張艷軍，王 蕓，李 根，黃恩交，蔣 婷，韋曉娜，龐小斌

(北部灣大學石油與化工學院，廣西 欽州 535000)

卵磷脂是能夠促進身體各細胞正常新陳代謝的重要活性物質(zhì)，與蛋白質(zhì)、維生素并稱為“第三營養(yǎng)素”[1]，被廣泛用于食品、醫(yī)藥、畜牧業(yè)等行業(yè)[2-4]。目前卵磷脂主要從大豆、蛋黃中提取獲得[5-6]。

石斑魚(Epinephelus spp.)屬鮨科(Serranidae)石斑魚 (Epinephelussp)屬，為海產(chǎn)魚類，廣西欽州的四大名貴海產(chǎn)之一[7]。廣西北部灣海域自然條件得天獨厚，魚類資源尤為豐富[8]，每年在魚類加工生產(chǎn)環(huán)節(jié)會產(chǎn)生大量的魚鱗，其中海魚類魚鱗中富含卵磷脂[9]。

本實驗以石斑魚魚鱗為原料，依據(jù)卵磷脂的特性，改良有機溶劑萃取法，通過單因素實驗和正交實驗，對卵磷脂的提取工藝進行研究，并探討其抗氧化活性。此研究可為海洋廢棄物資源魚鱗的再利用提供科學的理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 儀器和試劑

儀器：UV-2600紫外可見分光光度計，JY92-IIDN超聲波細胞粉碎機，ATY124分析天平，SHZD(III) 循環(huán)水式多用真空泵。

試劑：卵磷脂標準品(＞98%)，丙酮、無水乙醇、鹽酸(均為分析純)。

1.2 實驗方法

1.2.1 實驗原理

1)卵磷脂的提取測定。依據(jù)卵磷脂難溶于丙酮的特性，先用丙酮浸泡魚鱗，將魚鱗中的一些非目標提取物雜質(zhì)清除；依據(jù)卵磷脂易溶于乙醇的特性，用乙醇進行提??；最后利用紫外分光度法來測定。

2)卵磷脂對羥基自由基清除率的測定。人體內(nèi)的自由基產(chǎn)生過多或清除能力下降時，會導致各種病變，因此清除過量的自由基具有重要的生理意義。羥自由基 (OH·)是較強的氧化劑，反應(yīng)性極強，壽命極短，幾乎可以和所有細胞成分發(fā)生反應(yīng)，對人體危害極大[10]。因此羥自由基的清除率是反映物質(zhì)抗氧化能力的重要指標。以從石斑魚魚鱗中提取的卵磷脂為原料，從清除羥自由基的角度研究魚卵磷脂的體外抗氧化活性。

1.2.2 原料處理

取自北部灣的石斑魚魚鱗，洗凈、烘干、粉碎，干燥，用密封袋儲藏于干燥器中備用。

1.2.3 實驗設(shè)計

1)石斑魚魚鱗的預處理。取一定量的魚鱗粉置于燒杯中，用適量的0.4mol·L-1的HCl浸泡除去鈣離子。抽濾后用適量丙酮浸泡除雜，減壓過濾后，用一定濃度的乙醇進行提取。

2)提取工藝優(yōu)化。考察乙醇濃度、固液比、超聲提取功率、超聲提取時間等對魚鱗卵磷脂提取率的影響，以確定單因素提取的最佳條件。在單因素實驗的基礎(chǔ)上設(shè)計正交實驗，以確定最優(yōu)的提取工藝。

1.2.4 卵磷脂標準溶液配制

準確稱取0.25g標準卵磷脂，用乙醇溶解后，轉(zhuǎn)移至50mL容量瓶中，定容，配制成5mg·mL-1卵磷脂儲備液。

1.2.5 最大吸收波長的確定

用紫外可見分光光度計，在190～500nm范圍內(nèi)對卵磷脂標準品進行光譜掃描，確定最大吸收波長。

1.2.6 卵磷脂標準曲線的建立

取卵磷脂儲備液 0.5、1.0、2.0、4.0、8.0mL，分別移入25mL容量瓶，用無水乙醇定容，搖勻，得濃度分別為 0.1、0.2、0.4、0.8、1.6mg·mL-1的系列溶液。用無水乙醇作為空白試劑組。

1.2.7 魚鱗卵磷脂提取率的計算

式中：a為提取物中卵磷脂的量，g；A為稱取原料的總質(zhì)量，g。

1.2.8 魚鱗卵磷脂的抗氧化活性

利用水楊酸法測定魚鱗卵磷脂對羥基自由基的清除率，參照文獻[11]的方法進行測定。

2 結(jié)果與分析

2.1 卵磷脂的最大吸收波長

經(jīng)紫外光譜掃描，確定卵磷脂的最大吸收波長為 215nm (圖 1）。

圖1 卵磷脂標準液的光譜掃描圖

2.2 卵磷脂標準曲線的繪制

如圖2所示，以樣品濃度(X)為橫坐標，吸光值(Y)為縱坐標，進行線性回歸分析，標準曲線為：Y=1.0479X+0.0266，R2=0.9992，卵 磷脂在 0.1～1.6mg·mL-1濃度區(qū)間內(nèi)有良好的線性關(guān)系。

圖2 卵磷脂的標準曲線圖

2.3 魚鱗卵磷脂提取工藝的確定

2.3.1 乙醇濃度對卵磷脂提取率的影響

設(shè)定固液比為1∶40，超聲功率為150W，超聲時間4min，溶劑乙醇濃度分別為50%、60%、70%、80%、90%進行實驗，考察乙醇濃度對卵磷脂提取率的影響。結(jié)果見圖3。由圖3可知，隨著乙醇濃度增加，卵磷脂的提取率有明顯提高，溶劑乙醇濃度為60%時，卵磷脂提取率達到最大；溶劑乙醇濃度大于60%后，卵磷脂提取率反而減小。卵磷脂是偏弱極性，根據(jù)極性相似相溶原理，隨著溶劑乙醇濃度的提高，提取率會降低。因此，60%是最佳乙醇濃度，此時卵磷脂提取率可達3.77%。

圖3 溶劑濃度對卵磷脂提取率的影響

2.3.2 固液比對卵磷脂提取率的影響

用60%乙醇提取，超聲4min，超聲功率150W，設(shè)定固液比分別為 1∶15、1∶25、1∶35、1∶45、1∶55，考察固液比對卵磷脂提取率的影響，結(jié)果見圖4。由圖4可知，卵磷脂的提取率隨固液比的增大而提高。固液比達到1∶25時，提取率達到最大，繼續(xù)增加固液比，提取率有明顯的下降趨勢。因此選擇固液比為1∶25，此時提取率可達4.15%。

圖4 固液比對卵磷脂提取率的影響

2.3.3 超聲功率對卵磷脂提取率的影響

乙醇濃度60%，固液比1∶25，提取時間4min。超聲功率分別設(shè)定為 120、150、180、210、240W，考察超聲提取功率對卵磷脂提取率的影響，結(jié)果見圖5。由圖5可知，卵磷脂提取率隨超聲提取功率的增大而提高，功率為210W時，卵磷脂提取率達到最大。這是由于超聲功率增大，超聲波對魚鱗細胞的破碎作用增大，分子運動加劇，溶出物增多，卵磷脂提取率也增高。超聲功率超過210W后，卵磷脂提取率下降，這是因為超聲功率的不斷增加，會導致提取溶劑的溫度快速升高，造成部分卵磷脂因溫度過高而發(fā)生分解，卵磷脂的提取率下降。因此，超聲提取功率以210W為最佳，此時提取率可達4.62%。

圖5 超聲提取功率對卵磷脂提取率的影響

2.3.4 超聲時間對卵磷脂提取率的影響

乙醇濃度為60%，固液比為1∶25，提取溫度25℃，超聲提取時間分別設(shè)定為 4、8、12、16、20min，考察超聲提取時間對卵磷脂提取率的影響，結(jié)果見圖6。從圖6可知，隨著超聲提取時間延長，卵磷脂的提取率也隨之提高，超聲提取時間為8min時提取率達到最大，超過8min后，卵磷脂提取率有明顯的下降。因此超聲時間以8min為宜，此時提取率可達4.98%。

圖6 超聲提取時間對卵磷脂提取率的影響

2.3.5 正交實驗

根據(jù)魚鱗卵磷脂提取的單因素實驗結(jié)果，以乙醇濃度、固液比、超聲功率、超聲時間為影響因素，在單因素實驗的基礎(chǔ)上，采用L9(34)正交實驗表進行實驗，得出卵磷脂的最佳提取工藝參數(shù)。正交實驗設(shè)計表及正交實驗結(jié)果見表1、2。

表1 L9(34)正交實驗設(shè)計表

表2 L9(34)正交實驗結(jié)果與分析

由表2可知，影響石斑魚魚鱗卵磷脂提取率的各因素的極差大小為A＞D＞C＞B，即乙醇濃度的影響最大，其次是超聲提取時間和超聲功率，固液比的影響最小。確定的最佳提取工藝條件為A2B2C2D2，即乙醇濃度為60%、固液比為1∶25、超聲功率為210W、超聲時間8min。在最佳提取工藝下，卵磷脂的提取率達到4.98%。

2.4 卵磷脂的體外抗氧化活性

稱取適量魚鱗經(jīng)預處理后，按最佳提取條件對魚鱗卵磷脂進行提取。將得到的樣品分別配制成不同的濃度梯度 (1、2、4、6、8mg·mL-1)，按 1.2.8的方法測定抗氧化活性，以無水乙醇為空白對照，結(jié)果見圖7。由圖7可知，卵磷脂對·OH清除率呈現(xiàn)劑量依賴性，清除率曲線為：y=7.686x+14.75，R2=0.9967，在1.0～8.0 mg·mL-1濃度范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。計算得到的魚鱗卵磷脂對·OH的IC50為4.59mg·mL-1。

圖7 魚鱗卵磷脂對·OH自由基的清除能力

3 結(jié)論

本實驗以石斑魚魚鱗為原料，采用有機溶劑及超聲輔助提取，通過單因素實驗，研究乙醇濃度、固液比、超聲功率、超聲時間等因素對魚鱗卵磷脂提取率的影響。采用正交實驗法L9(34)優(yōu)化提取石斑魚鱗卵磷脂的提取工藝，以羥自由基的清除率為指標，研究了魚鱗卵磷脂的體外抗氧化活性。實驗結(jié)果表明，最佳的提取工藝條件為：乙醇濃度60%、固液比1∶25、超聲提取功率210W、超聲提取時間8min。該條件下，卵磷脂的提取率達到4.98%。石斑魚魚鱗卵磷脂清除羥自由基的半抑制濃度 (IC50)為4.59 mg·mL-1，具有較好的體外抗氧化活性。實驗結(jié)果可為廢棄魚鱗的進一步開發(fā)提供一定的數(shù)據(jù)支撐。