酸化出現(xiàn)偏離[32]。Zhou等研究表明力竭性游泳運(yùn)動(dòng)可顯著提升大鼠血清中檸檬酸濃度[33]，與本實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致。Nozaki的研究也表明疲勞運(yùn)動(dòng)后受試者血清CA濃度升高，其機(jī)制可能為疲勞運(yùn)動(dòng)造成骨骼肌細(xì)胞受損、能量代謝紊亂[23]。CA還參與乙醛酸與二羧酸代謝通路（圖4e），該代謝是在乙醛酸體中進(jìn)行的與脂肪轉(zhuǎn)化為糖密切相關(guān)的代謝過(guò)程，可通過(guò)影響三羧酸循環(huán)關(guān)鍵酶活性導(dǎo)致三羧酸循環(huán)中各種反應(yīng)物和產(chǎn)物水平異常[34]。本研究中E組大鼠血清CA濃度升高、α-酮戊二酸與琥珀酸濃度降低，表明運(yùn)動(dòng)導(dǎo)致的TCA、乙醛酸與二羧酸代謝紊亂是造成機(jī)體疲勞的原因之一。

甘油（c00116）參與甘油脂代謝通路（圖4f）。甘油脂代謝是甘油三酯（TG）水解為游離脂肪酸（FFA）和甘油后被機(jī)體利用的過(guò)程。運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練可能通過(guò)上調(diào)葡糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白4和下調(diào)肌肉素的表達(dá)來(lái)改善脂質(zhì)代謝，促進(jìn)甘油三酯分解[35]。其中甘油轉(zhuǎn)變?yōu)?-磷酸甘油后被組織利用，而FFA不溶于水，必須與血漿白蛋白結(jié)合進(jìn)行運(yùn)輸，它與血漿中5-HT前體色氨酸競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合蛋白載體，故FFA濃度升高會(huì)相應(yīng)引起游離色氨酸增多，間接導(dǎo)致腦內(nèi)5-HT聚積，為中樞性疲勞假說(shuō)提供支持[36]。Lund研究表明，12周的綜合耐力與力量訓(xùn)練促進(jìn)了人運(yùn)動(dòng)后活檢組織中肌管脂代謝增強(qiáng)[37]。Lyudinina的研究也證實(shí)越野滑雪運(yùn)動(dòng)時(shí)，運(yùn)動(dòng)員甘油脂代謝增強(qiáng)[38]。有報(bào)道稱，馬拉松運(yùn)動(dòng)時(shí)運(yùn)動(dòng)員出現(xiàn)廣泛的脂肪分解，血漿甘油濃度顯著升高，并與其他代謝物共同調(diào)節(jié)葡萄糖和脂質(zhì)代謝調(diào)節(jié)因子Nur77的表達(dá)[22]。本研究的運(yùn)動(dòng)方式為疲勞運(yùn)動(dòng)，運(yùn)動(dòng)后血清脂質(zhì)濃度降低，其分解物甘油濃度升高，表明疲勞運(yùn)動(dòng)脂肪動(dòng)員加強(qiáng)，脂肪酸供能增多，與Stander[39]對(duì)運(yùn)動(dòng)員馬拉松運(yùn)動(dòng)后血清代謝組中甘油濃度上升的研究結(jié)果一致。由于甘油必須通過(guò)有氧氧化途徑為機(jī)體提供能量，供能速率相對(duì)較慢，故血液中甘油濃度增加。

3.2 補(bǔ)充蝦青素對(duì)疲勞運(yùn)動(dòng)大鼠血清代謝的影響

EM組與E組大鼠血清差異代謝物有7種，共參與9條代謝通路，其中纈氨酸、亮氨酸與異亮氨酸的生物合成，甘油脂代謝2條通路為蝦青素干預(yù)主要涉及的靶標(biāo)通路。參與以上2條通路的代謝物有纈氨酸（c00183）、亮氨酸（c00123）、異亮氨酸（c00407）和甘油（c00116）。本研究中蝦青素主要對(duì)疲勞運(yùn)動(dòng)涉及的6條靶標(biāo)通路中的2條，8種潛在代謝標(biāo)志物中的4種產(chǎn)生影響。

纈氨酸（c00183）、亮氨酸（c00123）和異亮氨酸（c00407）參與纈氨酸、亮氨酸與異亮氨酸的生物合成（圖4a）通路。研究表明，BCAA補(bǔ)充可促進(jìn)組織蛋白合成并加速新陳代謝、延緩運(yùn)動(dòng)疲勞[40]，低濃度的BCAA與中樞性疲勞密切相關(guān)[41]。而蝦青素可調(diào)節(jié)運(yùn)動(dòng)代謝，增強(qiáng)運(yùn)動(dòng)表現(xiàn)，促進(jìn)疲勞恢復(fù)[42]。Tatiana等研究表明，大鼠45天連續(xù)服每天用1毫克ASTA/kg體重游泳疲勞時(shí)間明顯延遲了29%[43]。Zanghi等研究表明，補(bǔ)充蝦青素的狗疲勞運(yùn)動(dòng)后支鏈氨基酸水平明顯高于對(duì)照組[44]。本研究中EM組大鼠血清BCAA濃度顯著高于E組，與Zanghi等的研究結(jié)果相似，表明蝦青素補(bǔ)充可通過(guò)抑制疲勞運(yùn)動(dòng)造成的BCAA減少，從而起到延緩疲勞的作用。

甘油（c00116）參與甘油脂代謝通路（圖4f）。蝦青素可降低肝臟甘油三酯、血漿甘油三酯和總膽固醇濃度，對(duì)治療肥胖和代謝綜合征有重要作用[45]。它可以直接與過(guò)氧化物酶體增殖物激活受體PPARα和PPARγ相互作用，激活PPARα同時(shí)抑制PPARγ，從而減少體外肝細(xì)胞的脂質(zhì)積累[46]。還可促進(jìn)甘油異生成糖，將甘油先轉(zhuǎn)變?yōu)榱姿岫u丙酮，再在醛縮酶的作用下將其轉(zhuǎn)變?yōu)?，6-二磷酸果糖，最終轉(zhuǎn)變?yōu)槠咸烟潜唤M織攝取利用[47]。Aoi研究表明，補(bǔ)充蝦青素4周與正常飲食組大鼠相比，蝦青素補(bǔ)充組大鼠運(yùn)動(dòng)時(shí)的脂肪利用顯著提高，且運(yùn)動(dòng)時(shí)間延長(zhǎng)[48]。Ikeuchi研究表明，服用蝦青素后，游泳小鼠血漿中脂肪堆積顯著降低，運(yùn)動(dòng)時(shí)間明顯延長(zhǎng)[47]。Liu等研究也表明，與正常飲食大鼠相比，蝦青素喂養(yǎng)大鼠運(yùn)動(dòng)后血漿甘油、脂肪酸濃度顯著降低，脂質(zhì)利用加速[49]。本研究中補(bǔ)充蝦青素組大鼠血清甘油濃度顯著降低，與Ikeuchi及Liu等的研究結(jié)果類似，表明蝦青素可促進(jìn)疲勞運(yùn)動(dòng)大鼠血清甘油利用，為疲勞運(yùn)動(dòng)提供能量。

本研究中的代謝物也可作為底物對(duì)信號(hào)通路產(chǎn)生影響，下一步的研究可結(jié)合相關(guān)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路中酶活性、蛋白或基因表達(dá)等變化，從分子和代謝兩個(gè)水平深入探究疲勞運(yùn)動(dòng)對(duì)代謝通路與信號(hào)傳導(dǎo)通路的整體調(diào)節(jié)作用。

4 結(jié)論

4.1 疲勞運(yùn)動(dòng)可通過(guò)影響纈氨酸、亮氨酸與異亮氨酸的生物合成，酮體的合成與降解，丁酸代謝，三羧酸循環(huán)，乙醛酸與二羧酸代謝及甘油脂代謝等6條代謝通路對(duì)大鼠機(jī)體產(chǎn)生不利影響。

4.2 疲勞運(yùn)動(dòng)前補(bǔ)充蝦青素可通過(guò)改變其中的纈氨酸、亮氨酸與異亮氨酸的生物合成及甘油脂代謝通路達(dá)到促進(jìn)機(jī)體脂質(zhì)代謝、節(jié)約BCAA利用、延緩運(yùn)動(dòng)疲勞的作用。

參考文獻(xiàn)：

[1]WALDRON M， PATTERSON S D， TALLENT J， et al. The Effects of an Oral Taurine Dose and Supplementation Period on Endurance Exercise Performance in Humans：A Meta-Analysis [J]. Sports Medicine， 2018， 48 （5）：1247-1253.

[2]袁海峰， 馬薇嬌， 李澤龍，等.參芪口服液對(duì)運(yùn)動(dòng)性疲勞大鼠運(yùn)動(dòng)能力及氧化應(yīng)激的影響 [J]. 當(dāng)代體育科技， 2018，8（6）：7-10.

[3]OWENS D J， ALLISON R， CLOSE G L. Vitamin D and the Athlete：Current Perspectives and New Challenges [J]. Sports Medicine， 2018， 48 （1）：3-16.

[4]BOWTELL J， KELLY V. Fruit-Derived Polyphenol Supplementation for Athlete Recovery and Performance [J]. Sports Medicine， 2019， 49 （1）：3-23.

[5]GUERIN M， HUNTLEY M E， OLAIZOLA M. Haematococcus astaxanthin：applications for human health and nutrition [J]. Trends in Biotechnology， 2003， 21 （5）：210-216.

[6]DJORDJEVIC B， BARALIC I， ANDJELKOVIC M， et al. The Effect Of Astaxanthin On Mucosal Immunity， Oxidative Stress And Inflammation In Soccer Players [J]. Medicine & Science in Sports & Exercise， 2015， 47 （5S）：894-894.

[7]OLIVER S G， WINSON M K， KELL D B， et al. Systematic functional analysis of the yeast genome [J]. Trends in Biotechnology， 1998， 16 （9）：373-378.

[8]KUEHNBAUM N L， GILLEN J B， KORMENDI A， et al. Multiplexed separations for biomarker discovery in metabolomics：Elucidating adaptive responses to exercise training [J]. ELECTROPHORESIS， 2015， 36 （18）：2226-2236.

[9]MARKLEY J L， BRüSCHWEILER R， EDISON A S， et al. The future of NMR-based metabolomics [J]. Current Opinion in Biotechnology， 2017（43）：34-40.

[10]KALANTARI A， SAREMI A， SHAVANDI N， et al. Impact of Four Week Swimming Exercise with Alpha-Tocopherol Supplementation on Fertility Potential in Healthy Rats [J]. Urology journal， 2017， 14 （5）：5023-5026.

[11]侯莉娟， 劉曉莉， 喬德才. 大鼠游泳運(yùn)動(dòng)疲勞模型建立的研究 [J]. 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物科學(xué)與管理， 2005 （1）：1-3.

[12]郭慶軍， 常耀明， 李金聲，等.大鼠游泳運(yùn)動(dòng)疲勞模型力竭標(biāo)準(zhǔn)的研究 [J]. 現(xiàn)代生物醫(yī)學(xué)進(jìn)展， 2010， 10 （15）：2855-2858.

[13]楊銀平. 基于細(xì)胞代謝組學(xué)技術(shù)的人參皂苷Rb1對(duì)SH-SY5Y細(xì)胞保護(hù)機(jī)制研究 [J]. 分析化學(xué)， 2019， 47 （1）：49-58.

[14]JACKMAN S R， WITARD O C， PHILP A， et al. Branched-Chain Amino Acid Ingestion Stimulates Muscle Myofibrillar Protein Synthesis following Resistance Exercise in Humans [J]. Frontiers in Physiology， 2017（8）：390.

[15]HORMOZNEJAD R， ZARE JAVID A， MANSOORI A. Effect of BCAA supplementation on central fatigue， energy metabolism substrate and muscle damage to the exercise：a systematic review with meta-analysis [J]. Sport Sciences for Health， 2019：1-15.

[16]PATTERSON S D， WALDRON M， JEFFRIES O. Chapter 13 - Proteins and Amino Acids and Physical Exercise [M]//WALRAND S. Nutrition and Skeletal Muscle，Academic Press，2019：183-196.

[17]RA S-G， MIYAZAKI T， KOJIMA R， et al. Effect of BCAA supplement timing on exercise-induced muscle soreness and damage：a pilot placebo-controlled double-blind study [J]. J Sports Med Phys Fitness， 2018， 58 （11）：1582-1591.

[18]KIM D-H， KIM S-H， JEONG W-S， et al. Effect of BCAA intake during endurance exercises on fatigue substances， muscle damage substances， and energy metabolism substances [J]. J Exerc Nutrition Biochem， 2013， 17 （4）：169-180.

[19]GUALANO A B， BOZZA T， LOPES DE CAMPOS P， et al. Branched-chain amino acids supplementation enhances exercise capacity and lipid oxidation during endurance exercise after muscle glycogen depletion [J]. J Sports Med Phys Fitness， 2011， 51 （1）：82-88.

[20]JAFARI H， ROSS J B， EMHOFF C-A W. Effects of Branched-Chain Amino Acid Supplementation on Exercise Performance and Recovery in Highly Endurance-Trained Athletes [J]. The FASEB Journal， 2016（30）：lb683-lb683.

[21]KARL J P， MARGOLIS L M， MURPHY N E， et al. Military training elicits marked increases in plasma metabolomic signatures of energy metabolism， lipolysis， fatty acid oxidation， and ketogenesis [J]. Physiological reports， 2017， 5 （17）：e13407.

[22]LEWIS G D， FARRELL L， WOOD M J， et al. Metabolic Signatures of Exercise in Human Plasma [J]. Science translational medicine， 2010， 33（2）：33-37.

[23]NOZAKI S， TANAKA M， MIZUNO K， et al. Mental and physical fatigue-related biochemical alterations [J]. Nutrition， 2009， 25 （1）：51-57.

[24]SHE P， ZHOU Y， ZHANG Z， et al. Disruption of BCAA metabolism in mice impairs exercise metabolism and endurance [J]. Journal of Applied Physiology， 2010， 108 （4）：941-949.

[25]SMITH D J， NORRIS S R. Changes in glutamine and glutamate concentrations for tracking training tolerance [J]. Med Sci Sports Exerc， 2000， 32 （3）：684-689.

[26]CAGLAR A， TOMAR O， EK？倫Z T. Butyric Acid：Structure， Properties and Effects on Health [J]. Kocatepe Veterinary Journal， 2017， 10 （3）：213-225.

[27]HEIMANN E， NYMAN M， DEGERMAN E. Propionic acid and butyric acid inhibit lipolysis and de novo lipogenesis and increase insulin-stimulated glucose uptake in primary rat adipocytes [J]. Adipocyte， 2015， 4 （2）：81-88.

[28]CAI X， YUAN Y， LIAO Z， et al. α-Ketoglutarate prevents skeletal muscle protein degradation and muscle atrophy through PHD3/ADRB2 pathway [J]. The FASEB Journal， 2017， 32 （1）：488-499.

[29]EVANS M， COGAN K E， EGAN B. Metabolism of ketone bodies during exercise and training：physiological basis for exogenous supplementation [J]. The Journal of Physiology， 2017， 595 （9）：2857-2871.

[30]OCONNOR， JAMES W. Comparative changes in plasma， urine and sweat during endurance exercise using NMR-based metabolomics [J]. Medical Research Archives， 2015， 2 （3）：15-21.

[31]AKRAM M. Citric Acid Cycle and Role of its Intermediates in Metabolism [J]. Cell Biochemistry and Biophysics， 2014， 68 （3）：475-478.

[32]ALVES TIAGO C， PONGRATZ REBECCA L， ZHAO X， et al. Integrated， Step-Wise， Mass-Isotopomeric Flux Analysis of the TCA Cycle [J]. Cell Metabolism， 2015， 22 （5）：936-947.

[33]ZHOU W， ZENG G， LYU C， et al. The Effect of Exhaustive Exercise on Plasma Metabolic Profiles of Male and Female Rats [J]. J Sports Sci Med， 2019， 18 （2）：253-263.

[34]張寧. 穿山龍抗急性痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎的腎臟代謝組學(xué)研究 [J]. 中華中醫(yī)藥雜志， 2017（5）：2034-2039.

[35]YU J， ZHENG J， LIU X F， et al. Exercise improved lipid metabolism and insulin sensitivity in rats fed a high-fat diet by regulating glucose transporter 4 （GLUT4） and musclin expression [J]. Brazilian Journal of Medical and Biological Research， 2016， 49（5）：e5129.

[36]MANAF F A， LAWLER N G， PEIFFER J J， et al. Characterizing the plasma metabolome during and following a maximal exercise cycling test [J]. Journal of Applied Physiology， 2018， 125 （4）：1193-1203.

[37]LUND J， RUSTAN A C， LVSLETTEN N G， et al. Exercise in vivo marks human myotubes in vitro：Training-induced increase in lipid metabolism [J]. PLOS ONE， 2017， 12 （4）：e0175441.

[38]LYUDININA A Y， IVANKOVA G E， BOJKO E R. Priority use of medium-chain fatty acids during high-intensity exercise in cross-country skiers [J]. Journal of the International Society of Sports Nutrition， 2018， 15 （1）：1-8.

[39]STANDER Z， LUIES L， MIENIE L J， et al. The altered human serum metabolome induced by a marathon [J]. Metabolomics， 2018， 14 （11）：150.

[40]GERVASI M， SISTI D， AMATORI S， et al. Effect of a Carbohydrate/Branched Chain Aminoacids/Alanine sport nutritional supplement （Friliver performance） on perceived exertion in a 9-weeks high intensity interval training sessions [J]. Clinical Nutrition， 2018（37）：S299-S299.

[41]QUIROGA N， DINUNZIO C， VAN SCOY J， et al. EFFECTS OF BRANCH CHAIN AMINO ACID SUPPLEMENTATION IN DELAYING CENTRAL FATIGUE; proceedings of the International Journal of Exercise Science：Conference Proceedings， F， 2017 [C].

[42]BROWN D R， GOUGH L A， DEB S K， et al. Astaxanthin in Exercise Metabolism， Performance and Recovery：A Review [J]. Frontiers in Nutrition， 2018，76（4）：1-9.

[43]POLOTOW T G， VARDARIS C V， MIHALIUC A R， et al. Astaxanthin supplementation delays physical exhaustion and prevents redox imbalances in plasma and soleus muscles of Wistar rats [J]. Nutrients， 2014，12（6）：5819-5838.

[44]ZANGHI B M， MIDDLETON R P， REYNOLDS A J. Effects of postexercise feeding of a supplemental carbohydrate and protein bar with or without astaxanthin from Haematococcus pluvialis to exercise-conditioned dogs [J]. American Journal of Veterinary Research， 2015，76（4）：338-350.

[45]IKEUCHI M， KOYAMA T， TAKAHASHI J， et al. Effects of Astaxanthin in Obese Mice Fed a High-Fat Diet [J]. Bioscience， biotechnology， and biochemistry， 2007，71（4）：893-899.

[46]JIA Y， WU C， KIM J， et al. Astaxanthin reduces hepatic lipid accumulations in high-fat-fed C57BL/6J mice via activation of peroxisome proliferator-activated receptor （PPAR） alpha and inhibition of PPAR gamma and Akt [J]. The Journal of Nutritional Biochemistry， 2016（28）：9-18.

[47]IKEUCHI M， KOYAMA T FAU - TAKAHASHI J， TAKAHASHI J FAU - YAZAWA K， et al. Effects of astaxanthin supplementation on exercise-induced fatigue in mice [J]. 2006， 29 （10）：2106-2110.

[48]AOI W， NAITO Y FAU - TAKANAMI Y， TAKANAMI Y FAU - ISHII T， et al. Astaxanthin improves muscle lipid metabolism in exercise via inhibitory effect of oxidative CPT I modification [J]. Biochemical and Biophysical Research Communicadons， 2008， 366 （4）：892-897.

[49]LIU P H， AOI W， TAKAMI M， et al. The astaxanthin-induced improvement in lipid metabolism during exercise is mediated by a PGC-1alpha increase in skeletal muscle [J]. J Clin Biochem Nutr， 2014， 54 （2）：86-89.