昝杰彧 孫劍玥 徐亞娜 付艷緹 解玉

摘要 目的：探究平喘湯對(duì)小鼠支氣管氣道炎性反應(yīng)的抑制作用，及其作用機(jī)制是否與NLRP3炎癥小體活化的調(diào)控相關(guān)。方法：將6～8周齡C57BL/6雄性小鼠38只隨機(jī)分為空白對(duì)照組、哮喘模型組、低劑量平喘湯組（15 g/kg）、中等劑量平喘湯組（30 g/kg）、高劑量平喘湯組（60 g/kg）及陽(yáng)性藥物（地塞米松）對(duì)照組。采用腹腔注射及滴鼻吸入卵蛋白致敏法制備小鼠支氣管哮喘模型。除陽(yáng)性對(duì)照組予地塞米松腹腔給藥外，余各組均予對(duì)應(yīng)藥物灌胃，連續(xù)4周。末次給藥后，觀察小鼠一般情況，行為學(xué)評(píng)分（打噴嚏、抓鼻次數(shù)，呼吸急促程度），小鼠肺泡灌洗液中細(xì)胞總數(shù)、中性粒細(xì)胞、嗜酸性粒細(xì)胞、淋巴細(xì)胞及巨噬細(xì)胞計(jì)數(shù)，肺泡灌洗液炎性反應(yīng)因子IL-1β、IL-6、TNF-α及MCP-1表達(dá)，肺組織NLRP3炎癥小體及其下游靶向炎性反應(yīng)因子IL-1β及IL-18表達(dá)情況。結(jié)果：平喘湯可有效減少哮喘小鼠行為學(xué)評(píng)分，降低肺泡灌洗液細(xì)胞總數(shù)、中性粒細(xì)胞、嗜酸性細(xì)胞、淋巴細(xì)胞及巨噬細(xì)胞計(jì)數(shù)，下調(diào)肺泡灌洗液炎性反應(yīng)因子IL-1β、IL-6、TNF-α及MCP-1表達(dá)，抑制肺組織NLRP3炎癥小體、IL-1β及IL-18 mRNA和蛋白表達(dá)情況。結(jié)論：平喘湯可通過(guò)抑制NLRP3炎癥小體活化介導(dǎo)的氣道炎性反應(yīng)進(jìn)而減輕哮喘呼吸道癥狀。

關(guān)鍵詞 平喘湯;哮喘;氣道炎性反應(yīng);NLRP3炎癥小體;IL-1β;IL-18

Effects of Pingchuan Decoction on NLRP3 Inflammasome Activation Induced by Asthma in Mice

ZAN Jieyu，SUN Jianyue，XU Yana，F(xiàn)U Yanti，XIE Yu

（Department of Pediatrics，Putuo Hospital，Shanghai University of Traditional Chinese Medicine，Shanghai 200062，China）

Abstract Objective：To explore the inhibitory effect of Pingchuan Decoction on bronchial airway inflammation in mice，and whether its mechanism is related to the regulation of NLRP3 inflammasome activation.Methods：A total of 38 C57BL/6 male mice aged 6-8 weeks were randomly divided into a blank control group，an asthma model group，a low-dose Pingchuan Decoction group（15 g/kg），and a medium-dose Pingchuan Decoction group（30 g/kg），a high-dose Pingchuan Decoction group（60 g/kg）and a positive drug（dexamethasone）and a control group.A mouse bronchial asthma model was prepared by intraperitoneal injection and intranasal inhalation of egg protein sensitization method.Except for the positive control group who was given dexamethasone intraperitoneally，the other groups were given the corresponding drugs by gavage for 4 consecutive weeks.After the last administration，the general condition of the mice，behavioral scores（number of sneezing，scratching，and degree of shortness of breath），the total number of cells in the mouse alveolar lavage fluid，neutrophils，eosinophils，lymphocytes and Macrophage count，expression of inflammatory factors IL-1β，IL-6，TNF-α and MCP-1 in alveolar lavage fluid，expression of NLRP3 inflammasome and its downstream target inflammatory factors IL-1β and IL-18 in lung tissue were observed.Results：Pingchuan Decoction can effectively reduce the behavioral scores of asthmatic mice，reduce the total number of alveolar lavage fluid cells，neutrophils，eosinophils，lymphocytes and macrophages，and down-regulate the inflammatory factors IL-1β and IL in the alveolar lavage fluid-6，TNF-α and MCP-1 expression，inhibit the expression of NLRP3 inflammasome，IL-1β and IL-18 mRNA and protein in lung tissue.Conclusion：Pingchuan Decoction can reduce the respiratory tract symptoms of asthma by inhibiting the airway inflammation mediated by the activation of NLRP3 inflammasomes.

Keywords Pingchuan Decoction; Asthma; Airway inflammation; NLRP3 inflammasome; IL-1β; IL-18

中圖分類(lèi)號(hào)：R242;R285.5文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：Adoi：10.3969/j.issn.1673-7202.2020.23.018

近10年來(lái)由于環(huán)境及人類(lèi)生活方式的巨大改變，兒童支氣管哮喘（簡(jiǎn)稱(chēng)哮喘）發(fā)病率呈逐年上升趨勢(shì)。研究報(bào)道，我國(guó)城市兒童哮喘的發(fā)病率達(dá)3%，個(gè)別地區(qū)甚而高達(dá)4.2%[1]。因此，哮喘已經(jīng)成為我國(guó)威脅兒童健康的嚴(yán)重社會(huì)和公共衛(wèi)生問(wèn)題。目前，盡管哮喘的發(fā)病機(jī)制尚未闡明清楚，但研究表明多種炎性反應(yīng)細(xì)胞參與的氣道慢性炎癥在哮喘的發(fā)生、發(fā)展過(guò)程中起著核心作用，可導(dǎo)致氣道黏膜損傷、氣道高反應(yīng)性及氣道重塑[2]。值得注意的是，隨著近年來(lái)對(duì)炎性反應(yīng)機(jī)制研究的不斷深入，現(xiàn)已明確炎癥小體在啟動(dòng)細(xì)胞炎癥級(jí)聯(lián)反應(yīng)和活化各種炎性反應(yīng)因子中起著至關(guān)重要作用[3]。炎性小體由Tschopp教授于2002年首次發(fā)現(xiàn)，指含有NOD樣受體家族成員蛋白如NLRP1、NLRP3、NLRC4和AIM2等形成的蛋白復(fù)合體[3]。其中，NLRP3炎癥小體研究最為廣泛，其由NLRP3、ASC和pro-caspase-1組成的蛋白復(fù)合體，其激活后可通過(guò)活化caspase-1進(jìn)而剪切加工IL-1β和IL-18前體，生成IL-1β和IL-18成熟體，發(fā)揮致炎作用[4]。新近研究發(fā)現(xiàn)，NLRP3炎癥小體在兒童哮喘中發(fā)揮重要作用[5]。平喘湯是邵氏肺科傳人夏以琳教授在張仲景的“三拗湯”的基礎(chǔ)上擬定而成，配合宣肺、平喘等藥物加減而成。已有臨床研究表明，平喘湯對(duì)患兒哮喘有顯著療效[6-8]，但目前報(bào)道多基于其療效觀察，其作用機(jī)制尚不清楚;且各研究報(bào)道中平喘湯配方成分及比例不同，療效亦存在差異。本文擬通過(guò)構(gòu)建OVA小鼠哮喘模型，觀察本院自擬平喘湯對(duì)哮喘小鼠NLRP3炎癥小體及其介導(dǎo)的氣道炎癥級(jí)聯(lián)反應(yīng)的抑制作用，并在此基礎(chǔ)上深入探討該藥的分子作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動(dòng)物 SPF級(jí)6～8周齡健康C57BL/6雄性小鼠，體質(zhì)量20～24 g，購(gòu)于上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限責(zé)任公司。小鼠飼養(yǎng)于本院動(dòng)物房，飼養(yǎng)環(huán)境：溫度（23±2）℃，濕度40%～70%，12 h/12 h晝夜交替。本研究中對(duì)小鼠采取的所有實(shí)驗(yàn)操作皆嚴(yán)格遵循上海中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物倫理委員會(huì)制定的準(zhǔn)則下進(jìn)行。實(shí)驗(yàn)小鼠自購(gòu)入起，適應(yīng)性飼養(yǎng)1周之后用于實(shí)驗(yàn)。

1.1.2 藥物 本院自擬平喘湯每劑由炙麻黃5 g、杏仁6 g、生甘草6 g、黃芩6 g、蟬蛻6 g、地龍6 g、辛夷6 g、射干6 g、蘇梗9 g、桃仁6 g、柴胡6 g、魚(yú)腥草9 g組成。藥物均由上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬普陀醫(yī)院中藥房提供，口服液由上海中醫(yī)藥大學(xué)化學(xué)教研室制劑，藥物濃度為2 g（生藥）/mL，密封后儲(chǔ)存于4 ℃冰箱備用。地塞米松注射液（山東魯抗辰欣藥業(yè)有限公司，國(guó)藥準(zhǔn)字H37021967）。

1.1.3 試劑與儀器 卵蛋白（Sigma-Aldrich公司，美國(guó)，批號(hào)：A5503-1G）;IL-1β ELISA試劑盒（R&D systems公司，美國(guó)，貨號(hào)：SLB50）;IL-6 ELISA試劑盒（R&D systems公司，美國(guó)，貨號(hào)：SM6000B）;TNF-α ELISA試劑盒（R&D systems公司，美國(guó)，貨號(hào)：PDTA00D）;MCP-1 ELISA試劑盒（R&D systems公司，美國(guó)，貨號(hào)：DY479-05）;IL-18 ELISA試劑盒（MBL公司，日本，貨號(hào)：7625）;NLRP3一抗抗體（Abcam公司，美國(guó)，貨號(hào)：ab4207）;ASC一抗抗體（Cell signaling Technology公司，美國(guó)，貨號(hào)：67824）;caspase-1一抗抗體（美國(guó)Abcam公司，貨號(hào)：ab2012）;β-actin一抗抗體（美國(guó)Abcam公司，貨號(hào)：ab227387）;羊抗兔二抗抗體（杭州華安生物公司，貨號(hào)：HA1014）;羊抗鼠二抗抗體（杭州華安生物公司，貨號(hào)：HA1015）;多功能酶標(biāo)儀（BioTek公司，美國(guó)，型號(hào)：SynergyHTX/2型）;成像分析系統(tǒng)（Bio-Rad公司，美國(guó)，型號(hào)：Gel Doc EZ型）;PCR擴(kuò)增儀（Bio-Rad公司，美國(guó)，型號(hào)：Thermal Cycler S1000TM型）;熒光定量PCR儀（ABI公司，美國(guó)，型號(hào)：7900HT型）;倒置顯微鏡（Leica公司，德國(guó)，型號(hào)：DMi8型）。

1.2 方法

1.2.1 分組與模型制備 將38只小鼠隨機(jī)分成6組：1）空白對(duì)照組（n=6）;2）哮喘模型組（n=8）;3）低劑量給藥組（平喘湯，15 g/kg，n=6）;4）中等劑量給藥組（平喘湯，30 g/kg，n=6）;5）高劑量給藥組（平喘湯，60 g/kg，n=6）;6）陽(yáng)性對(duì)照組（地塞米松，1 mg/kg，n=6）。參考文獻(xiàn)方法[9]，將小鼠在第1、15天腹腔注射OVA混懸液0.2 mL致敏，第15天經(jīng)鼻腔滴注濃度為2 mg/mL OVA 50 μL激發(fā)，第26、27及28天鼻腔內(nèi)滴注1 mg/mL OVA 50 μL再次激發(fā)?？瞻捉M以等量生理鹽水替代。

1.2.2 給藥方法 各組皆從鼻腔滴注激發(fā)階段第1天起每天給藥，其中空白組及哮喘模型組予等劑量生理鹽水灌胃。各組灌胃或腹腔注射均在激發(fā)前1 h進(jìn)行。末次給藥24 h后測(cè)定相關(guān)指標(biāo)。給藥劑量參照實(shí)驗(yàn)動(dòng)物和人臨床用藥劑量換算公式：dB=dA*RB/RAx3√WA3√WB[10]。

1.2.3 檢測(cè)指標(biāo)與方法 行為學(xué)評(píng)分：參考文獻(xiàn)[11]，自O(shè)VA末次鼻腔滴注激發(fā)后觀察20 min，記分法記錄各組小鼠打噴嚏、抓鼻次數(shù)及哮喘呼吸嚴(yán)重程度。記分方法如下：無(wú)噴嚏為0分，<4個(gè)為1分，4～10個(gè)為2分，>11個(gè)為3分;無(wú)抓鼻為0分，輕度抓鼻為1分，頻繁抓鼻為2分，抓鼻不止為3分;無(wú)喘息為0分，呼吸急促為1分，明顯喘息為2分，喘息致死為3分。

標(biāo)本收集：腹腔注射10%水合氯醛麻醉小鼠，仰臥位固定，75%乙醇消毒小鼠頸、胸部，剪刀打開(kāi)小鼠胸腔及游離頸部氣管后，絲線結(jié)扎右主支氣管，注射器注入0.6 mL預(yù)冷PBS溶液灌洗支氣管肺泡共3次，4 ℃下以3 000 r/min轉(zhuǎn)速離心15 min，離心半徑9.9 cm，取上清為BALF，細(xì)胞沉渣用于細(xì)胞涂片。取左肺，置于4%多聚甲醛內(nèi)固定保存。取右肺，置于-80 ℃保存。

BALF中細(xì)胞計(jì)數(shù)：BALF離心后細(xì)胞沉渣用0.2 mLPBS重懸制備細(xì)胞涂片，經(jīng)Diff-Quick染色法，在光學(xué)顯微鏡下進(jìn)行各種類(lèi)型細(xì)胞計(jì)數(shù)。

BALF中IL-1β、IL-6、TNF-α及MCP-1含量：依據(jù)ELISA試劑盒說(shuō)明書(shū)步驟，用酶標(biāo)儀檢測(cè)BALF的OD450 nm值，并繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算IL-1β、IL-6、TNF-α及MCP-1濃度。

RT-PCR檢測(cè)：采用Trizol試劑提取肺組織總RNA，使用酶標(biāo)儀測(cè)定總RNA濃度，去除肺組織樣本中基因組DNA后逆轉(zhuǎn)錄以合成cDNA。引物設(shè)計(jì)見(jiàn)表1。微量分光光度計(jì)測(cè)量cDNA純度及濃度后，ABI 7500型熒光定量PCR儀檢測(cè)待測(cè)基因及內(nèi)參β-actin擴(kuò)增各循環(huán)熒光信號(hào)，計(jì)算其△Ct值及相對(duì)于空白組的相對(duì)值。

Western Blot檢測(cè)：采用蛋白裂解液提取小鼠右肺組織總蛋白，BCA試劑盒檢測(cè)蛋白濃度。取20 μg組織蛋白依次行電泳，轉(zhuǎn)膜，封閉，接著分別加入NLRP3（1∶1 000）、ASC（1∶500）、caspase-1（1∶1 000）及內(nèi)參β-actin（1∶5 000）一抗4 ℃過(guò)夜。常規(guī)洗膜后加入相應(yīng)二抗（1∶5 000）室溫下孵育。TBST洗膜三次后使用ECL免疫印跡化學(xué)發(fā)光底物暗室中顯影。利用美國(guó)Quantility One軟件半定量分析蛋白含量。

免疫組化檢測(cè)：取4%多聚甲醛固定的左肺依次進(jìn)行脫水、浸蠟、包埋、切片，將切片置于60 ℃烤箱內(nèi)熔蠟后，行脫蠟、脫水、抗原修復(fù)步驟，接著分別加入NLRP3（1∶500）、ASC（1∶200）及caspase-1（1∶200）一抗和對(duì)應(yīng)二抗孵育。采用DAB染色及蘇木精復(fù)染后，常規(guī)脫水、封片并在光學(xué)顯微鏡下觀察。免疫組化結(jié)果評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)參考文獻(xiàn)[12]：0分：無(wú)陽(yáng)性染色;1分：低密度陽(yáng)性染色;2分：中等密度陽(yáng)性染色;3分：高密度陽(yáng)性染色;4分：超高密度陽(yáng)性染色。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 20.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，其中計(jì)數(shù)資料以（%）表示，采用χ2檢驗(yàn)，計(jì)量資料以（±s）表示，采用t檢驗(yàn)，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 小鼠行為學(xué)改變 空白組小鼠一般情況可，精神狀態(tài)良好，無(wú)明顯異常。模型組小鼠皆出現(xiàn)不同程度煩躁不安，易驚，部分出現(xiàn)腹式呼吸、大小便失禁，打噴嚏、抓鼻次數(shù)增加，呼吸急促程度加深，相較于空白組行為學(xué)評(píng)分比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）。不同劑量給藥組及陽(yáng)性對(duì)照組小鼠行為學(xué)評(píng)分相較于模型組皆明顯下降（P<0.01）。中等劑量及高劑量給藥組小鼠行為學(xué)評(píng)分相較于低劑量給藥組小鼠顯著降低（P<0.05），但此兩者間比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。見(jiàn)圖1。

2.2 肺泡灌洗液細(xì)胞分類(lèi)計(jì)數(shù) 各組小鼠肺泡灌洗液細(xì)胞分類(lèi)計(jì)數(shù)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，模型組小鼠細(xì)胞總數(shù)、中性粒細(xì)胞、嗜酸性細(xì)胞、淋巴細(xì)胞及巨噬細(xì)胞計(jì)數(shù)較空白組小鼠顯著升高（P<0.01）。與模型組小鼠比較，除低劑量組小鼠中性粒細(xì)胞計(jì)數(shù)比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義外，余各觀察組小鼠細(xì)胞總數(shù)、中性粒細(xì)胞、嗜酸性細(xì)胞、淋巴細(xì)胞及巨噬細(xì)胞計(jì)數(shù)均顯著降低（P<0.05）。中等劑量組小鼠細(xì)胞總數(shù)及嗜酸性細(xì)胞計(jì)數(shù)較高劑量組小鼠降低，且存在統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。見(jiàn)表2?；谝陨蠈?shí)驗(yàn)結(jié)果，中等劑量平喘湯將被用于后續(xù)藥物炎性反應(yīng)抑制的機(jī)制研究。

2.3 肺泡灌洗液炎性反應(yīng)因子表達(dá) 模型組小鼠肺泡灌洗液IL-1β、IL-6、TNF-α及MCP-1含量較空白組小鼠顯著升高（P<0.01）。與模型組小鼠比較，給藥組及陽(yáng)性對(duì)照組小鼠IL-1β、IL-6、TNF-α及MCP-1含量明顯下降（P<0.05）。見(jiàn)圖2。

2.4 肺組織NLRP3炎癥小體表達(dá) 與空白組比較，模型組小鼠肺組織NLRP3、ASC、pro-caspase-1及caspase-1 mRNA及蛋白表達(dá)水平升高（P<0.01）。見(jiàn)圖3A。給予平喘湯或地塞米松后，NLRP3、ASC、pro-caspase-1及caspase-1 mRNA及蛋白表達(dá)水平顯著下降（P<0.05）。見(jiàn)圖3B。免疫組化染色結(jié)果進(jìn)一步表明，平喘湯可降低哮喘小鼠NLRP3、ASC及caspase-1表達(dá)水平（P<0.01）。見(jiàn)圖4。

2.5 肺組織IL-1β及IL-18表達(dá) 模型組小鼠肺組織NLRP3炎癥小體下游活性炎性反應(yīng)因子IL-1β及IL-18 mRNA較空白組小鼠明顯上升（P<0.01）。與模型組小鼠比較，給藥組及陽(yáng)性對(duì)照組小鼠IL-1β及IL-18蛋白表達(dá)顯著下降（P<0.05）。見(jiàn)圖5。

3 討論

氣道慢性炎癥是哮喘的重要特征，包括多種炎性細(xì)胞參與，如中性粒細(xì)胞、淋巴細(xì)胞、嗜酸性粒細(xì)胞和巨噬細(xì)胞等，這些炎性細(xì)胞可產(chǎn)生及活化各種炎性反應(yīng)因子，如IL-1β、IL-6、IL-18、IFN-β、TNF-α和嗜酸性細(xì)胞趨化因子等，進(jìn)而發(fā)揮促炎效果。本研究通過(guò)構(gòu)建OVA致敏小鼠模型，首次證實(shí)我院自擬平喘湯對(duì)哮喘的治療作用;進(jìn)一步分子機(jī)制研究發(fā)現(xiàn)，NLRP3炎癥小體介導(dǎo)的氣道炎性反應(yīng)在平喘湯發(fā)揮哮喘治療作用中有著重要作用。

目前，臨床上針對(duì)患兒哮喘常用的抗炎藥，如糖皮質(zhì)激素、白三烯受體拮抗藥等，雖能短期內(nèi)控制氣道炎性反應(yīng)，緩解癥狀，但長(zhǎng)期用藥可導(dǎo)致免疫功能低下、骨質(zhì)疏松等不良反應(yīng)[13]。因此，臨床急需尋找安全、有效、經(jīng)濟(jì)且不良反應(yīng)小的哮喘治療藥物方案。中醫(yī)藥大多為天然植物，其相對(duì)價(jià)廉，不良反應(yīng)小，可作為理想選擇。本院自擬平喘湯是邵氏肺科傳人夏以琳教授在張仲景的“三拗湯”的基礎(chǔ)上擬定而成，以炙麻黃、蟬蛻宣肺解痙平喘;杏仁、地龍宣降肺氣、解痙止咳平喘;黃芩清熱潤(rùn)肺;辛夷祛風(fēng)通竅;射干、蘇梗溫肺下氣、化痰止咳等，調(diào)和諸藥。具有宣降肺氣，理氣祛痰，止咳平喘之功效。前期研究發(fā)現(xiàn)，平喘湯可降低哮喘患兒及動(dòng)物模型炎性反應(yīng)因子IL-17、IL-33及TNF-α表達(dá)水平，減輕氣道炎性反應(yīng)癥狀[14]。本研究通過(guò)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)，平喘湯可有效降低哮喘后細(xì)胞總數(shù)計(jì)數(shù)，抑制中性粒細(xì)胞、嗜酸性細(xì)胞、淋巴細(xì)胞及巨噬細(xì)胞聚集，下調(diào)BALF中炎性反應(yīng)因子IL-1β、IL-6、TNF-α、MCP-1及IL-18表達(dá)。結(jié)合前期研究，這些結(jié)果提示平喘湯可以通過(guò)抑制炎性反應(yīng)，緩解哮喘癥狀。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果同時(shí)指出平喘湯能夠有效降低哮喘小鼠行為學(xué)評(píng)分，減少打噴嚏、抓鼻次數(shù)，緩解呼吸急促程度，提示平喘湯可顯著改善哮喘臨床癥狀，提高患兒生命質(zhì)量[15]。

前期研究報(bào)道，NLRP3炎癥小體作為固有免疫及適應(yīng)性免疫系統(tǒng)中的重要成分，在哮喘氣道慢性炎癥的發(fā)生和發(fā)展中發(fā)揮著至關(guān)重要的作用，其可從上游觸發(fā)及調(diào)節(jié)氣道炎性反應(yīng)，參與氣道高反應(yīng)性和重塑過(guò)程[16-17]。NLRP3炎癥小體由NLRP3、接頭蛋白ASC和caspase-1組成，當(dāng)細(xì)胞受到各種有害刺激后，一方面，NLRP3通過(guò)與ASC相互作用，激活核因子-κB（NF-κB），促進(jìn)炎性反應(yīng)因子前體（pro-IL-1β、pro-IL-18）或炎性反應(yīng)因子（如IL-6、TNF-α、MCP-1等）表達(dá)。另一方面，NLRP3與ASC結(jié)合后能夠招募pro-caspase-1即caspase-1前體，形成蛋白復(fù)合體，生成具有生物學(xué)活性的成熟體caspase-1，后者可剪切炎性反應(yīng)因子前體pro-IL-1β及pro-IL-18，使其活化為具有促炎活性的成熟體炎性反應(yīng)因子IL-1β及IL-18。由此可見(jiàn)，NLRP3炎癥小體的活化是啟動(dòng)炎癥級(jí)聯(lián)反應(yīng)和造成炎性反應(yīng)損傷的核心環(huán)節(jié)。IL-1β是一種促進(jìn)和放大炎性反應(yīng)的細(xì)胞因子，能夠招募淋巴細(xì)胞、中性粒細(xì)胞及巨噬細(xì)胞等免疫細(xì)胞聚集，刺激嗜酸性粒細(xì)胞活化，誘導(dǎo)NF-κB炎性通路激活，促進(jìn)IL-6、TNF-α及MCP-1生成，進(jìn)而加劇氣道慢性炎癥[18]。IL-18能夠調(diào)節(jié)Th1/Tc1極化，且可通過(guò)T細(xì)胞促進(jìn)Th2細(xì)胞炎性反應(yīng)因子，如IL-4、IL-5、IL-9和IL-13等釋放，從而加劇肺部局部炎性反應(yīng)，造成氣道高反應(yīng)性[19]。Li R等[20]研究發(fā)現(xiàn)，哮喘后NLRP3炎癥小體活化，其介導(dǎo)生成的IL-1β和IL-18可明顯觸發(fā)氣道炎性反應(yīng)，其表達(dá)與哮喘嚴(yán)重程度密切相關(guān)。相反，抑制哮喘后NLRP3炎癥小體活化能夠有效減輕哮喘嚴(yán)重程度，減輕氣道炎性反應(yīng)，降低氣道高反應(yīng)性[5，21]。本研究亦發(fā)現(xiàn)NLRP3炎癥小體在哮喘肺組織中激活，其可有效觸發(fā)局部炎性反應(yīng)，加劇哮喘嚴(yán)重程度;但給予本院自擬平喘湯治療后，肺組織NLRP3炎癥小體表達(dá)及活性受到明顯抑制，其所介導(dǎo)的炎性反應(yīng)亦顯著降低，證實(shí)平喘湯對(duì)哮喘的治療作用是通過(guò)抑制NLRP3炎癥小體介導(dǎo)的炎癥級(jí)聯(lián)反應(yīng)實(shí)現(xiàn)的。

值得注意的是，雖然平喘湯可顯著降低氣道炎性反應(yīng)，但NLRP3炎癥小體及其下游靶向炎性反應(yīng)因子仍明顯高于空白組，說(shuō)明平喘藥不能短期內(nèi)從根本上逆轉(zhuǎn)哮喘后氣道炎性反應(yīng)的病理生理學(xué)改變，這也是中醫(yī)學(xué)強(qiáng)調(diào)哮喘患兒需長(zhǎng)期同本（補(bǔ)肺健脾益腎）治療的重要原由。此外，與徐增梅等[22]研究結(jié)果不同，我們發(fā)現(xiàn)平喘湯對(duì)哮喘的療效低于地塞米松，這可能與動(dòng)物模型和藥方配比不同有關(guān)。

綜上所述，平喘湯可通過(guò)抑制NLRP3炎癥小體活化所介導(dǎo)的炎癥級(jí)聯(lián)反應(yīng)，減輕氣道慢性炎癥，緩解哮喘呼吸道癥狀，改善預(yù)后。本研究在國(guó)家大力發(fā)展中醫(yī)藥和民族醫(yī)藥事業(yè)的背景下，以?xún)嚎婆R床需要為出發(fā)點(diǎn)，探析經(jīng)驗(yàn)藥方的作用及其分子機(jī)制，為患兒哮喘的臨床治療提供理論依據(jù)和意見(jiàn)參考。

參考文獻(xiàn)

[1]Zhou X，Hong J.Pediatric asthma management in China：current and future challenges[J].Paediatr Drugs，2018，20（2）：105-110.

[2]Barnig C，F(xiàn)rossard N，Levy BD.Towards targeting resolution pathways of airway inflammation in asthma[J].Pharmacol Ther，2018，186：98-113.

[3]Schroder K，Tschopp J.The inflammasomes[J].Cell，2010，140：821-832.

[4]Jo EK，Kim JK，Shin DM，et al.Molecular mechanisms regulating NLRP3 inflammasome activation[J].Cell Mol Immunol，2016，13：148-159.

[5]Sethi GS，Sharma S，Naura AS，et al.PARP inhibition by olaparib alleviates chronic asthma-associated remodeling features via modulating inflammasome signaling in mice[J].IUBMB Life，2019，71（7）：1003-1013.

[6]李敬華.平喘湯治療支氣管哮喘療效觀察[J].陜西中醫(yī)，2014，35（4）：391-392.

[7]李冬梅，楊志華，劉曉霞，等.止咳平喘湯治療小兒咳嗽變異性哮喘32例[J].西部中醫(yī)藥，2014，27（4）：102-103.

[8]余曉芬.平喘湯治療小兒非急性期哮喘的臨床療效觀察[J].中國(guó)醫(yī)藥科學(xué)，2018，8（10）：69-71.

[9]Henderson WR Jr，Lewis DB，Albert RK，et al.The importance of leukotrienes in airway inflammation in a mouse model of asthma[J].J Exp Med，1996，184（4）：1483-1494.

[10]陳奇.中藥藥理研究方法學(xué)[M].北京：人民衛(wèi)生出版社，2006：33.

[11]劉建文，季光，魏東芝，等.藥理實(shí)驗(yàn)方法學(xué)：新技術(shù)與新方法[M].北京：化學(xué)工業(yè)出版社，2003，136：141.

[12]Chiu GS，Chatterjee D，Darmody PT，et al.Hypoxia/reoxygenation impairs memory formation via adenosine-dependent activation of caspase-1[J].J Neurosci，2012，32：13945-13955.

[13]竇金麗，陳靜，楊青慧.健康教育對(duì)支氣管哮喘患者吸入糖皮質(zhì)激素口咽部不良反應(yīng)的影響[J].世界最新醫(yī)學(xué)信息文摘，2016，58：172.

[14]馮高華，朱虹，孫峰，等.平喘湯對(duì)支氣管哮喘大鼠肺組織IgE、TGF-β1，及TNF-α的影響[J].中藥新藥與臨床藥理，2011，16（3）：273-276.

[15]李草旎，陳雪莉.自擬平喘湯配合GINA階梯方案對(duì)支氣管哮喘患兒血清IL-17、IL-33水平及生活質(zhì)量的影響[J].現(xiàn)代中西醫(yī)結(jié)合雜志，2016，25（29）：3205-3207.

[16]Liu Y，Gao X，Miao Y，et al.NLRP3 regulates macrophage M2 polarization through up-regulation of IL-4 in asthma[J].Biochem J，2018，475（12）：1995-2008.

[17]Kim RY，Pinkerton JW，Essilfie AT.Role for NLRP3 inflammasome-mediated，IL-1β-dependent responses in severe，steroid-resistant asthma[J].Am J Respir Crit Care Med，2017，196（3）：283-297.

[18]Liao Z，Xiao T，Zhang Y，et al.IL-1β：a key modulator in asthmatic airway smooth muscle hyper-reactivity[J].Expert Rev Respir Med，2015，9（4）：429-436.

[19]Kawayama T，Okamoto M，Imaoka H，et al.Interleukin-18 in pulmonary inflammatory diseases[J].J Interferon Cytokine Res，2012，32（10）：443-439.

[20]Li R，Wang J，Li R，et al.ATP/P2X7-NLRP3 axis of dendritic cells participates in the regulation of airway inflammation and hyper-responsiveness in asthma by mediating HMGB1 expression and secretion[J].Exp Cell Res，2018，366（1）：1-15.

[21]Liu X，Shen J，F(xiàn)an D，et al.Yupingfeng San inhibits NLRP3 inflammasome to attenuate the inflammatory response[J].Front Pharmacol，2017，8：944.

[22]徐增梅，丁偉偉，李澤庚.麻芍平喘湯對(duì)哮喘大鼠氣道重塑及TGF-β1、PDGF-BB的影響[J].天津中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報(bào)，2017，36（2）：123-127.

（2019-11-04收稿 責(zé)任編輯：徐穎）