楊行堂， 王芝珺， 鄭佳誼， 劉占舉

(1. 同濟(jì)大學(xué)附屬第十人民醫(yī)院急診科，上海 200072; 2. 同濟(jì)大學(xué)附屬第十人民醫(yī)院病理科，上海 200072; 3. 同濟(jì)大學(xué)附屬第十人民醫(yī)院消化科，上海 200072)

幽門螺桿菌(Helicobacterpylori, Hp)是一種需微需氧環(huán)境下生長的呈螺桿狀、短桿桿狀及不規(guī)則彎曲狀等形態(tài)的革蘭陰性細(xì)菌，常定植于人類及靈長目類動(dòng)物的胃黏膜組織。Hp是慢性胃炎、消化性潰瘍、胃癌及胃黏膜相關(guān)淋巴組織(mucosa-associated lymphoid tissue, MALT)淋巴瘤等眾多消化系統(tǒng)疾病的重要致病因素[1-5]，有關(guān)Hp致病機(jī)制的研究一直是胃腸病工作者研究的熱點(diǎn)之一。模擬人體菌群環(huán)境構(gòu)建Hp感染的動(dòng)物模型為方便和深入開展有關(guān)Hp耐藥機(jī)制研究，研發(fā)新藥、篩選疫苗及Hp致胃炎、胃癌等疾病機(jī)制的研究不失為一個(gè)行之有效的途徑。當(dāng)前Hp感染動(dòng)物模型造模所用動(dòng)物選擇以獼猴，蒙古沙鼠，BALB/c、C57BL/6小鼠，貓及豬等小型實(shí)驗(yàn)動(dòng)物為主[6-9]。但獼猴、豬等價(jià)格昂貴，操作繁雜不便，且不易控制處理因素，對(duì)大規(guī)模及常規(guī)開展研究帶來諸多不便。而小鼠由于遺傳背景明晰、個(gè)體差異小、品種品系選擇多、易飼養(yǎng)、繁殖快、花費(fèi)低等優(yōu)點(diǎn)，成為目前Hp體內(nèi)感染動(dòng)物模型建立所廣泛選用的模型動(dòng)物[9]。普通實(shí)驗(yàn)小鼠帶菌多，污染大，干擾因素眾多，建立Hp感染動(dòng)物模型困難重重。無特定病原生物(specific pathogen free, SPF)動(dòng)物是指動(dòng)物機(jī)體內(nèi)無特定的微生物和寄生蟲存在及無傳染病的健康動(dòng)物，要求屏障飼養(yǎng)環(huán)境，是目前廣泛使用的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物。采用SPF動(dòng)物造模，屏障環(huán)境下，不僅利于Hp的定植，也盡可能模擬了人體的菌群狀態(tài)，且花費(fèi)相對(duì)較少，簡便易行。中性粒細(xì)胞是固有免疫應(yīng)答的重要成分，能快速遷徙到感染位點(diǎn)從而對(duì)感染做出迅速響應(yīng)。胃內(nèi)Hp感染的最初炎癥反應(yīng)是中性粒細(xì)胞浸潤，中性粒細(xì)胞是清除Hp感染的關(guān)鍵細(xì)胞[10]。而CD177是白細(xì)胞抗原6超家族成員之一，CD177有2種等位基因(NB1、PRV-1)其編碼的蛋白稱為HNA-2a，是一種糖基化磷脂酰肌醇錨定糖蛋白，僅在中性粒細(xì)胞特異表達(dá)，CD177在應(yīng)答感染的循環(huán)中性粒細(xì)胞上的表達(dá)顯著上調(diào)，業(yè)已證實(shí)與嚴(yán)重細(xì)菌感染、紅細(xì)胞增多癥、炎癥性腸病等疾病有關(guān)[11-13]。Toyoda等[14]還提出CD177可作為胃腫瘤中腫瘤細(xì)胞黏附和遷移的調(diào)節(jié)因子，并報(bào)道CD177表達(dá)上調(diào)并非由于中性粒細(xì)胞向胃黏膜浸潤增加所致，而是由于基因表達(dá)的變化。但此前并無中性粒細(xì)特異性分化抗原CD177和Hp相關(guān)性胃炎關(guān)系的研究報(bào)道。本課題組通過人胃黏膜活檢組織病理切片免疫組織化學(xué)初步研究發(fā)現(xiàn)中性粒細(xì)胞分化抗原CD177在人Hp相關(guān)性胃炎中表達(dá)增高，在Hp感染的人胃黏膜組織中CD177的表達(dá)顯著高于非Hp感染的胃黏膜組織[15]。為了進(jìn)一步探討CD177與Hp相關(guān)性胃炎的關(guān)系，本研究擬比較不同Hp標(biāo)準(zhǔn)株感染的中性細(xì)胞CD177基因敲除小鼠和野生型小鼠的胃黏膜Hp感染、炎癥分級(jí)、活動(dòng)性胃炎等變化情況。本實(shí)驗(yàn)選取了SPF級(jí)C57BL/6 CD177基因敲除(CD177 gene knock-out, CD177 KO)小鼠試圖建立該小鼠的Hp感染的動(dòng)物模型。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

造模小鼠由同濟(jì)大學(xué)附屬第十人民醫(yī)院中心實(shí)驗(yàn)室動(dòng)物中心提供。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物根據(jù)中華人民共和國技術(shù)監(jiān)督局GB l4922.94《實(shí)驗(yàn)動(dòng)物微生物和寄生蟲檢測等級(jí)》標(biāo)準(zhǔn)，健康4～6周齡雌、雄性各半C57BL/6 CD177基因敲除(CD177 gene knock-out, CD177 KO)小鼠和C57BL/6野生型(Wild Type, WT)小鼠(SPF級(jí))各22只，體重18～30g，飼養(yǎng)于同濟(jì)大學(xué)附屬第十人民醫(yī)院中心動(dòng)物實(shí)驗(yàn)樓的SPF動(dòng)物房內(nèi)，所有實(shí)驗(yàn)動(dòng)物在相關(guān)實(shí)驗(yàn)操作前均飼養(yǎng)在動(dòng)物房適應(yīng)7d(光照按照6:00～18:00)，自由進(jìn)食和進(jìn)水、控制室溫在25℃左右，濕度60%，分籠喂養(yǎng)，每籠5～6只。所有動(dòng)物實(shí)驗(yàn)均得到同濟(jì)大學(xué)附屬第十人民醫(yī)院倫理委員會(huì)和上海市科學(xué)技術(shù)委員會(huì)批準(zhǔn)。本研究遵循美國國家衛(wèi)生機(jī)構(gòu)發(fā)布的《實(shí)驗(yàn)動(dòng)物保護(hù)和應(yīng)用指南》(NIH publication No.85.23，1996年修訂)；實(shí)驗(yàn)動(dòng)物使用和操作遵循同濟(jì)大學(xué)附屬第十人民醫(yī)院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)管理委員會(huì)相應(yīng)規(guī)定。

1.2 試劑與儀器

Hp悉尼菌株(Hp, Sydney Strain 1, HpSS1)(VacA+CagA-)標(biāo)準(zhǔn)株及Hp49503(VacA+、CagA+)標(biāo)準(zhǔn)株均購自上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院病原生物教研室。

布氏肉湯培養(yǎng)基購自上海市疾病預(yù)防控制中心；培養(yǎng)基制作用瓊脂粉由英國Oxoid公司郵購；Hp 尿素酶測定試劑盒、革蘭氏染色試劑盒分別購自珠海麗拓生物科技及上海恩康生物科技有限公司；二氨基聯(lián)苯胺鹽酸鹽(DAB)由美國Sigma公司郵購。

自行設(shè)計(jì)、可通、換氣的Hp簡易培養(yǎng)罐，于中國科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院精工廠定制。

培養(yǎng)Hp用混合氣體(N285%、CO210%、O25%)購自上海尤嘉利液氮有限公司。高壓蒸汽消毒鍋購自日本SANYO電器公司。超凈工作臺(tái)購自蘇州市永久調(diào)壓器廠。

1.3 方法

1.3.1 Hp培養(yǎng) 取出凍存于液氮中的HpSS1及Hp49503標(biāo)準(zhǔn)菌株，在生物安全柜內(nèi)經(jīng)復(fù)蘇、傳代培養(yǎng)后，3～5接種環(huán)菌液于布氏肉湯血瓊脂固體培養(yǎng)基上連續(xù)劃線接種，接種的平皿即刻放入可通換混合氣(N285%、CO210%、O25%)，并能保持較好濕度Hp微需氧培養(yǎng)罐中，培養(yǎng)罐轉(zhuǎn)置37℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)3～5d，具體參照文獻(xiàn)[16-18]的培養(yǎng)方法。

1.3.2 Hp感染小鼠動(dòng)物模型的制作 造模方法參照有關(guān)文獻(xiàn)[19-23]，C57BL/6野生型小鼠及CD177基因敲除小鼠各22只，雌雄各半，野生型及CD177基因敲除小鼠各自隨機(jī)分成2組: 野生型小鼠Hp悉尼菌株(SS1)灌胃組(HpSS1 WT組)10只、野生型小鼠Hp49503株灌胃組(Hp49503 WT組)10只、CD177基因敲除小鼠Hp悉尼株灌胃組(HpSS1 KO組)10只、CD177基因敲除小鼠Hp49503株灌胃組(Hp49503 KO組)10只，另設(shè)WT及KO空白對(duì)照各1組，各自相應(yīng)對(duì)照組小鼠每組隨機(jī)各2只，共計(jì)6組。用接種環(huán)刮取培養(yǎng)皿上Hp菌落，經(jīng)尿素酶、氧化酶實(shí)驗(yàn)及涂片革蘭染色鑒定后，刮下Hp菌落混懸于PBS中，經(jīng)分光光度計(jì)檢測菌液濃度，當(dāng)A660=1時(shí)，Hp菌液濃度達(dá) 1×108CFU/mL(colony-forming unites)。模型組每只小鼠灌服細(xì)菌濃度為1×108CFU/mL Hp菌液0.3mL，間隔1d，共灌服3次，正?？瞻讓?duì)照組以0.3mL無菌PBS灌喂，所有實(shí)驗(yàn)組小鼠于灌喂處理前予禁食12h，禁水4h，于灌喂后繼續(xù)予禁食、禁水4h。

1.3.3 動(dòng)物模型的處理 末次灌喂2周后頸椎脫臼法處死小鼠，腹正中部開腹，取出全胃(包含胃竇、胃體及十二指腸等)，繼而沿大彎切開鼠胃，充分暴露胃黏膜后，以PBS清洗小鼠胃黏膜，然后分離出實(shí)驗(yàn)小鼠胃黏膜組織[21]，一半用于石蠟包埋病理切片用，另一半置-80℃冰箱備用。

1.3.4 Hp的檢測 (1) 快速尿素酶檢測試驗(yàn)。取部分新鮮的小鼠胃黏膜組織剪碎后置入尿素酶測試反應(yīng)孔中，5min內(nèi)測試反應(yīng)孔由桔黃色變?yōu)榧t色或紫紅色鑒定為陽性。(2) Warthin-Starry銀染染色。組織固定于4%甲醛，常規(guī)脫水包埋。切片厚約4～6μm，常規(guī)脫蠟至水。經(jīng)蒸餾水浸洗切片1min，再重復(fù)2次后，切片置入酸性硝酸銀溶液(加蓋)中，水浴染色。取出切片放入現(xiàn)配制的Warthin-Starry染色液(加蓋)，置入56℃水浴染色，直至切片呈淡黃棕色時(shí)取出，切片平放在染色架上，再用預(yù)熱的自來水徹底清洗。經(jīng)自來水沖洗，常規(guī)脫水后，再予二甲苯透明，最后中性樹膠封片。Hp菌體染色呈黑色。

兩種方法均顯示為陽性結(jié)果鑒定為感染Hp。

1.3.5 組織病理學(xué)檢查 部分胃黏膜組織塊用4%甲醛常規(guī)固定，乙醇脫水，二甲苯透明，石蠟包埋，蠟塊包埋組織切片機(jī)切片，切片厚約4～6μm，經(jīng) 56℃ 烤箱烤片固定2h。常規(guī)H-E染色: 組織切片經(jīng)二甲苯脫蠟和梯度乙醇脫水處理晾干后，置于蘇木素染液中染色3～5min，流水沖洗 5min，繼而鹽酸酒精30s脫色，然后水洗藍(lán)化后伊紅染色1～ 3min，水洗后再經(jīng)常規(guī)脫水、透明、中性樹膠封片固定。顯微鏡下見細(xì)胞核染成藍(lán)色，細(xì)胞質(zhì)和Hp均染成粉紅色。

1.3.6 胃黏膜炎癥病理組織學(xué)改變標(biāo)準(zhǔn)確定 參閱2012及2017中國慢性胃炎共識(shí)意見[24-25]。按胃黏膜層淋巴細(xì)胞、單核細(xì)胞等慢性炎性反應(yīng)細(xì)胞的密集程度和浸潤深度對(duì)胃炎進(jìn)行分級(jí)評(píng)分。0分: 單個(gè)核細(xì)胞每高倍視野不多余5個(gè)；1分: 慢性炎癥細(xì)胞較少并限于黏膜淺層，不超過黏膜層的1/3；2分: 慢性炎癥細(xì)胞較密集，超過黏膜層的1/3，未超過黏膜層2/3；3分: 慢性炎癥細(xì)胞密集，占據(jù)胃黏膜全層。炎癥細(xì)胞計(jì)數(shù)評(píng)分應(yīng)避開淋巴濾泡及其周淋巴細(xì)胞區(qū)域。

1.3.7 Hp定植判斷標(biāo)準(zhǔn)[25]觀察顯微鏡下每10個(gè)高倍視野胃黏膜黏液層、胃黏膜上皮、胃小凹上皮及腺管表面上皮的Hp定植情況，以Hp定植數(shù)量的多少進(jìn)行定植計(jì)分。0分：無Hp定植；1分：偶見或小于標(biāo)本黏膜全層1/3有少數(shù)Hp；2分：Hp分布超過黏膜全層1/3而未達(dá)到黏膜全層2/3或連續(xù)性、薄而稀疏散在于上皮表面；3分：Hp成堆，分布胃黏膜上皮全層。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)軟件包進(jìn)行分析。多組間率的比較用卡方檢驗(yàn)。檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05，P<0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 各組小鼠胃黏膜Hp定植及組織學(xué)炎癥情況染色結(jié)果

銀染色顯示，各造模組小鼠胃黏膜均可見Hp成功定植(圖1A～D)。各造模組小鼠胃黏膜黏液層、黏膜上皮表面及胃小凹均可見黑色及棕黑色桿狀、螺桿狀、短桿狀、逗點(diǎn)狀及不規(guī)則彎曲狀Hp定植。其中CD177 KO組小鼠中，Hp49503菌株較HpSS1菌株有更強(qiáng)的定植能力，小鼠胃黏膜黏液層、黏膜上皮表面及小凹和隱窩見彌漫的Hp分布(圖1A、1B)。WT組小鼠中，HpSS1株Hp散在分布于小鼠胃黏膜黏液層至黏膜小凹及隱窩之間，Hp49503菌株Hp較廣泛分布于小鼠胃黏膜黏液層、上皮表面、胃小凹及隱窩，見圖1C、1D。WT組小鼠較KO組小鼠黏膜炎癥反應(yīng)強(qiáng)，且KO組小鼠黏膜炎癥細(xì)胞以淋巴及單核樣細(xì)胞為主，零星散在中性粒樣細(xì)胞；而WT組中黏膜炎癥細(xì)胞構(gòu)成除淋巴及單核樣細(xì)胞外，黏膜全層尚可見大量中性粒樣細(xì)胞浸潤分布。

H-E染色顯示，各造模組小鼠胃黏膜上皮表面、胃小凹及黏膜隱窩全層均可見大量炎癥細(xì)胞浸潤；其中KO組小鼠胃黏膜炎癥細(xì)胞構(gòu)成以淋巴及單核細(xì)胞為主，散在零星中性粒細(xì)胞；WT組胃黏膜炎癥浸潤細(xì)胞構(gòu)成除淋巴和單核細(xì)胞外，尚有大量中性粒細(xì)胞浸潤，炎癥反應(yīng)更強(qiáng)；而各自空白對(duì)照組小鼠胃黏膜未見明顯組織學(xué)炎癥改變，見圖2。

圖1 各組小鼠胃黏膜Hp定植情況銀染色Fig.1 Colonization of Hp in Gastric mucosa of mice by silver stainingA: KO小鼠HpSS1株感染，胃黏膜見較多Hp定植；B: KO小鼠Hp49503株感染，胃黏膜見大量Hp定植、堆積；C: WT小鼠HpSS1株感染，胃黏膜見散在Hp定植；D: WT小鼠Hp49503株感染，胃黏膜見大量Hp定植、堆積；銀染色，×400

圖2 各組小鼠胃黏膜組織學(xué)炎癥情況H-E染色Fig.2 H-E staining of gastric mucosa inflammation in each groupA: Hp49503株菌KO小鼠，胃黏膜全層見大量炎癥細(xì)胞浸潤，以單個(gè)核細(xì)胞為主，零星散在中性粒細(xì)胞；B: Hp49503株菌WT小鼠，胃黏膜全層見大量炎癥細(xì)胞浸潤，除單個(gè)核細(xì)胞外黏膜全層可見大量中性粒細(xì)胞；C: HpSS1株菌KO小鼠，胃黏膜全層見大量炎癥細(xì)胞浸潤，以單個(gè)核細(xì)胞為主，固有層有零星中性粒細(xì)胞散在；D: HpSS1株WT小鼠，胃黏膜全層見大量單個(gè)核及中心粒細(xì)胞等急、慢性炎癥細(xì)胞浸潤；E: KO空白對(duì)照小鼠，胃黏膜未見明顯炎癥變化；F: WT空白對(duì)照小鼠，胃黏膜未見明顯炎癥變化；H-E，×100

2.2 各組Hp感染率比較

各組感染率構(gòu)成比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，去空白對(duì)照組后各組感染率構(gòu)成比仍然有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05)，剔除對(duì)照組后，余下各組之間兩兩相比較，感染構(gòu)成比差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，見表1。

表1 Hp感染率比較Tab.1 Comparison of Hp infection rate

2.3 各組胃黏膜炎癥評(píng)分比較

造模小鼠炎癥分級(jí)構(gòu)成比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，不納入空白對(duì)照組差異仍具有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。組內(nèi)兩兩相比較，HpSS1株菌造模WT及KO小鼠炎癥構(gòu)成比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.023)，WT小鼠炎癥反應(yīng)較KO小鼠強(qiáng)烈，見表2。

表2 胃黏膜炎癥評(píng)分比較Tab.2 Comparison of gastric mucosal inflammation scores

2.4 各組活動(dòng)性胃炎評(píng)分構(gòu)成比較

各造模組小鼠活動(dòng)性胃炎評(píng)分構(gòu)成比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，其中WT造模組小鼠胃黏膜炎癥除單個(gè)核細(xì)胞外，尚見較多中性粒細(xì)胞浸潤，呈活動(dòng)性炎癥變化，而KO組小鼠胃黏膜炎癥細(xì)胞以慢性單個(gè)核炎癥細(xì)胞為主，中性粒細(xì)胞基本不可見。組內(nèi)兩兩比較，WT小鼠中Hp49503和HpSS1處理組差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.587)；KO組小鼠中，Hp49503和HpSS1處理組差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.531)；余下各組相比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.01)，見表3。

表3 活動(dòng)性胃炎評(píng)分構(gòu)成比較Tab.3 Comparison of scores of active gastritis

2.5 Hp定植評(píng)分

造模小鼠Hp定植構(gòu)成比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。剔除空白對(duì)照組定植構(gòu)成比仍然有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。組內(nèi)兩兩比較，Hp49503菌株在KO組小鼠的定植優(yōu)于WT組小鼠，差異有顯著性意義(P=0.034)，余下各組兩兩相比較Hp定植構(gòu)成差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，見表4。

表4 Hp定植評(píng)分比較Tab.4 Comparison of cloned Hp scores

3 討 論

Hp是慢性胃炎、消化性潰瘍、胃癌及胃MALT淋巴瘤等眾多消化系統(tǒng)疾病重要致病因素[1-5]，有關(guān)Hp致病機(jī)制的研究一直是消化病學(xué)研究的熱點(diǎn)之一。Hp通常定植于人及靈長目動(dòng)物的胃黏膜組織。構(gòu)建Hp感染的動(dòng)物模型為方便和深入開展有關(guān)Hp致病機(jī)制的研究提供了便捷。

在感染引起的固有免疫應(yīng)答過程中，中性粒細(xì)胞扮演極其重要的角色。胃黏膜Hp感染的最初炎癥反應(yīng)是中性粒細(xì)胞浸潤，中性粒細(xì)胞是清除Hp感染的關(guān)鍵細(xì)胞[10]。應(yīng)對(duì)感染引起的免疫應(yīng)答過程中中性粒細(xì)胞從血管內(nèi)遷徙到感染組織，而這種遷徙是通過中性粒細(xì)胞特異表達(dá)表面受體CD177與血小板內(nèi)皮細(xì)胞黏附分子(platelet endothelial cell adhesion molecule-1, PECAM-1)的相互作用實(shí)現(xiàn)[26-27]。作為中性粒細(xì)胞表面特異表達(dá)抗原，CD177在應(yīng)對(duì)感染的循環(huán)中性粒細(xì)胞表面的表達(dá)顯著上調(diào)，已發(fā)現(xiàn)CD177和嚴(yán)重感染、紅細(xì)胞增多癥、炎癥性腸病及胃腫瘤等疾病有關(guān)[12-14]。但尚無中性粒細(xì)胞特異表達(dá)受體CD177和Hp相關(guān)性胃炎相關(guān)性研究報(bào)道，本課題組近期研究發(fā)現(xiàn)中性粒細(xì)胞特異性表面受體CD177在人Hp相關(guān)性胃炎中表達(dá)增高，CD177在Hp感染的人胃黏膜組織中的表達(dá)顯著高于非Hp感染的胃黏膜組織[15]。為了進(jìn)一步探討CD177與Hp相關(guān)性胃炎的關(guān)系，擬比較Hp不同標(biāo)準(zhǔn)株感染的中性細(xì)胞CD177基因敲除小鼠和野生型小鼠的胃黏膜Hp胃腔內(nèi)感染定植，胃黏膜炎癥細(xì)胞構(gòu)成，炎癥變化情況，及今后進(jìn)一步深入研究Hp相關(guān)性胃炎發(fā)病機(jī)制的需要，有必要構(gòu)建相應(yīng)的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型。本實(shí)驗(yàn)選取了SPF級(jí)C57BL/6 CD177基因敲除(CD177 gene knock-out, CD177 KO)小鼠試圖建立該小鼠的Hp感染的動(dòng)物模型[19-23]，并構(gòu)建C57BL/6野生型小鼠Hp感染模型。

Lee等[19]鑒定的HpSS1菌株目前已被認(rèn)為是理想的動(dòng)物模型接種菌株。本研究采用HpSS1菌株及Hp49503菌株各分別對(duì)C57BL/6 CD177基因敲除小鼠和C57BL/6野生型小鼠進(jìn)行灌喂造模。結(jié)果表明，HpSS1及Hp49503菌株均分別在C57BL/6 CD177基因敲除小鼠和C57BL/6野生型小鼠表現(xiàn)出良好的定植。其中，Hp49503菌株在C57BL/6 CD177基因敲除小鼠的定植優(yōu)于C57BL/6野生型小鼠，而余下各組定植比較差異未見統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，定植率相當(dāng)。Hp49503菌株在C57BL/6 CD177基因敲除小鼠的定植優(yōu)于C57BL/6野生型小鼠，原因可能為Hp49503菌株含CagA+基因毒力較HpSS1株強(qiáng)；C57BL/6 CD177基因敲除小鼠由于循環(huán)血液中CD177+中性粒細(xì)胞缺少，固有免疫應(yīng)答應(yīng)對(duì)感染的能力不足，免疫功能降低，對(duì)Hp的清除能力減弱，從而導(dǎo)致Hp在C57BL/6 CD177基因敲除小鼠較C57BL/6野生型小鼠更容易定植。各組實(shí)驗(yàn)組小鼠不論有無Hp定植，胃黏膜均出現(xiàn)一定的炎癥改變，而對(duì)照組小鼠胃黏膜未出現(xiàn)明顯胃黏膜炎癥改變。少部分胃黏膜未見Hp定植的造模鼠，胃黏膜炎癥的發(fā)生可能與Hp感染被清除過程繼發(fā)的炎癥反應(yīng)等有關(guān)，這些必要時(shí)需擴(kuò)大樣本量以進(jìn)一步明確。實(shí)驗(yàn)尚發(fā)現(xiàn)WT造模組小鼠胃黏膜炎癥細(xì)胞構(gòu)成除單個(gè)核細(xì)胞外，尚見較多中性粒細(xì)胞浸潤，呈活動(dòng)性炎癥變化，而KO組小鼠胃黏膜炎癥細(xì)胞以單個(gè)核慢性炎癥細(xì)胞為主，中性粒細(xì)胞基本不可見。這可能與中性粒細(xì)胞CD177基因敲除后，CD177介導(dǎo)的中性粒細(xì)胞遷徙能力極度低下，導(dǎo)致循環(huán)血液中應(yīng)對(duì)Hp急性感染的中性粒細(xì)胞極度匱乏有關(guān)，故黏膜炎癥反應(yīng)缺少急性活動(dòng)性表現(xiàn)，表現(xiàn)為單個(gè)核細(xì)胞浸潤的慢性炎癥反應(yīng)為主，而WT組小鼠在應(yīng)對(duì)幽門螺桿感染時(shí)，急慢性炎癥細(xì)胞均作出正常的炎癥應(yīng)答。提示CD177在介導(dǎo)中性粒細(xì)胞遷徙過程中起到重要作用，與Sachs等[26]觀點(diǎn)一致，國內(nèi)周廣璽等[28]研究發(fā)現(xiàn)，在炎癥性腸病患者外周循環(huán)和腸黏膜組織的中性粒細(xì)胞顯著高于健康者，主要因?yàn)橹行粤＜?xì)胞膜表達(dá)CD177分子促進(jìn)了中性粒細(xì)胞向外周循環(huán)和腸黏膜炎癥部位的遷移。在Hp相關(guān)性胃炎中，CD177如何介導(dǎo)中性粒細(xì)胞參與固有免疫應(yīng)答，CD177+中性粒細(xì)胞在炎癥發(fā)生及免疫清除中所扮演的角色，及與其它炎癥細(xì)胞、炎癥介質(zhì)及炎癥因子的相互作用等，需要進(jìn)一步去深入探究。總之，本研究成功建立了Hp感染的C57BL/6中性粒細(xì)胞CD177基因敲除小鼠模型，為接下來進(jìn)一步深入探究CD177+中性粒細(xì)胞在Hp相關(guān)性胃炎發(fā)生中的作用提供了可選途徑，也為其他有關(guān)Hp感染的基因敲除小鼠模型的建立提供了參考。