丁萌萌，賈儒林，趙平

（1.中國醫(yī)科大學附屬盛京醫(yī)院麻醉科，沈陽 110004；2.中國刑事警察學院法醫(yī)系，沈陽 110854）

椎間盤退行性病變 （disc degeneration disease，DDD） 是一個或多個椎間盤退化引起的疾病，是現(xiàn)代社會最重要的公共健康問題之一［1］。椎間盤變性是細胞外基質蛋白 （extracellular matrix protein，ECM） 降解和破壞的慢性過程。一方面，DDD出現(xiàn)細胞外基質降解，導致椎間盤結構破壞［2］。另一方面，ECM的降解產(chǎn)物可能引發(fā)或進一步促使椎間盤退變和腰痛相關的炎癥反應［3］。Tenascin-C （TNC） 是一種ECM，在分化、疾病發(fā)展或損傷時表達［4］，它在癌癥與炎癥中的作用已被廣泛研究［5-7］，但在DDD中的研究仍是空白。DDD被普遍認為是某種炎性細胞因子，如白細胞介素 （interleukin，IL） -1增加了基質金屬蛋白酶 （matrix metalloproteinases，MMP） 的表達，導致椎間盤ECM的丟失，從而使椎間盤發(fā)生退行性病變［8］。許多文獻［9-12］已經(jīng)報道炎性細胞因子可以促進TNC在多種細胞中的表達。鑒于ECM與DDD的相互作用，TNC或許與兩者存在某種聯(lián)系，本研究對TNC在DDD中的作用及其機制進行探討。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動物：Balb-c小白鼠36只，雌性，8～12 周齡，由Jackson Laboratory提供。所用的實驗動物、所有動物操作和體內(nèi)實驗均獲得弗吉尼亞大學動物保護與使用研究委員會批準。

1.1.2 細胞：人髓核細胞第2～6代，小鼠椎間盤細胞第2～6代。

1.1.3 主要儀器與試劑：IL-1β （美國Abcam公司） ；TRIzol reagent （美國Sigma公司） ；MMP activety assay kit（美國Anaspec公司） 兔抗人Tenascin-C抗體；biotinlyza goat anti rabbit IgG抗體；山羊抗兔抗體680；bio-rad RT-PCR；bio-rad iscript；odyssey membrane scan；細胞培養(yǎng)箱、恒溫高速離心機 （美國Thermo公司）。

1.2 方法

1.2.1 人髓核細胞與小鼠椎間盤細胞分離與培養(yǎng)：所有涉及人體材料的實驗均獲得美國弗吉尼亞大學衛(wèi)生科學研究機構審查委員會批準。按照美國國家衛(wèi)生研究機構對手術廢物用于人體項目研究的規(guī)定，獲取的人椎間盤樣本來自于弗吉尼亞大學醫(yī)院接受脊柱側彎椎間盤切除術手術治療的患者。將人髓核組織分離，并切成碎末；小鼠實施安樂死，取出脊柱，分離椎間盤，剪碎。用含有0.5%膠原蛋白酶/胰蛋白酶的培養(yǎng)液在37 ℃消化30 min，放入15%FBS和1%青霉素-鏈霉素的細胞培養(yǎng)液 （DMEM/F12） 中繼續(xù)培養(yǎng)，孵育在具有5%CO2，37 ℃的潮濕培養(yǎng)箱中。細胞第2～6代使用于此研究。

1.2.2 樣品收集：人髓核細胞和小鼠椎間盤細胞培養(yǎng)4～5 d （根據(jù)以往最佳培養(yǎng)時間）。在炎性環(huán)境TNC水平表達的實驗中，IL-1β組加入IL-1β 10 ng/mL培養(yǎng)24 h；對照組不加IL-1β，為空白對照。在炎性環(huán)境TNC的表達水平隨時間變化實驗中，IL-1β組加入IL-1β 10 ng/mL培養(yǎng)4、8、12、24和48 h；對照組不加IL-1β組，為空白對照。根據(jù)TNC的時間變化選取24 h作為后續(xù)實驗中IL-1β的作用時間。完成刺激時間后收集細胞培養(yǎng)液，用TRIzol reagent提取RNA，用細胞裂解液裂解細胞提取蛋白進行后續(xù)實驗。

1.2.3 實時PCR：根據(jù)產(chǎn)品說明使用iScript cDNA synthesis kit （Bio-Rad Laboratories，美國） 將相同質量的RNA 逆轉合成互補DNA （cDNA）。實時逆轉錄聚合酶鏈反應術采用RT^2 SYBR Green Fluo FAST Mastermix （Qiagen Sciences，美 國） 在iQ5 multicolor real-time PCR Detection System （Bio-Rad Laboratories，美國） 上進行。檢測靶向基因包括TNC、膠原蛋白Ⅱ、蛋白聚糖、MMP-9和MMP-13，使用18s來標準化。

1.2.4 Western blotting：收集的細胞裂解液、細胞培養(yǎng)基在bio-rad mini protein tetra system儀器上完成Western blotting檢測。一抗 （兔抗人Tenascin-C 抗體）1 ∶500 稀釋4 ℃過夜，二抗 （山羊抗兔抗體680）1 ∶1 000稀釋，室溫孵育1 h，緩慢搖動。掃描蛋白膜。

1.2.5 酶譜法：收集的細胞培養(yǎng)基電泳結束后，加入staining buffer搖晃1 h，destained buffer脫色3 h，使用Precision Plus Protein Standard （Bio-Rad，美國） 獲取影像，并使用Image J分析。

1.2.6 MMP活性檢測：根據(jù)試劑盒說明對樣本中MMP的活性進行檢測。根據(jù)反應物濃度與相對的熒光強度制定標準曲線，根據(jù)標準曲線判斷合適的反應時間，測定細胞培養(yǎng)液中MMP活性的表達水平。

1.2.7 TNC預處理后培養(yǎng)人髓核細胞：使用TNC 提前預處理的培養(yǎng)盤培養(yǎng)人髓核細胞，分為controlcollagen coated，IL-1β-collagen coated，control-TNC coated和IL-1β-TNC coated 4組。后續(xù)給予刺激方式與時間同1.2.2。

1.2.8 體內(nèi)實驗：手術組開腹暴露小鼠的椎間盤，用27 g針頭針刺小鼠的椎間盤 （L3～4） 后關腹；對照組只暴露椎間盤不針刺椎間盤。術后1、3、7 d對小鼠實施安樂死，收取小鼠的椎向盤 （L2～5），進行石蠟包埋，石蠟切片，進行TNC的免疫組化染色。

1.3 統(tǒng)計學分析

2 結果

2.1 炎性環(huán)境中椎間盤細胞中TNC表達水平

2.1.1 Western blotting檢測人髓核細胞TNC蛋白的表達：與對照組 （1.000±0.094 9） 相比，IL-1β刺激的人髓核細胞TNC蛋白表達顯著增高 （3.879±0.583 2，P＜0.05）。見圖1。

2.1.2 實時PCR檢測小鼠椎間盤細胞TNCmRNA表達：與對照組 （1.170±0.122 3） 相比，IL-1β刺激的小鼠椎間盤細胞TNCmRNA水平表達顯著增高（14.300±0.443 2，P＜ 0.05）。

圖1 炎性環(huán)境下TNC蛋白水平在人髓核細胞中的表達變化Fig.1 Changes in TNC protein expression in human nucleus pulposus cells under inflammatory conditions

2.1.3 實時PCR檢測小鼠椎間盤細胞膠原蛋白Ⅱ和蛋白聚糖 mRNA的表達水平：與對照組 （1.000±0.038）相比，IL-1β刺激的小鼠椎間盤細胞 膠原蛋白ⅡmRNA水平表達顯著降低 （0.155±0.044，P＜ 0.05）。與對照組 （1.000±0.090） 相比，IL-1β刺激的小鼠椎間盤細胞蛋白聚糖 mRNA水平表達顯著降低 （0.074±0.022，P＜ 0.05）。

2.2 炎性環(huán)境椎間盤細胞中不同時間TNC的表達變化

2.2.1 實時PCR檢測人髓核細胞TNC、膠原蛋白Ⅱ和蛋白聚糖 mRNA水平在不同時間的表達：在IL-1β介導的炎性刺激下，與對照組相比，TNCmRNA水平在12 h達到峰值 （P＜ 0.05），在24 h開始下降；膠原蛋白Ⅱ mRNA水平在24 h開始顯著降低 （P＜ 0.001） ；蛋白聚糖 mRNA水平在12 h開始顯著降低 （P＜ 0.001）。見表1。

2.2.2 實時 PCR 檢測小鼠的椎間盤細胞TNC、膠原蛋白Ⅱ和蛋白聚糖 mRNA水平在不同時間的表達：與人髓核細胞PCR 結果相似，小鼠椎間盤細胞在IL-1β介導的炎性刺激下，與對照組相比，TNCmRNA水平在8 h開始增高 （P＜ 0.05），12 h達到峰值 （P＜0.05），在24 h開始下降；膠原蛋白Ⅱ mRNA水平在24 h開始顯著降低 （P＜ 0.001） ；蛋白聚糖 mRNA水平在24 h開始顯著降低 （P＜ 0.001）。見表2。

表1 人髓核細胞中不同時間TNC，膠原蛋白Ⅱ，蛋白聚糖 mRNA表達的變化Tab.1 TNC，collagenⅡ，and aggrecan mRNA expression in human NP cells over time

表2 小鼠椎間盤細胞中不同時間TNC、膠原蛋白Ⅱ、蛋白聚糖 mRNA表達的變化Tab.2 TNC，collagenⅡ，and aggrecan mRNA expression in mouse disc cells over time

2.3 炎性環(huán)境中椎間盤細胞MMP活性的檢測

2.3.1 實時PCR檢測小鼠椎間盤細胞MMP-9/MMP-13mRNA的表達：與對照組 （1.022±0.028） 相比，IL-1β刺激的小鼠椎間盤細胞MMP-9mRNA水平表達顯著增高 （5.430±0.526，P＜ 0.05）。與對照組 （1.018±0.035） 相比，IL-1β刺激的小鼠椎間盤細胞MMP-13mRNA水平表達顯著增高 （16.393±0.922，P＜ 0.05）。

2.3.2 酶譜法測定人髓核細胞培養(yǎng)液MMP的活性變化：與對照組相比，IL-1β刺激的人髓核細胞MMP-2的活性在8h開始增高（1.910±0.520，P＜0.05） ；在24 h達到峰值 （13.078±0.888，P＜ 0.001）。見圖2。

圖2 炎性環(huán)境下MMP-2在人髓核細胞培養(yǎng)液中的活性變化Fig.2 Changes in MMP activity in human nucleus pulposus cells medium under inflammatory conditions

2.3.3 酶譜法測定小鼠椎間盤細胞培養(yǎng)液中MMP的活性變化：與對照組相比，IL-1β刺激小鼠椎間盤細胞后MMP-2 （26.943±21.183），MMP-9 （95.312±3.889）的表達顯著增高 （P＜ 0.001）。見圖3。

圖3 炎性環(huán)境下MMP-2在小鼠椎間盤細胞培養(yǎng)液中的活性變化Fig.3 The expression of MMP-2 activity changes in mouse disc degeneration cells medium under inflammatory environment

2.3.4 MMP活性檢測測定小鼠椎間盤細胞培養(yǎng)液中MMP的活性變化：與對照組相比，IL-1β刺激小鼠椎間盤細胞后MMP-2和MMP-9的活性顯著增高 （P＜0.001）。見表3。

表3 MMP 活性檢測結果Tab.3 MMP activity assay results

2.4 給予外源性TNC后人髓核細胞膠原蛋白Ⅱ和蛋白聚糖mRNA的表達

實時PCR結果顯示，加入外源性TNC 后，膠原蛋白Ⅱ的表達由降低變?yōu)轱@著高于對照組 （P＜0.001） ；蛋白聚糖的表達由降低變?yōu)榕c對照組無統(tǒng)計學差異 （P＞ 0.05）。見表4。

2.5 給予外源性TNC后人髓核細胞中MMP的活性

酶譜法檢測結果顯示，與IL-1β-collagen coated組相比，IL-1β-TNC coated組MMP-9和MMP-2的水平明顯增高 （P＜ 0.001）。見圖4、表5。

2.6 體內(nèi)實驗結果

對照組小鼠椎間盤結構完整，纖維環(huán)結構排列整齊，髓核組織紅染，細胞核藍染，為正常椎間盤；與對照組相比，手術組椎間盤結構破壞，纖維環(huán)結構不規(guī)則，髓核組織丟失，為病變的椎間盤，見圖5。免疫組化染色可見，與對照組相比，TNC在手術組的小鼠椎間盤中表達明顯增高 （P＜ 0.05）。

表4 給予外源性TNC后膠原蛋白 II和蛋白聚糖 mRNA表達水平的變化Tab.4 Changes in collagen II and aggrecan mRNA expressions after exogenous TNC administration

圖4 給予外源性TNC后人髓核細胞中MMP的活性變化Fig.4 Changes in MMP activity after exogenous TNC administration

3 討論

正常的椎間盤中，分子的合成與降解處于平衡狀態(tài)。當降解的速度大于合成的速度時，椎間盤的組織與生物功能就會降低［13］。IL-1β是一種炎性細胞因子，常用于模擬DDD體外實驗［14-15］。為了驗證TNC在DDD中的表達，本研究給予人和小鼠椎間盤細胞IL-1β刺激，并采用Western blotting、實時PCR和免疫組化染色檢測TNCmRNA和蛋白水平的表達情況。結果顯示，在人與小鼠的椎間盤細胞中，TNC的蛋白與mRNA水平在IL-1β介導的炎性刺激下表達增高。膠原蛋白Ⅱ和蛋白聚糖的mRNA水平降低。本研究結果顯示，IL-1β介導的炎性刺激下，膠原蛋白Ⅱ和蛋白聚糖表達降低的時間在TNC表達水平降低開始后，TNC的降低也許與椎間盤細胞病變的發(fā)生有著某種聯(lián)系。

DDD發(fā)生時，MMP降解ECM，使其含量變少，導致椎間盤變性，被降解的外基質蛋白產(chǎn)物又進一步激活MMP的活性［16］。MMP-2，MMP-9主要降解蛋白聚糖；MMP-3，MMP-13主要降解膠原蛋白。目前的研究［17-19］已經(jīng)證明，在IL-1β介導的炎性刺激下，椎間盤細胞的MMP活性增高。本研究結果顯示，IL-1β介導的炎性刺激下，MMPmRNA水平及活性增高。為了驗證TNC對DDD的作用且與MMP表達的關系，給予外源性的TNC蛋白，觀察膠原蛋白Ⅱ，蛋白聚糖，MMP活性的水平。結果顯示，外源性TNC對膠原蛋白Ⅱ和蛋白聚糖mRNA水平有保護作用。在給予外源性TNC后，MMP的活性降低，這也許是膠原蛋白Ⅱ和蛋白聚糖mRNA水平表達增高的原因。免疫組化染色可見TNC在手術組的小鼠椎間盤及周圍組織均有明顯的陽性結果。

表5 給予外源性TNC后MMP的活性變化Tab.5 Changes in MMP activity after exogenous TNC administration

圖5 免疫組化檢測針刺小鼠椎間盤術后1、3、7 d TNC在小鼠椎間盤及周圍的表達水平 ×20Fig.5 TNC expression levels in and around the intervertebral discs in mice detected by immunohistochemical staining 1，3，and 7 days after acupuncture ×20

本研究驗證了在IL-1β介導的炎性刺激下，人和小鼠的椎間盤細胞及小鼠的椎間盤及周圍組織 （體外實驗與體內(nèi)實驗） TNC表達均增高，在給予外源性TNC后，MMP的活性降低，膠原蛋白Ⅱ和蛋白聚糖的表達升高，這可能是TNC調節(jié)MMP活性，從而對退變的椎間盤細胞起到保護作用，但以何種機制及何種通路發(fā)揮作用還需進一步研究。