陳宇鋒，許貽斌，劉 波，姜雙城，鄭惠東

(福建省水產(chǎn)研究所，福建省海洋生物增養(yǎng)殖與高值化利用重點實驗室，福建 廈門 361013)

聯(lián)苯菊酯(Bifenthrin，BF)是一種合成、高效的擬除蟲菊酯殺蟲、殺螨劑[1]，因具有殺蟲譜廣、作用迅速，低毒等特點而被廣泛應(yīng)用于農(nóng)作物病蟲害防治[2]。但聯(lián)苯菊酯具有強大的親脂性，對光和熱穩(wěn)定，殘效期長，在其高效殺蟲的同時，殘留的聯(lián)苯菊酯隨著雨水、地表徑流等途徑進入海洋，也導(dǎo)致了近海海域海洋環(huán)境日益嚴重的污染問題[3]。研究表明：在美國加利福尼亞北部海域[4]、廈門西海岸及九龍江河口水體和沉積物中均有檢出微量的聯(lián)苯菊酯等農(nóng)藥殘留[5]。雖然聯(lián)苯菊酯等擬除蟲菊酯類農(nóng)藥對哺乳動物、鳥類毒性較低，但對魚、貝和甲殼類等水生生物毒性較大[6-9]，并且具有一定的生物富集能力[10]，引發(fā)人們對該類農(nóng)藥潛在的基因遺傳毒性方面的關(guān)注。

單細胞凝膠電泳(Single cell gel eletrophoresis，SCGE)又稱彗星實驗(Comet assay)，是一種在單細胞水平上檢測DNA單鏈或雙鏈斷裂的實驗方法[11]。其主要技術(shù)原理為：當細胞DNA損傷越嚴重時，斷鏈的遷移率越大，經(jīng)熒光染色后，在熒光顯微鏡下形成彗星狀的電泳圖譜[12]。根據(jù)電泳緩沖液的pH值不同，可分為中性彗星實驗(pH=8.4)和堿性彗星實驗(pH>13.0)。堿性彗星實驗具有更高的靈敏性，不僅可以檢測少量的單鏈和雙鏈斷裂損傷，還可將堿性不穩(wěn)定點(Alkali-labile sites，ALS)轉(zhuǎn)化為DNA斷裂進行檢測[13-14]。由于彗星實驗簡便、快速、靈敏度高、所需細胞少而成為評估DNA損傷的有效工具，并被廣泛應(yīng)用于遺傳毒性、環(huán)境監(jiān)測、氧化應(yīng)激及細胞凋亡等方面，研究對象以哺乳動物居多，在血細胞、淋巴細胞、肝腎等臟器細胞、生殖細胞等方面開展研究[15-16]。在對水生生物研究中，彗星實驗檢測技術(shù)也開始被應(yīng)用在檢測魚類血細胞[17]和肝胰臟細胞[18]、甲殼類肝胰腺細胞[19]、貝類血淋巴細胞[20]和消化腺細胞[21]等方面。

菲律賓蛤仔(Ruditapesphilippinarum)是一種分布廣泛的灘涂貝類，是我國沿海地區(qū)重要的養(yǎng)殖貝類之一，具有很高的經(jīng)濟價值。菲律賓蛤仔生活在潮間帶或近岸淺海，對海洋環(huán)境中的有機污染物有很強的生物富集效應(yīng)[22]，同時肝胰腺也是貝類的主要食物消化部位和解毒部位。目前對聯(lián)苯菊酯潛在的基因遺傳毒性知之甚少，特別是其對菲律賓蛤仔肝胰腺細胞DNA損傷的研究未見報道。本研究以水產(chǎn)養(yǎng)殖貝類菲律賓蛤仔為實驗對象，采用單細胞凝膠電泳技術(shù)探討了聯(lián)苯菊酯暴露對菲律賓蛤仔體內(nèi)肝胰腺細胞DNA的損傷作用，旨在為聯(lián)苯菊酯的遺傳毒性評價和安全評估提供必要的參考數(shù)據(jù)，也為合理使用聯(lián)苯菊酯提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試劑與儀器

聯(lián)苯菊酯為江蘇皇馬農(nóng)化有限公司產(chǎn)品，有效成分含量為25 g/L；低熔點瓊脂糖(LMA)、10×細胞裂解液(0.1 mol/L Tris、10% 肌氨酸鈉、10% Triton X-100)、EDTA溶液(0.5 mol/L)、綠色熒光DNA染色劑為美國CELL BIOLABS公司產(chǎn)品；臺盼藍染色試劑盒、Tris·HCl緩沖液(0.05 mol/L)購自生工生物工程(上海)股份有限公司；磷酸一氫鈉(Na2HPO4)、磷酸二氫鈉(NaH2PO4)、磷酸二氫鉀(KH2PO4)、氯化鈉(NaCl)、鉀化鈉(KCl)、氫氧化鈉(NaOH)均為國產(chǎn)分析純試劑，由西隴科學(xué)股份有限公司生產(chǎn)。

實驗用玻片為美國CELL BIOLABS公司產(chǎn)品；超凈工作臺為蘇州智凈凈化設(shè)備有限公司的SW-CJ-1D型；臺面式pH/ISE測試儀為美國Orion公司的MODEL 828型；電熱恒溫水浴鍋為上海精宏公司的DK-500S型；電泳儀為美國Thermo公司的EC250-90型；全自動雪花制冰機為上海坤科儀器設(shè)備有限公司的IMS-20型；高壓滅菌器為美國Zealway公司的GR60DA型；水平電泳槽為北京君意公司的JY-SP-E型；熒光顯微鏡為德國Leica公司的DM5500B型。

1.2 實驗材料

菲律賓蛤仔購自福建省海水魚類苗種繁育科研中試基地(漳州招商局開發(fā)區(qū))附近水產(chǎn)批發(fā)市場，在科研基地的水泥池中暫養(yǎng)7 d，每天固定時間定量投喂微藻一次。挑選健康無病、外形完整且規(guī)格相當?shù)姆坡少e蛤仔作為實驗用貝，平均殼長(28.5±3.9)mm，平均體質(zhì)量(12.6±2.1)g。

1.3 實驗用水

實驗用水為沙濾海水，pH為(8.1±0.3)、水溫(20.2±0.5)℃、鹽度(30.5±0.3)。實驗期間，為確保聯(lián)苯菊酯暴露濃度的穩(wěn)定，采取每日全部更換實驗用水的方法。在實驗過程中保持微充氣，確保溶解氧DO大于5 mg/L。

1.4 亞急性毒性實驗方法

根據(jù)預(yù)實驗結(jié)果，分為5個處理組進行實驗，分別設(shè)置為0(空白對照組)、0.05、0.10、0.15、0.20 mg/L，每組50粒菲律賓蛤仔，實驗周期為25 d，實驗處理組各設(shè)置3個平行。

1.5 細胞懸液制備

亞急性毒性實驗進行25 d后，各實驗處理組挑取存活的菲律賓蛤仔10粒，取其剪碎混勻后的肝胰腺組織0.2 g置于1.5 mL滅菌離心管中，加入4℃預(yù)冷的0.01 mol/L PBS緩沖液(含0.02 mol/L EDTA)1.0 mL，冰浴靜置5 min后轉(zhuǎn)入新的離心管，3 000 r/min 離心2 min后棄上清液，用4℃預(yù)冷的0.01 mol/L PBS 緩沖液重懸細胞，通過臺盼藍染色劑染色5 min后鏡檢細胞活性，用預(yù)冷的PBS緩沖液調(diào)節(jié)細胞濃度為1×105個/mL，置于4℃冰箱中避光備用。

1.6 彗星實驗方法

按照CELL BIOLABS公司的彗星分析試劑盒實驗步驟進行單細胞凝膠電泳分析。

制片：將試劑盒內(nèi)的低熔點瓊脂糖凝膠取出，放置于90～95℃水浴鍋內(nèi)加熱20 min，使之溶解后取100 μL凝膠分裝至200 μL滅菌PCR管，再置于37℃水浴鍋中冷卻，備用。吸取細胞懸液與低熔點瓊脂糖凝膠按1∶10比例混合，取75 μL混合液均勻鋪于載玻片上，放置于4℃避光凝固15 min。

裂解：將載玻片浸沒于4℃預(yù)冷的細胞裂解液(2.5 mol/L NaCl、0.1 mol/L EDTA、0.01 mol/L Tris、1%肌氨酸鈉、1% Triton X-100，pH=10.0)中，置于4℃冰箱內(nèi)避光裂解60 min。

解旋裂解后，載玻片經(jīng)超純水漂洗后，放入電泳槽中，緩慢倒入4℃預(yù)冷的堿性電泳緩沖液(0.3 mol/L NaOH、1 mmol/L EDTA，pH>13.0)中，置于4℃冰箱避光解旋30 min。

電泳：往水平電泳槽內(nèi)緩慢倒入4℃預(yù)冷的堿性電泳緩沖液，使其沒過載玻片膠面2～3 mm，在電壓1 V/cm、電流300 mA的條件下電泳20 min。

染色：電泳結(jié)束后，用預(yù)冷、滅菌的超純水浸泡移出的載玻片2 min，并反復(fù)沖洗兩次，以便洗去多余的堿液，再用70%酒精浸泡固化5 min。將玻片取出避光控干，加入100 μL綠色熒光DNA染料，室溫避光染色15 min。

1.7 圖像分析和數(shù)據(jù)處理

在熒光顯微鏡下觀察玻片，并進行顯微攝影，應(yīng)用彗星分析軟件Comet Score 1.5 進行分析，各實驗處理組隨機選擇30個細胞進行拍照觀察和數(shù)據(jù)分析，選擇平均彗星尾長、拖尾率、彗尾DNA相對含量、尾矩和Olive矩等參數(shù)來評價菲律賓蛤仔肝胰腺細胞DNA的損傷程度。其中拖尾率=拖尾細胞數(shù)/觀察細胞數(shù)×100%、彗尾DNA相對含量=尾部DNA含量/細胞總DNA含量×100%、尾矩=尾長×彗尾DNA相對含量×100%、Olive矩=頭尾部中心間距×彗尾DNA相對含量×100%。彗星實驗數(shù)據(jù)結(jié)果以平均值±標準差(Means±SD)表示，應(yīng)用Excel軟件及SPSS 18.0軟件對所獲得的數(shù)據(jù)進行單因素方差分析(One-way ANOVA)，檢驗各濃度組與對照組之間顯著性差異并進行回歸方程和相關(guān)性分析。

2 結(jié)果

2.1 聯(lián)苯菊酯對菲律賓蛤仔肝胰腺細胞DNA的影響

經(jīng)過熒光染料染色后，各實驗處理組隨機采集30個細胞，在熒光顯微鏡下觀察并進行統(tǒng)計分析。由圖1可見，空白對照組菲律賓蛤仔的肝胰腺細胞DNA結(jié)構(gòu)完整，細胞核大小均一，經(jīng)熒光染色后呈現(xiàn)圓形狀的熒光團，熒光強度均勻，無明顯的拖尾現(xiàn)象；0.05 mg/L和0.10 mg/L處理組菲律賓蛤仔的肝胰腺細胞核中呈現(xiàn)一個熒光亮點，周圍邊緣模糊，表明細胞DNA開始出現(xiàn)解體，呈松散狀態(tài)，出現(xiàn)一定的拖尾現(xiàn)象；而0.15 mg/L和0.20 mg/L處理組菲律賓蛤仔的肝胰腺細胞損傷的DNA斷裂碎片在電場中離開核DNA，向同一個方向(陽極)遷移，經(jīng)染色后形成彗星狀拖尾。隨著暴露濃度的增加，細胞核DNA損傷越嚴重，斷裂的碎片或堿變性片段越多，彗星尾長相應(yīng)增加，尾部熒光強度也相應(yīng)增強。從表1檢測指標可見：空白對照組DNA細胞受損較少，細胞拖尾率僅為(6.33±1.05)%，彗尾DNA相對含量、尾矩和Olive矩都接近0；其余各實驗處理組的彗星尾長、拖尾率、彗尾DNA相對含量、尾矩和Olive矩隨著暴露濃度的增加而不斷增加，呈現(xiàn)一定的劑量效應(yīng)關(guān)系。0.05～0.20 mg/L處理組與空白對照組相比，菲律賓蛤仔肝胰腺細胞DNA均有不同程度的損傷且各檢測指標值均顯著增加(P<0.05)，其中0.20 mg/L處理組的各檢測指標又顯著高于其他檢測處理組(P<0.05)，表明菲律賓蛤仔體內(nèi)肝胰腺細胞對聯(lián)苯菊酯毒性存在較為敏感的閾值范圍。

注：a.空白對照組；b.0.05 mg/L處理組；c.0.10 mg/L處理組；d.0.15 mg/L處理組；e.0.20 mg/L處理組。

Notes：a.Control group；b.0.05 mg/L exposure concentration；c.0.10 mg/L exposure concentration；d.0.15 mg/L exposure concentration；e.0.20 mg/L exposure concentration.

表1 聯(lián)苯菊酯不同暴露濃度對菲律賓蛤仔肝胰腺細胞DNA損傷的彗星檢測指標數(shù)據(jù)

注：不同英文字母表示差異顯著(P<0.05)。

Notes：Values with the different letters were significant difference(P<0.05).

2.2 聯(lián)苯菊酯不同處理濃度與彗星實驗各檢測指標的回歸分析

各檢測指標的回歸方程如表2所示，應(yīng)用Excel軟件及SPSS 18.0軟件對各項檢測指標與聯(lián)苯菊酯暴露濃度進行線性、多項式和指數(shù)擬合回歸分析后，其多項式回歸分析擬合度最高(r>0.99)。各檢測指標與暴露濃度之間存在較好的相關(guān)性。聯(lián)苯菊酯處理濃度與各檢測指標的多元回歸方程為Y=-0.105+0.075X1+0.028X2-0.012X3-0.173X4(P<0.01)，其中Y表示聯(lián)苯菊酯暴露濃度；X1表示彗尾DNA相對含量；X2表示彗星尾長；X3表示拖尾率；X4表示Olive矩。

表2 聯(lián)苯菊酯不同處理濃度與彗星實驗各檢測指標的回歸方程

注：y為各檢測指標，x為聯(lián)苯菊酯不同處理濃度。

Notes：ywas each experimental index in comet assay ；xwas the exposure concentration of bifenthrin.

3 討論

擬除蟲菊酯類農(nóng)藥作為一種神經(jīng)毒劑，通過干擾離子通道，損傷神經(jīng)系統(tǒng)，從而產(chǎn)生興奮性神經(jīng)毒性，出現(xiàn)神經(jīng)中毒癥狀[23]。擬除蟲菊酯類農(nóng)藥的遺傳毒性效應(yīng)對環(huán)境和生物的危害表現(xiàn)為可能導(dǎo)致各種類型的基因突變風險，具有致癌效應(yīng)和致畸效應(yīng)。研究報道表明，擬除蟲菊酯類農(nóng)藥對水生動物的細胞DNA結(jié)構(gòu)和基因表達產(chǎn)生影響，進而對水生生態(tài)存在著一定的生態(tài)風險[24-25]。相比于其他傳統(tǒng)方法，Mitchelmore等[26]認為彗星實驗特別適用于魚類和其他水生生物的遺傳毒理學(xué)檢測，其基因毒性反應(yīng)常常作為非特異性的生物標記，應(yīng)用在環(huán)境污染物對生物體損傷的測定中。Al-Subiai等[27]研究暴露于不同Cu濃度培養(yǎng)條件下紫貽貝(MytilusedulisLinnaeus)的反應(yīng)，體內(nèi)暴露5 d后，血細胞DNA損傷隨著Cu濃度增加而有所增加，低濃度Cu(18 μg/L)即可造成顯著性DNA損傷，當濃度增加至56 μg/L時，彗尾DNA百分比(Tail DNA%)不斷增加至66%。曹麗萍等[28]研究四氯化碳對建鯉(Cyprinuscarpiovar.jian)肝細胞DNA的毒性作用，結(jié)果表明彗星實驗中各項損傷指標值隨著環(huán)境污染物染毒劑量增加而極顯著增加。

本研究選用彗星尾長、拖尾率、Olive尾矩和尾部DNA百分含量來評估聯(lián)苯菊酯對菲律賓蛤仔體內(nèi)肝胰腺DNA的損傷程度，其中尾部DNA百分含量與Olive尾矩是公認的評估DNA損傷的彗星實驗指標[29]。實驗結(jié)果表明，0.05～0.20 mg/L處理組均出現(xiàn)出不同程度的DNA損傷，隨著聯(lián)苯菊酯暴露濃度的增加，各檢測指標值均呈規(guī)律性的增長趨勢，菲律賓蛤仔肝胰腺DNA結(jié)構(gòu)越松散，斷裂的DNA碎片或堿變性片段越多，彗星尾長相應(yīng)增加，損傷也越嚴重，表現(xiàn)出良好的劑量效應(yīng)關(guān)系。該實驗結(jié)果與氰戊菊酯對菲律賓蛤仔研究結(jié)果[21]相一致。實驗中0.20 mg/L處理組的各項檢測指標值均顯著高于其他組，表明菲律賓蛤仔在聯(lián)苯菊酯0.20 mg/L暴露處理25 d后，其肝胰腺DNA受到了嚴重損傷。菲律賓蛤仔肝胰腺細胞在聯(lián)苯菊酯暴露濃度為0.05～0.15 mg/L時，實驗處理組與空白對照組相比，各檢測指標表現(xiàn)出顯著性差異(P<0.05)，而當暴露濃度達到0.20 mg/L時，DNA損傷更加劇烈，該實驗處理組顯著高于其他實驗處理組(P<0.05)，結(jié)果表明聯(lián)苯菊酯與菲律賓蛤仔肝胰腺細胞DNA的損傷具有高度的相關(guān)性，呈現(xiàn)一定的劑量效應(yīng)關(guān)系，同時菲律賓蛤仔肝胰腺細胞對聯(lián)苯菊酯毒性存在著高速反應(yīng)的閾值范圍。

為了全面評價聯(lián)苯菊酯對菲律賓蛤仔肝胰腺DNA損傷的影響因子，本研究對實驗各檢測指標進行回歸分析和相關(guān)性分析，結(jié)果表明各檢測數(shù)據(jù)與處理濃度之間存在高度的相關(guān)性，其中多項式回歸分析擬合度最高(r>0.99)，彗星實驗各個檢測指標均能很好地反映出聯(lián)苯菊酯暴露濃度對菲律賓蛤仔肝胰腺細胞DNA的損傷程度。該結(jié)論也與相關(guān)研究報道一致，Kacar等[30]采用厚殼貽貝(MytiluscoruscusGould)作為指示生物，對貽貝的鰓細胞和血細胞進行彗星實驗，表明貽貝的鰓細胞和血細胞中的DNA損傷均與環(huán)境中總PAHs濃度呈正相關(guān)(r分別為0.76和0.87)；Dogu等[31]用含毒死蜱(CFP)三個濃度組(0.02、0.04、0.08 mg/L)的飼料投喂虹鱒(OncorhynchusmykissWalbaum)后，采用彗星實驗技術(shù)對虹鱒血紅細胞DNA損傷水平進行了檢測，結(jié)果顯示CFP劑量的增加與DNA損傷質(zhì)檢有顯著的相關(guān)性(P<0.01)。本研究通過在對彗星實驗各檢測指標建立一元回歸方程的基礎(chǔ)上，采用SPSS統(tǒng)計軟件進行分析，經(jīng)過多參數(shù)的多元回歸方程分析表明：聯(lián)苯菊酯暴露濃度與彗星實驗各檢測指標之間存在著高度的相關(guān)性，且各個檢測指標的相關(guān)系數(shù)都具有統(tǒng)計學(xué)意義，表現(xiàn)出顯著性差異(P<0.05)，并通過多元回歸方程可以有效地推斷出聯(lián)苯菊酯對菲律賓蛤仔的染毒濃度，其中彗尾DNA相對含量是比較直接的可靠指標，而處理濃度對尾矩和Olive矩的影響作用類似，但Olive矩在回歸方程顯著性更高(P<0.01)，尾矩為排除的變量。通過多元回歸方程分析表明：聯(lián)苯菊酯暴露對菲律賓蛤仔肝胰腺細胞DNA損傷情況較好的檢測指標為彗尾DNA相對含量和Olive矩，即產(chǎn)生影響最顯著的因素，表明通過彗星實驗建立實驗室檢測聯(lián)苯菊酯遺傳毒性的方法具有可行性，進一步驗證彗星實驗在研究環(huán)境污染物對水生生物潛在基因毒性方面的可行性，為評估聯(lián)苯菊酯的遺傳毒性和安全評估提供必要的參考數(shù)據(jù)。

4 結(jié)論

本實驗以菲律賓蛤仔肝胰腺細胞為研究對象，采用單細胞凝膠電泳技術(shù)探討了聯(lián)苯菊酯的遺傳毒性作用。

1)隨著聯(lián)苯菊酯濃度的增加，彗星實驗各檢測指標都呈現(xiàn)規(guī)律性的增長趨勢，具有高度的相關(guān)性(r>0.99)，表現(xiàn)出良好的劑量效應(yīng)關(guān)系。

2)評價彗星實驗較好的檢測指標為彗尾DNA相對含量和Olive矩，并且通過多元回歸方程可以有效地推斷出聯(lián)苯菊酯對菲律賓蛤仔的染毒濃度。