任方芳，趙太強(qiáng)

四川省醫(yī)學(xué)科學(xué)院/四川省人民醫(yī)院/電子科技大學(xué)附屬醫(yī)院檢驗(yàn)科，成都 610072

順鉑(cisplatin，DDP)是廣泛應(yīng)用于多種實(shí)體腫瘤的有效抗癌藥物，其作用機(jī)制為誘發(fā)DNA雙鏈間或鏈內(nèi)相鄰兩個(gè)鳥嘌呤之間產(chǎn)生交聯(lián)，引起DNA損傷[1-3]。DDP的臨床應(yīng)用主要受到其耐藥性的限制[4-5]。對(duì)耐藥細(xì)胞株的研究發(fā)現(xiàn)，DDP耐藥是由多種因素導(dǎo)致的，包括細(xì)胞內(nèi)藥物運(yùn)輸系統(tǒng)功能異常導(dǎo)致胞內(nèi)有效藥物濃度不足[6]，強(qiáng)化的DNA修復(fù)系統(tǒng)導(dǎo)致細(xì)胞能夠耐受藥物引起的DNA損傷[7]，抗凋亡信號(hào)通路異?；罨萚8]。最近研究發(fā)現(xiàn)，谷胱甘肽(GSH)作為胞內(nèi)重要的解毒劑，可能參與鉑類耐藥。DDP作用產(chǎn)生的活性氧簇(reactive oxygen species，ROS)具有細(xì)胞毒作用，而GSH依賴還原性巰基與過氧化物結(jié)合，可促進(jìn)ROS及時(shí)清除，具有細(xì)胞保護(hù)作用[9-11]。卵巢癌是婦科常見的惡性腫瘤，病死率居?jì)D科腫瘤性疾病之首[12]，耐藥是其預(yù)后較差的關(guān)鍵因素，尋找潛在的藥物耐受靶點(diǎn)對(duì)提供可行的用藥選擇具有指導(dǎo)意義。本研究以二代蛋白酶體抑制劑Oprozomib (OZ)[13]作為增敏劑，研究其對(duì)DDP耐藥卵巢癌細(xì)胞SKOV3/DDP和A2780/DDP的作用及機(jī)制，以期為改善耐藥卵巢癌患者的預(yù)后提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1主要試劑及儀器 SKOV3/DDP、A2780/DDP細(xì)胞株(上海酶研生物科技有限公司)；CCK-8檢測(cè)試劑盒(上海七海復(fù)泰生物科技有限公司)；GSH、ROS檢測(cè)試劑盒(上海碧云天生物技術(shù)有限公司)；蛋白酶體活性檢測(cè)試劑盒(美國(guó)A bcam公司)；DDP、OZ、四甲基哌啶(Tempol)(美國(guó)Selleck公司)；兔抗人谷胱甘肽合成酶(GSS) IgG單克隆抗體(美國(guó)Cell Signaling Technology公司)；辣根過氧化物標(biāo)記的山羊抗兔IgG(美國(guó)Santa Cruz公司)；GSH分子(美國(guó)Sigma-Aldrich公司)。FLx800TM熒光/發(fā)光酶標(biāo)儀(美國(guó)Biotek公司)；Cytomics FC 500流式細(xì)胞儀(美國(guó)Beckman公司)；ChemiDoc化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)(美國(guó)Bio-Rad公司)。

1.2細(xì)胞培養(yǎng) 用含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基于37 ℃、5% CO2孵育箱中培養(yǎng)SKOV3/DDP、A2780/DDP細(xì)胞株，每24 h換液一次，待融合至90%時(shí)傳代，選取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

1.3CCK-8法檢測(cè)細(xì)胞活力 將SKOV3/DDP、A2780/DDP細(xì)胞分別以1×104個(gè)細(xì)胞/孔接種于96孔板，待細(xì)胞貼壁后，加入藥物進(jìn)行處理。研究OZ對(duì)細(xì)胞活力的影響時(shí)，將OZ設(shè)為9個(gè)濃度梯度(0、3、9、27、81、243、729、2187、6561 nmol/L)， 與細(xì)胞共培養(yǎng)24 h。研究DDP對(duì)細(xì)胞活力的影響時(shí)，根據(jù)處理因素不同分為DPP組和DDP+OZ組：DDP+OZ組加入500 nmol/L OZ 50 ml，其工作濃度為125 nmol/L，DDP組加入相應(yīng)體積的溶劑。3 h后，兩組均加入相應(yīng)濃度DDP(0、3、9、27、81、243、729、2181、6561 nmol/L)至終體積200 μl，24 h時(shí)每孔加入20 μl CCK-8溶液，37 ℃避光孵育30～60 min，采用FLx800TM熒光/發(fā)光酶標(biāo)儀檢測(cè)450 nm波長(zhǎng)處的吸光度(OD)值，計(jì)算IC50。IC50=最小值+(最大值-最小值)/[1+10(logEC50-X)×最大斜率的絕對(duì)值]。

1.4流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡情況 將SKOV3/DDP、A2780/DDP細(xì)胞分別以5×105/孔密度接種于6孔板，待細(xì)胞貼壁后，根據(jù)處理因素不同分為對(duì)照組、DDP組(各細(xì)胞在OZ作用下的IC50濃度)、OZ組(各細(xì)胞的IC50濃度)和DDP+OZ組。采用0.5%胰酶消化收集處理細(xì)胞，500 r/min離心5min，棄上清，用預(yù)冷的PBS洗3次，離心后用結(jié)合緩沖液重懸細(xì)胞，調(diào)整濃度為1×106個(gè)/ml，混勻后取100 μl，加入鈣磷脂結(jié)合蛋白-Ⅴ(Annexin-Ⅴ)和溴化丙錠(PI)各5 μl，室溫避光染色20 min，采用Cytomics FC 500流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡情況。

1.5蛋白酶體糜蛋白酶(CT-L)活性檢測(cè) 實(shí)驗(yàn)分為對(duì)照組和OZ組。研究不同濃度OZ對(duì)蛋白酶體CT-L活性的影響時(shí)，OZ組采用0～512 nmol/L(覆蓋IC50值)濃度梯度處理細(xì)胞。研究OZ處理時(shí)間對(duì)蛋白酶體CT-L活性的影響時(shí)，將固定濃度(IC50)OZ與細(xì)胞共培養(yǎng)12、24 h。收集細(xì)胞，4 ℃下PBS洗3次，0.5% NP-40重懸裂解，4 ℃下12 000 g離心15 min，取上清20 μl，稀釋至100 μl，加入1 μl底物，37 ℃避光孵育30 min，采用FLx800TM熒光/發(fā)光酶標(biāo)儀進(jìn)行檢測(cè)(激發(fā)光波長(zhǎng)為350 nm，發(fā)射光波長(zhǎng)為440 nm)，計(jì)算相對(duì)熒光單位(RFU)。

1.6Western blotting檢測(cè)GSS蛋白表達(dá)水平 實(shí)驗(yàn)分為對(duì)照組和OZ組[固定濃度(IC50)OZ與細(xì)胞共培養(yǎng)]。24 h后收集細(xì)胞，用RIPA裂解液4 ℃裂解30 min，12 000 g離心15 min，取上清，采用BCA法進(jìn)行蛋白定量，加入相應(yīng)體積5×上樣緩沖液，SDS-PAGE電泳分離蛋白(濃縮膠、分離膠聚丙烯酰胺濃度分別為8%、10%)，每組上樣20 μg，采用兩步法(S1：80 V，15 min；S2：100 V，1.5 h)電泳，250 mA橫流轉(zhuǎn)膜1 h，5%脫脂奶粉4 ℃封閉過夜。GSS一抗(1:1000)4 ℃孵育過夜，辣根過氧化物酶標(biāo)記的山羊抗兔IgG二抗(1:2000)室溫孵育1 h。采用ChemiDoc化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)進(jìn)行檢測(cè)，Image J軟件計(jì)算各條帶灰度值，半定量分析GSS蛋白表達(dá) 水平。

1.7GSH水平檢測(cè) 實(shí)驗(yàn)分為對(duì)照組和OZ組[固定濃度(IC50)OZ與細(xì)胞共培養(yǎng)]。收集細(xì)胞，參照GSH檢測(cè)試劑盒說明書步驟，采用FLx800TM熒光/發(fā)光酶標(biāo)儀檢測(cè)412 nm波長(zhǎng)處的OD值，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算GSH濃度。

1.8R O S 水平檢測(cè) 實(shí)驗(yàn)分為對(duì)照組、D D P組、OZ組、DDP+OZ組、DPP+OZ+GSH組和D P P+O Z+Te m p o l 組。D D P、O Z 濃 度 如 上 所述，DPP+OZ+GSH組另加入50 μmol/L GSH，DPP+OZ+Tempol組另加入1 μmol/L Tempol。24 h后收集細(xì)胞，參照ROS檢測(cè)試劑盒說明書步驟，采用FLx800TM熒光/發(fā)光酶標(biāo)儀(激發(fā)光為488 nm，發(fā)射光為525 nm)檢測(cè)ROS水平。

1.9統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS 19.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。計(jì)量資料用±s表示，多組間比較采用單因素方差分析，進(jìn)一步兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1O Z 和D D P 對(duì)耐藥卵巢癌細(xì)胞活性的影響 C C K-8 法檢測(cè)結(jié)果顯示，O Z 濃度范圍為3～6500 nmol/L時(shí)，SKOV3/DDP、A2780/DDP細(xì)胞的IC50分別為140、350 nmol/L，選取該濃度進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)(圖1A)。無OZ作用時(shí)，DDP在兩株細(xì)胞中的IC50分別為10 120、6040 nmol/L；與OZ聯(lián)用時(shí)，DDP在兩株細(xì)胞中的IC50分別降至154、232 nmol/L， 選取該濃度進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)(圖1B)。

圖1 OZ和DDP對(duì)耐藥卵巢癌細(xì)胞活性的影響(n=4)Fig.1 Effects of OZ and DDP on the activities of SKOV3/DDP and A2780/DDP cells (n=4)

2.2OZ增強(qiáng)耐藥卵巢癌細(xì)胞對(duì)DDP的敏感性 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)結(jié)果顯示，與各自對(duì)照組比較，使用DDP處理SKOV3/DDP、A2780/DDP細(xì)胞時(shí)，兩株細(xì)胞的凋亡率(SKOV3/DDP為4.94%±4.29%，A2780/DDP為3.93%±2.89%)差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；與各自DDP組比較，DDP與OZ聯(lián)用時(shí)，兩株細(xì)胞的凋亡率均明顯增高(SKOV3/DDP為30.88%±4.84%，A2780/DDP為40.94%±11.40%，P<0.01，圖2)。

2.3OZ抑制耐藥卵巢癌細(xì)胞蛋白酶體CT-L活性

蛋白酶體CT-L活性檢測(cè)結(jié)果顯示，OZ抑制CT-L活性的作用隨濃度增加而增強(qiáng)，并呈劑量依賴性(圖3A)。OZ處理12 h時(shí)，與對(duì)照組比較，OZ組SKOV3/DDP、A2780/DDP細(xì)胞CT-L活性均明顯降低[分別為(174.43±67.34) U vs. (562.30±33.94) U、(281.23±55.93) U vs. (682.03±139.32) U，P<0.01]；OZ處理24 h時(shí)，與對(duì)照組比較，OZ組SKOV3/DDP、A2780/DDP細(xì)胞CT-L活性均明顯降低[(404.32±39.91) U vs. (610.23±81.94) U、(394.55±29.93) U vs. (893.90±39.50) U，P<0.01]。與OZ處理12 h時(shí)比較，OZ處理24 h時(shí)兩株細(xì)胞CT-L活性差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05，圖3)。

2.4OZ抑制耐藥卵巢癌細(xì)胞內(nèi)GSH合成 GSH水平檢測(cè)結(jié)果顯示，OZ可明顯抑制SKOV3/DDP、A2780/DDP胞內(nèi)GSH生成(P<0.01，圖4A)。OZ處理12h時(shí)，與對(duì)照組比較，OZ組兩株細(xì)胞內(nèi)GSH水平均明顯降低[(4.85±2.33) μmol/L vs. (15.45±3.84) μmol/L、(5.34±1.39) μmol/L vs. (27.43±4.90) μmol/L，P<0.01]。Western blotting檢測(cè)結(jié)果顯示，與各自對(duì)照組比較，兩株細(xì)胞GSS蛋白表達(dá)水平均明顯降低(P<0.01，圖4B)。

2.5OZ抑制耐藥卵巢癌細(xì)胞內(nèi)ROS清除 ROS水平檢測(cè)結(jié)果顯示，與對(duì)照組比較，DDP組SKOV3/DDP、A2780/DDP胞內(nèi)ROS水平無明顯變化，OZ組、DDP+OZ組兩株細(xì)胞內(nèi)ROS水平均升高(P<0.05或P<0.01)。與DDP+OZ組比較，DDP+OZ+GHS組兩株細(xì)胞內(nèi)ROS水平均明顯降低(P<0.05，圖5)。

圖2 OZ對(duì)耐藥卵巢癌細(xì)胞順鉑敏感性的影響(n=3)Fig.2 Effect of OZ on DDP sensitivity of SKOV3/DDP and A2780/DDP cells (n=3)

圖3 OZ對(duì)耐藥卵巢癌細(xì)胞蛋白酶體糜蛋白酶活性的影響(n=4)Fig.3 Effect of OZ on the activity of proteasome chymotrypsin in SKOV3/DDP and A2780/DDP cells (n=4)

圖4 OZ對(duì)耐藥卵巢癌細(xì)胞內(nèi)GSH合成、GSS蛋白表達(dá)的影響Fig.4 Effect of OZ on GSH synthesis and GSS expression in SKOV3/DDP and A2780/DDP cells

2.6ROS清除劑Tempol逆轉(zhuǎn)OZ對(duì)DDP的增敏作用 ROS水平檢測(cè)結(jié)果顯示，在兩株細(xì)胞中，Tempol導(dǎo)致DDP+OZ聯(lián)用提高的ROS水平降低(P<0.05，P<0.01，圖6A)。細(xì)胞凋亡檢測(cè)結(jié)果顯示，與DDP+OZ組相比，DDP+OZ+Tempol組SKOV3/DDP、A2780/DDP細(xì)胞凋亡率均明顯降低(12.43%±3.10% vs. 37.59%±4.33%、22.49%±5.66% vs. 58.39%±10.86%，P<0.01，圖6B、C)。

圖5 OZ抑制耐藥卵巢癌細(xì)胞內(nèi)ROS清除(n=4)Fig.5 OZ inhibits the ROS clearance in SKOV3/DDP and A2780/DDP cells (n=4)

3 討 論

OZ作為第二代具有口服生物活性的蛋白酶體抑制劑，可與蛋白酶體N端蘇氨酸共價(jià)結(jié)合抑制20S亞基的CT-L活性[14]。蛋白酶體抑制劑可有效抑制20S蛋白酶體活性，誘發(fā)氧化應(yīng)激而發(fā)揮殺傷腫瘤細(xì)胞的作用[15]。GST是胞內(nèi)至關(guān)重要的抗氧化酶，可調(diào)節(jié)多種ROS毒性，發(fā)揮細(xì)胞保護(hù)作用，其含量或活性異常與腫瘤的發(fā)生發(fā)展有關(guān)。卵巢癌細(xì)胞內(nèi)GST水平顯著高于正常細(xì)胞，GST及其同工酶的表達(dá)和活性與卵巢癌的預(yù)后呈負(fù)相關(guān)[16]。GST參與腫瘤細(xì)胞對(duì)化療藥物的耐藥。在DDP耐藥卵巢癌細(xì)胞中，GST活性明顯高于敏感株[17]；在乳腺癌細(xì)胞中，抑制GST活性可明顯逆轉(zhuǎn)細(xì)胞對(duì)多柔比星的耐藥[18]。GST參與細(xì)胞耐藥并催化機(jī)體內(nèi)親電性化合物與GSH結(jié)合，后者作為胞內(nèi)重要的還原劑，在細(xì)胞對(duì)抗氧化應(yīng)激、中和ROS毒性過程中起至關(guān)重要的作用。GSH可促使有毒化合物增加水溶性、減少毒性，最終排出胞外[19]。GST作為下游重要的效應(yīng)分子，可干擾GSH的清道夫作用，可能具有潛在的逆轉(zhuǎn)腫瘤耐藥作用。本研究以耐藥卵巢癌細(xì)胞應(yīng)對(duì)氧化應(yīng)激的能力為切入點(diǎn)尋找潛在的耐藥靶點(diǎn)。

本研究發(fā)現(xiàn)，在效應(yīng)層面，OZ可有效協(xié)助DDP誘導(dǎo)耐藥卵巢癌細(xì)胞凋亡，而DDP或OZ單獨(dú)作用均不能有效誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡；OZ單獨(dú)作用可提高ROS水平，但與DDP+OZ聯(lián)用相比，提高幅度有限，推測(cè)大幅度提高的ROS是誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的主要原因。GSH廣泛存在于正常細(xì)胞內(nèi)。藥物處理可誘導(dǎo)細(xì)胞產(chǎn)生大量ROS，導(dǎo)致抗氧化系統(tǒng)能力相對(duì)降低，使細(xì)胞質(zhì)膜發(fā)生脂質(zhì)過氧化，引發(fā)持續(xù)的細(xì)胞損傷甚至凋亡。GSH依賴其活性巰基(-SH)等功能基團(tuán)與ROS結(jié)合，保護(hù)細(xì)胞重要蛋白巰基不被后者氧化[17]。本研究為證實(shí)GSH與ROS之間的關(guān)系，在DDP+OZ聯(lián)用時(shí)加入外源GSH，有效降低了ROS水平，提示GSH合成受阻與ROS水平升高有直接關(guān)系。本研究為證明ROS過剩是提高DDP敏感性的關(guān)鍵，在DDP+OZ聯(lián)用時(shí)加入ROS清除劑Tempol，明顯降低了ROS水平，細(xì)胞凋亡率亦明顯下降，表明降低ROS水平對(duì)細(xì)胞具有保護(hù)作用。此外，本研究結(jié)果顯示，OZ可下調(diào)GSS表達(dá)，進(jìn)而減少GSH合成，GSH合成抑制后，ROS水平明顯升高。

綜上，筆者推測(cè)強(qiáng)化的ROS清除能力參與了DDP耐藥，GSH可通過清除ROS發(fā)揮細(xì)胞保護(hù)作用。在耐藥卵巢癌細(xì)胞中，DDP未能有效提高ROS水平可能是細(xì)胞耐藥的關(guān)鍵，而OZ存在時(shí)，GSH減少導(dǎo)致ROS清除能力受阻，依賴后者的細(xì)胞毒作用誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。