鐘益寧，藍(lán) 富，鐘成勇

（廣西中醫(yī)藥大學(xué)，廣西 南寧 530299）

肉桂又名玉桂，為樟科植物肉桂Cinnamomum cassiaPresl的干燥樹皮，最早在《神農(nóng)本草經(jīng)》中記載，為臨床常用的溫里藥[1]。肉桂作為藥食兩用藥材，廣泛應(yīng)用于醫(yī)藥、食品、日化等領(lǐng)域[2-3]。對肉桂化學(xué)成分和藥理作用的研究表明，肉桂含有豐富的多酚類化學(xué)成分，具有抗菌、抗腫瘤、抗氧化、降血糖、調(diào)節(jié)血脂等多方面的藥理作用[4-10]。為了進(jìn)一步開發(fā)利用廣西豐富的肉桂資源，充分利用肉桂枝葉豐富的多酚成分，變廢為寶，本文對提油后非揮發(fā)部分殘渣中含有的肉桂枝葉多酚（簡稱CBLP）進(jìn)行富集純化研究，以CBLP的吸附率與解析率為指標(biāo)，比較了6種HPD型樹脂對CBLP的靜態(tài)吸附與解吸性能，篩選出最佳樹脂并對其進(jìn)行動態(tài)吸附和解吸實(shí)驗(yàn)，以確定其富集純化CBLP的最佳工藝條件，為進(jìn)一步開發(fā)利用肉桂枝葉殘渣的多酚成分提供理論依據(jù)[11-14]。

1 試劑和儀器

1.1 藥材

肉桂枝葉是提取桂油后的肉桂枝葉非揮發(fā)部分殘渣經(jīng)粉碎得到的粗粉。

1.2 儀器

LP302A型電子天平，電子分析天平，8453紫外可見分光光度計，RE-52系列旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，TGL-16G離心機(jī)，KQ5200B超聲波清洗儀，KQ-B玻璃儀器氣流烘干器，DHG-9023A 電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱，HH-S 恒溫水浴鍋。

1.3 藥品和試劑

樹脂 HPD100、HPD300、HPD450、HPD600、HPD750、HPD826，鎢酸鈉、鉬酸鈉、硫酸鋰、溴水、無水碳酸鈉、甲醇、無水乙醇(均為分析純)，蒸餾水，沒食子酸對照品，磷酸鹽緩沖液(pH=7.5)，福林酚試劑(按要求配制)。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 肉桂枝葉殘渣提取液的制備

稱取提油后的干燥肉桂枝葉粗粉200g，用30%、50%、70%的乙醇各0.5L為提取溶劑，依次回流提取，每次2 h。合并濾液，回收乙醇，以蒸餾水定容至 1000 mL（生藥 /粗提液，200 mg·mL-1），備用。

2.2 Folin-Ciocelteu法測定CBLP含量

2.2.1 對照品溶液的制備

精密稱取0.100g沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)品，加少量95%乙醇超聲溶解，用蒸餾水定容至100 mL，取25mL定容至250mL，制備成0.1mg·mL-1的對照品溶液。

2.2.2 樣品溶液的制備

取一定量的肉桂枝葉殘渣提取液，用蒸餾水稀釋 50倍（生藥 /粗提液，4.0 mg·mL-1），用于測定其多酚濃度。

2.2.3 福林試劑的制備

10g鎢酸鈉和2.5g鉬酸鈉，用70mL純凈水溶于250mL燒瓶中，加入5.0mL磷酸和10mL濃鹽酸混勻，微沸回流2h。加入15g硫酸鋰、5.0mL純凈水和3滴溴水（邊加邊搖），開口沸騰15min（至溴水揮盡），放冷，用水定容至100mL，過濾，置于棕色瓶中保存。使用時加入1倍量的蒸餾水稀釋。

2.2.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

準(zhǔn) 確 吸 取 5.0、7.5、10.0、12.5、15.0、17.5、20.0、22.5mL標(biāo)準(zhǔn)溶液定容至50mL，分別得到濃度為10、15、20、25、30、35、40、45μg·mL-1的溶液。從上述溶液中，分別移取1.0mL加入福林試劑1.0mL、16%碳酸鈉溶液3.0mL，定容至10 mL。以蒸餾水為空白，在765 nm處測定吸光度，得到?jīng)]食子酸濃度(x)與吸光度(y)的線性回歸方程為：y=0.0127x+0.0194，r2=0.9991，在10～45μg·mL-1濃度范圍內(nèi)，吸光度與質(zhì)量濃度呈良好的線性關(guān)系。

2.2.5 CBLP含量的測定

取1.0mL樣品溶液于10mL容量瓶中（生藥/粗提液，0.4 mg·mL-1），按 2.2.4的方法測定吸光度，計算樣品溶液中的多酚濃度。

2.3 樹脂靜態(tài)吸附和解吸實(shí)驗(yàn)

2.3.1 樹脂預(yù)處理

分別稱取6種HPD型樹脂，先用蒸餾水浮選，然后依次用5%鹽酸溶液浸泡24h，蒸餾水洗至中性，5%的氫氧化鈉溶液浸泡24h，蒸餾水洗至中性，95%乙醇浸泡24h，蒸餾水洗至無醇味、無白色渾濁，備用。

2.3.2 上樣溶液的制備

取一定量的肉桂枝葉殘渣提取液，用蒸餾水分別稀釋成 1/7、2/7、3/7、4/7、5/7 等倍數(shù)，濃度分別為1.0、2.0、3.0、4.0、5.0mg·mL-1，用于大孔樹脂上樣和吸附。

2.3.3 樹脂的初篩

分別精密稱取預(yù)處理的6種大孔樹脂各1.0 g于錐形瓶中，分別加入3.0 mg·mL-1的提取液20mL，置于恒溫振蕩器，25℃下振蕩12h。吸附平衡后取上清液測定。抽濾分離，精密稱取1.0g吸附飽和的樹脂于錐形瓶中，加入60%乙醇20mL，25℃下在恒溫振蕩器上振蕩6h。取解吸液測定，按2.2.5方法，分別測定未吸附和解吸液的CBLP質(zhì)量濃度，按式（1）、（2）、（3）計算樹脂對 CBLP 的吸附量、吸附率和解吸率。

式中，C0為吸附前樣液中CBLP的濃度，mg·mL-1；C1為吸附后上清液中CBLP的濃度，mg·mL-1；C2為解吸液中 CBLP 的濃度，mg·mL-1；W為樹脂質(zhì)量，g；V0為樣品溶液的體積，mL；V1為吸附溶液的體積，mL；V2為解吸溶液的體積，mL。

2.3.4 理想樹脂的篩選

根據(jù)吸附量、吸附率和解吸率，選擇相對理想的HPD100和HPD750做進(jìn)一步對比，考察樣液濃度、吸附時間、樣液pH以及洗脫劑濃度等因素的影響，優(yōu)選出理想的樹脂。

1）樣液濃度的影響。精密稱取5份經(jīng)預(yù)處理的HPD100和HPD750樹脂各1.0 g于錐形瓶中，加入 20mL 濃度分別為 1.0、2.0、3.0、4.0、5.0mg·mL-1的CBLP溶液，置于恒溫振蕩器，25℃下振蕩吸附12h，計算吸附量和吸附率，考察樣液濃度對樹脂吸附的影響。

2）吸附時間的影響。精密稱取經(jīng)預(yù)處理的HPD100和HPD750樹脂各1.0g于錐形瓶中，加入20mL濃度為3.0mg·mL-1的CBLP溶液，置于恒溫振蕩器，25℃下振蕩吸附。每隔1h取上清液測定多酚含量，計算吸附量和吸附率，考察吸附時間對樹脂吸附的影響。

3）樣液pH的影響。精密稱取5份經(jīng)預(yù)處理的HPD100和HPD750樹脂各1.0 g于錐形瓶中，加入3.0mg·mL-1的CBLP溶液20mL，分別用鹽酸調(diào)節(jié)溶液 pH 為 2、3、4、5、6，置于 25℃搖床振蕩吸附12h。取上清液測定多酚含量，計算吸附量和吸附率，考察上樣液pH對樹脂吸附的影響。

4）洗脫劑濃度的影響。精密稱取1.0g吸附飽和的HPD100和HPD750樹脂各5份于錐形瓶中，加入30mL體積比濃度分別為10%、20%、40%、60%、80%的乙醇，25℃下恒溫?fù)u床解吸6h。取上清液測定CBLP的含量，計算解吸率，考察洗脫劑濃度對樹脂解吸的影響。

2.4 動態(tài)吸附和解吸實(shí)驗(yàn)

在靜態(tài)吸附和解吸實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，考察上樣流速和洗脫液流速、用量對動態(tài)吸附和解吸的影響。

2.4.1 吸附流速的影響

HPD100樹脂濕法裝柱，上樣濃度3.0mg·mL-1（pH=4），控制吸附流速分別為 1、2、3、4 BV·h-1。收集流出液，以10.0mL為1份，測定多酚含量，考察上樣流速對動態(tài)吸附的影響。

2.4.2 解吸流速的影響

HPD100樹脂濕法裝柱，上樣濃度3.0mg·mL-1（pH=4），動態(tài)吸附飽和的樹脂用適宜濃度的乙醇（pH=4）洗脫，分別在2、3、4 BV·h-1流速下解吸。收集流出液，以10.0 mL為1份，測定多酚含量，考察洗脫流速對解吸的影響。

2.4.3 洗脫劑用量的影響

HPD100樹脂濕法裝柱，上樣濃度3.0mg·mL-1（pH=4），動態(tài)吸附飽和的樹脂先以3 BV·h-1流速水洗，再按2.3.4中確定的乙醇濃度（pH=4）洗脫，收集洗脫液，測定多酚含量，考察洗脫劑用量對動態(tài)解吸及多酚收率的影響。

2.5 樹脂篩選的驗(yàn)證

按照上述篩選的上樣濃度（3.0mg·mL-1）、速度（3BV·h-1）、pH（pH=4）、洗脫劑濃度（60% 乙醇）、洗脫速率（3 BV·h-1）、用量（4BV），對 CBLP 進(jìn)行純化實(shí)驗(yàn)，平行3次，洗脫液CBLP含量按2.2.4的方法測定?；厥杖軇?，凍干，制得CBLP純化樣品，驗(yàn)證篩選結(jié)果的可行性。

2.6 動態(tài)吸附和解吸的放大實(shí)驗(yàn)

參照2.5的方法進(jìn)行富集純化放大實(shí)驗(yàn)。以過量20%～50%的上樣量，重復(fù)上樣吸附飽和，用蒸餾水6BV洗去殘留液體，然后用4 BV的 60%乙醇洗脫，測定洗脫液中CBLP的含量?；厥杖軇?，凍干，制得CBLP純化樣品，考察放大實(shí)驗(yàn)的可行性，為工業(yè)生產(chǎn)提供依據(jù)。

3 結(jié)果與分析

3.1 樹脂的初篩結(jié)果

影響樹脂吸附性能的因素較多，通常樹脂具有較大的比表面積、合適的孔徑、極性與被吸附分子的極性相同或相近時，會有較好的吸附效果。由表1可知，所選的6種HPD樹脂對CBLP的吸附及解吸率差異明顯， HPD750、HPD100、HPD826 和 HPD600對CBLP具有較強(qiáng)的吸附能力，吸附率都高于70%，吸附能力依次為HPD750＞HPD100＞HPD826＞HPD600＞HPD300＞HPD450，其中HPD750的吸附率最高。解吸能力依次為HPD300＞HPD600＞HPD750＞HPD100＞HPD826＞HPD450，解吸效果較好的樹脂是HPD300和HPD600。HPD300的解析率最高，但其吸附率較低；HPD100、HPD750樹脂的吸附率、吸附量以及解析率都較高。綜合考慮，選擇HPD750、HPD100 型大孔樹脂做進(jìn)一步的對比實(shí)驗(yàn)。

表1 6種樹脂對CBLP的靜態(tài)吸附性能(n=3)

3.2 理想樹脂的篩選

3.2.1 樣液濃度的考察結(jié)果

樣液濃度的實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表2。數(shù)據(jù)表明，2種樹脂對CBLP的吸附量，在一定范圍內(nèi)隨樣品濃度的增大而增大；濃度為3.0mg·mL-1時，2種樹脂的吸附量最大，分別為1.73mg·g-1和1.77 mg·g-1；濃度繼續(xù)增大，由于吸附飽和，吸附率反而有所下降，表明上樣濃度控制在3.0 mg·mL-1左右為宜。

表2 樣液濃度對吸附的影響

3.2.2 吸附時間的考察結(jié)果

吸附時間的實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表3。數(shù)據(jù)表明，所選樹脂對CBLP的吸附均為快速吸附平衡型，1～2h，樹脂吸附量增加明顯，1～4h，均基本達(dá)到較高的吸附量，吸附8h時，二者均基本達(dá)到飽和吸附量。對比后可以發(fā)現(xiàn)，HPD100達(dá)到平衡吸附量的時間比HPD750更短，而在所測的時間范圍內(nèi)，兩者的吸附量和解吸率相近，理論上2種樹脂都可以用于CBLP的富集純化工藝研究。

表3 吸附時間對吸附的影響

3.2.3 樣液pH的考察結(jié)果

樣液pH的實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表4。數(shù)據(jù)表明，pH值為2～6的酸性條件下，2種樹脂對CBLP的吸附量都比較大，HPD750樹脂在pH=2時的吸附量最大，HPD100樹脂在pH=4時的吸附量最大，表明酸性條件下，多酚類可能以分子狀態(tài)存在，有利于吸附，但是酸性條件太強(qiáng)會對后處理不利，且容易產(chǎn)生廢酸。綜合考慮，確定理想的溶液pH為4，并確定將HPD100樹脂用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

表4 樣液pH對吸附量的影響

3.2.4 洗脫劑濃度的考察結(jié)果

洗脫液濃度的實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表5。數(shù)據(jù)表明，HPD100樹脂對CBLP的解吸率隨著乙醇濃度的增大而增大，用60%乙醇洗脫的解吸率達(dá)到11.4%，而80%乙醇的解吸率只有5.5%。為避免更多雜質(zhì)的殘留以及節(jié)約試劑成本，使用60%的乙醇作為洗脫液。

表5 洗脫劑濃度對解吸率的影響

3.3 動態(tài)吸附及解吸實(shí)驗(yàn)結(jié)果

3.3.1 吸附流速的考察結(jié)果

吸附流速的實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表6。數(shù)據(jù)表明，流速影響泄漏點(diǎn)的出現(xiàn)，流速過快，多酚來不及吸附擴(kuò)散就被樣液洗出，泄漏點(diǎn)前移，吸附量降低。上樣流速小有利于吸附，但流速變化的影響不顯著?？紤]到上樣流速越小，耗時越長，因此選擇上樣流速為3 BV·h-1。

表6 吸附流速對吸附率的影響

3.3.2 洗脫流速的考察結(jié)果

洗脫流速的實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表7。數(shù)據(jù)表明，洗脫率在流速為1～2BV·h-1時變化不顯著，之后隨流速的增加，洗脫率下降。考慮到時間因素，選擇洗脫流速為3BV·h-1。

表7 洗脫流速對洗脫率的影響

3.3.3 洗脫劑用量的考察結(jié)果

洗脫劑用量的實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表8。結(jié)果表明，先水洗至洗脫液揮干無固體，再用60%乙醇洗脫，洗脫劑體積為4 BV時，CBLP基本洗脫完全，表明肉桂多酚容易被洗脫。合并多酚含量較高的洗脫液，回收率可達(dá)到46.2%，因此選擇4 BV為適合的洗脫劑用量。

表8 洗脫劑用量對多酚含量的影響

3.3.4 樹脂篩選的驗(yàn)證結(jié)果

按2.5的操作方法，合并多酚含量較高的1～3 BV的洗脫液，測得其含量分別為44.9%、46.6%、46.1%，均值為46.2%，表明HPD100樹脂可用于富集和純化CBLP。

3.3.5 動態(tài)吸附和解吸的放大實(shí)驗(yàn)

在放大實(shí)驗(yàn)中，我們忽略泄漏點(diǎn)因素，采取過量20%～50%的上樣量，采用重復(fù)上樣的方式進(jìn)行操作，讓樹脂吸附飽和，達(dá)到最大吸附量，避免因操作問題提前泄漏，影響吸附效率。結(jié)果證明這樣的操作效果很好。按2.6的操作方法，吸附率達(dá)81.0%。合并多酚含量較高的1～4 BV洗脫液，測得其含量為45.6%。揮干得紅棕色黏稠狀固體，出膏率（解吸率）為79.5%。結(jié)果表明，HPD100樹脂適合用于富集、純化大批量的CBLP。

4 結(jié)論

大孔樹脂分離技術(shù)是利用其存在的多孔結(jié)構(gòu)和選擇性吸附功能，從中藥提取液中分離、純化、富集有效成分。樹脂孔徑、比表面積、分子間作用等因素決定其吸附性能。對6種HPD型樹脂的靜態(tài)吸附、動態(tài)吸附和解吸行為進(jìn)行研究，篩選出了對CBLP有較好的分離、富集和純化作用的HPD 100樹脂。優(yōu)選的工藝條件為：上樣量60mg·g-1，上樣濃度 3.0mg·mL-1，上樣 pH=4.0，吸附時間 3h，洗脫劑為60%乙醇。動態(tài)實(shí)驗(yàn)時，先用6 BV水洗至揮干無固體，再以4BV的60%乙醇以3BV·h-1的流速洗脫，洗脫液多酚含量達(dá)46.2%。放大實(shí)驗(yàn)中，純化得紅棕色黏稠狀固體，出膏率為79.5%，多酚含量達(dá)45.6%。因此可以認(rèn)為，HPD100型樹脂對CBLP具有良好的吸附選擇性，具有吸附快、解吸率高、可多次重復(fù)使用、工藝穩(wěn)定等特點(diǎn)，適宜于CBLP的富集和純化，可為肉桂枝葉多酚的開發(fā)利用研究和工業(yè)生產(chǎn)提供理論依據(jù)。