潘海霞，王曉琦，武紅娜

（滄州市食品藥品檢驗(yàn)所，河北 滄州 061000）

附子理中丸于2009年載入《國家基本藥物目錄》，是甲類處方藥，臨床應(yīng)用廣泛。其處方出自宋代的《太平惠民和劑局方》，由附子（制）、黨參、炒白術(shù)、干姜、甘草5味藥組方而成[1-5]。干姜是附子理中丸方中君藥[5]，6-姜辣素為其有效成分，具有抗胃潰瘍、止吐的藥理作用[6-8]，與附子理中丸脾胃虛寒、嘔吐泄瀉的功能相對(duì)應(yīng)，可在一定程度上反映該藥的功效。6-姜辣素性質(zhì)不穩(wěn)定，不同產(chǎn)地、不同采收季節(jié)干姜中6-姜辣素含量會(huì)有所變化，生產(chǎn)過程中容易造成6-姜辣素成分流失[9-11]。因此選擇6-姜辣素作為附子理中丸檢驗(yàn)的新指標(biāo)?！吨袊幍洹?015年版一部為該藥的法定標(biāo)準(zhǔn)，標(biāo)準(zhǔn)中僅對(duì)干姜進(jìn)行了顯微鑒別和薄層色譜鑒別，而6-姜辣素并未進(jìn)行監(jiān)測(cè)，故本文擬定建立高效液相色譜法（HPLC）對(duì)6-姜辣素含量進(jìn)行檢驗(yàn)，以期控制附子理中丸的藥品質(zhì)量。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

Agilent 1200型高效液相色譜儀（美國安捷倫公司）；CP225D型十萬分之一電子天平（德國賽多利斯公司）；LC350A型超聲波處理器（魯超超聲設(shè)備有限公司）；Milli-Q Advantage A10型超純水儀（美國Millipore公司）。

1.2 試藥

6-姜辣素對(duì)照品（批號(hào)：111833-201806，含量以99.9 %計(jì)，-20 ℃保存，中國食品藥品檢定研究院）；甘草、白術(shù)、黨參對(duì)照藥材（批號(hào)分別為：120904-201620，120925-201812，121057-201206，供鑒別用），均購自中國食品藥品檢定研究院；附子對(duì)照藥材（批號(hào)為PCS8186，供鑒別用），購自北京中科質(zhì)檢生物技術(shù)有限公司；附子理中丸來自不同廠家、3種劑型共計(jì)15批次；甲醇、乙腈均為色譜純，水為超純水（自制），其他試劑均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

色譜柱：Agilent 588935-902 TC-C18（2）（150 mm×4.6 mm，5 μm）；流動(dòng)相：甲醇-乙腈-水（30:25:45），等度洗脫；流速：0.8 ml/min；柱溫：25 ℃；檢測(cè)波長(zhǎng)：280 nm；進(jìn)樣量10 μl。理論板數(shù)按6-姜辣素計(jì)算不低于5000，色譜峰與其相鄰色譜峰的分離度均大于1.5。

2.2 溶液的制備

2.2.1 對(duì)照品溶液的制備 取6-姜辣素對(duì)照品適量，精密稱定，加甲醇制成每1 ml含0.1 mg的溶液，即得。

2.2.2 供試品溶液的制備 取本品水蜜丸適量，研細(xì)，取約2.2 g，精密稱定，或取小蜜丸或大蜜丸，剪碎，取約3.2 g，精密稱定；置具塞錐形瓶中，精密加入75 %乙醇20 ml，密塞，稱定重量，超聲處理（功率250 W，頻率30 kHz）25 min，放冷，用75 %乙醇補(bǔ)足減失的重量，搖勻，0.45 μm微孔濾膜過濾，即得。

2.2.3 陰性對(duì)照溶液的制備 按附子理中丸（濃縮丸）處方及工藝制備缺少干姜的陰性樣品，并按2.2.2項(xiàng)下供試品溶液制備方法制成陰性對(duì)照溶液。

2.3 方法學(xué)驗(yàn)證

2.3.1 專屬性試驗(yàn) 分別取對(duì)照品溶液、供試品溶液和陰性對(duì)照溶液，依據(jù)2.1項(xiàng)下色譜條件測(cè)定，結(jié)果見圖1。供試品溶液的色譜圖中，在與對(duì)照品溶液的色譜圖相應(yīng)的位置上，有相同保留時(shí)間的色譜峰，而陰性對(duì)照溶液在此保留時(shí)間處無干擾。

圖1 6-姜辣素的HPLC圖譜

2.3.2 線性關(guān)系考察 取6-姜辣素對(duì)照品適量，精密稱定，加適量甲醇制成濃度分別為0.04，0.06，0.10，0.20，0.30 mg/ml的溶液，分別精密吸取上述不同濃度的對(duì)照品溶液各10 μl，按照2.1項(xiàng)下色譜條件測(cè)定。以峰面積（y）對(duì)濃度（x，mg/ml）進(jìn)行線性回歸，得回歸方程為：y=5706.5x+22.048，相關(guān)系數(shù)r=0.9986。結(jié)果表明，6-姜辣素在0.04～0.30 mg/ml范圍內(nèi)與峰面積線性關(guān)系良好。

2.3.3 溶液穩(wěn)定性 將供試品溶液（2號(hào)企業(yè)，批號(hào)為180101）分別于配置后在室溫下放置0，2，4，8，12和24 h，依法測(cè)定其峰面積，結(jié)果6個(gè)檢測(cè)點(diǎn)6-姜辣素的峰面積的RSD為0.4 %，說明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.3.4 精密度試驗(yàn) 取2.2.1項(xiàng)下對(duì)照品溶液，按2.1項(xiàng)下色譜條件連續(xù)進(jìn)樣6次，測(cè)得6-姜辣素峰面積的RSD為0.7 %，表明儀器精密度良好。

2.3.5 重復(fù)性試驗(yàn) 取同批號(hào)樣品，按2.2.2項(xiàng)下方法平行制備6份供試品溶液（2號(hào)企業(yè)，批號(hào)為180101），按2.1項(xiàng)下色譜條件測(cè)定。結(jié)果，樣品中6-姜辣素平均含量為4.5 mg/丸，RSD為1.27 %（n=6），結(jié)果表明該方法的重復(fù)性良好。

2.3.6 回收率測(cè)定 取已知含量的樣品（2號(hào)企業(yè)，批號(hào)為180101）約3.2 g，精密稱定，分別按樣品含量的50 %，100 %，150 %加入6-姜辣素對(duì)照品，按2.2.2項(xiàng)下方法制備成供試品溶液，按2.1項(xiàng)下色譜條件測(cè)定，測(cè)得6-姜辣素的回收率范圍為97.75 %～102.58 %，平均回收率為99.43 %，RSD為1.5 %，結(jié)果表明加樣回收率良好。

表1 回收率試驗(yàn)結(jié)果

2.4 樣品測(cè)定

取15批樣品（大蜜丸、小蜜丸、水蜜丸），按2.2.2項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按2.1項(xiàng)下色譜條件測(cè)定，計(jì)算6-姜辣素含量。結(jié)果見表2。由表2可見，3種劑型附子理中丸6-姜辣素含量差異較大，作為藥品的活性成分，亟待制定標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行質(zhì)量控制。

3 結(jié)論與討論

3.1 試驗(yàn)結(jié)果分析

不同劑型、廠家樣品中6-姜辣素含量有明顯差異。分析原因：一是原藥材質(zhì)量較差，不同產(chǎn)地、不同采收季節(jié)干姜中6-姜辣素含量會(huì)有所變化；二是工藝方面，水蜜丸在制丸干燥或滅菌過程中均有可能造成6-姜辣素成分流失。

3.2 提取溶劑的選擇

分別采用75 %乙醇、75 %甲醇、乙醇、甲醇、水進(jìn)行提取，發(fā)現(xiàn)75 %甲醇提取較完全，且峰形較好，穩(wěn)定性好，保留時(shí)間適中，考慮到實(shí)驗(yàn)效率和效果及儀器的穩(wěn)定狀態(tài)等綜合因素，確定使用75 %甲醇為溶劑。

表2 樣品測(cè)定結(jié)果

3.3 提取方式的考察

分別采用了75 %甲醇溶解，超聲15，20，40 min，振搖50，40，30 min，放置24 h，發(fā)現(xiàn)超聲20 min至40 min與振搖30 min提取比較完全，但隨超聲時(shí)間的延長(zhǎng)，6-姜辣素的含量會(huì)降低，綜合考慮到實(shí)驗(yàn)效率，確定為超聲20 min。

3.4 柱溫的考察

針對(duì)在含量測(cè)定中，6-姜辣素作為干姜的活性成分，但其性質(zhì)不穩(wěn)定。實(shí)驗(yàn)中考察了柱溫（20，25，30，35 ℃）對(duì)色譜分離的影響，結(jié)果表明隨柱溫升高，供試品溶液的峰形較差，分離效果也變差，而當(dāng)柱溫在 25 ℃ 時(shí)，峰形較好，分離情況較好，故建議柱溫控制在25 ℃。

3.5 方法學(xué)考察

結(jié)果表明，本實(shí)驗(yàn)方法操作簡(jiǎn)便、專屬性強(qiáng)、重現(xiàn)性好，可準(zhǔn)確測(cè)出附子理中丸中6-姜辣素的含量，因此可用于附子理中丸及其同類藥品中6-姜辣素含量的控制。