楊 劍，韓立峰，邵 睿，張 鵬，郝 佳，常艷旭，高秀梅，王 濤

（天津中醫(yī)藥大學(xué)中醫(yī)藥研究院，天津 301617）

2020年初新型冠狀病毒肺炎（簡稱新冠肺炎）的突發(fā)給中國人民健康和經(jīng)濟(jì)發(fā)展帶來了巨大打擊。該疫情被世界衛(wèi)生組織列為國際關(guān)注的公共突發(fā)衛(wèi)生事件。短短兩個月事件造成全國7萬余人感染，3 000余人死亡，疫情波及30個國家，引起了世界范圍的恐慌。

近年世界范圍多次出現(xiàn)病毒性呼吸道傳播疾病，包括2003年嚴(yán)重急性呼吸綜合征（SARS）、2009年H7N9流感、2012年中東呼吸綜合征（MERS）等相關(guān)疫情。疾病發(fā)生頻率逐漸加快，病毒變異迅速，從常規(guī)抗病毒化學(xué)藥物、疫苗研發(fā)規(guī)律來看，臨床有效治療藥物缺乏，治療手段難以及時跟進(jìn)。如何發(fā)揮中醫(yī)藥防疫抗病能力成為中醫(yī)藥研究者的重要課題。

在新型冠狀病毒感染后，體液中迅速大量產(chǎn)生多種細(xì)胞因子，形成細(xì)胞因子風(fēng)暴，導(dǎo)致人體免疫系統(tǒng)紊亂，引起急性呼吸窘迫綜合征、多器官衰竭等癥[1]。細(xì)胞因子風(fēng)暴需藥物及時干預(yù)，以避免過多的組織液肺部滲出，影響呼吸功能[2]。大量臨床證據(jù)證實(shí)，病毒侵染呼吸系統(tǒng)，造成肺損傷后可引起肺纖維化。SARS流行期間，有45%的患者在感染后1個月肺部表現(xiàn)出“毛玻璃”外觀。跟蹤病例研究顯示，有27.8%的SARS幸存者肺功能下降，肺纖維化程度增加。肺纖維化是病毒性肺炎患者恢復(fù)期的常見后遺癥，缺乏有效臨床治療藥物。

本研究收集了多種上市中成藥，篩選抗成纖維細(xì)胞膠原沉積活性藥物，為病毒感染肺損傷者的愈后干預(yù)提供科學(xué)依據(jù)。

1 實(shí)驗部分

1.1 儀器與材料 KO-250E超聲波清洗器，昆山市超聲儀器有限公司；IKA RV 10旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，德國IKA公司；Milli-Q超純水制備儀，Millpore公司；超聲裂解儀，寧波新芝生物科技有限公司；DC300F倒置相差顯微鏡，德國Leica公司；多功能酶標(biāo)儀，Tecan公司；倒置顯微鏡，日本Nikon公司；NIH-3T3小鼠胚胎成纖維細(xì)胞株及MRC5人源成纖維細(xì)胞株均來自 ATCC；轉(zhuǎn)化生長因子-β1（TGF-β1），R&Dsystem公司；SB431542，美國Selleck公司；DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清均購于美國Gibco公司；1%青/鏈霉素，美國HyClone公司；乙醇、二甲基亞砜（DMSO）等化學(xué)試劑均為分析純，天津康科德科技有限公司。

1.2 中成藥提取 收集多種上市中成藥，粉碎后（噴霧劑使用原料）以10倍70%乙醇溶液（W/V）超聲提取30 min，4 000 g離心10 min，離心半徑為150 mm，吸取上清液，40℃減壓濃縮至干，干燥粉末以100 mg/mL濃度溶于DMSO中，備用。

1.3 成纖維細(xì)胞膠原含量檢測 參考文獻(xiàn)方法[3]，收集對數(shù)生長期細(xì)胞，以1×105/mL將鼠源胚胎成纖維NIH-3T3細(xì)胞，人源肺成纖維化MRC5細(xì)胞接種到96孔板中，以含10%胎牛血清的DMEM完全培養(yǎng)基在37℃，5%CO2環(huán)境下培養(yǎng)，過夜后更換為無血清培養(yǎng)基。同步化24 h后，用TGF-β1（5 ng/mL）處理48 h為模型組，用TGF-β1+SB431542（TGF-β1抑制劑，終濃度 5 μmol/L）作為陽性藥組，TGF-β1+100 μg/mL（終濃度，DMSO 濃度為 0.1%）不同中成藥提取物為給藥組，空白對照組直接加培養(yǎng)基100 μL培養(yǎng)。48 h后棄去孔中培養(yǎng)基，并用200 μL PBS洗滌細(xì)胞3次，用-20℃冰甲醇固定過夜后，200 μL PBS洗滌3次，每孔加入100 μL天狼星紅試劑，室溫避光放置4 h，棄去游離的天狼星紅，每孔用200 μL的0.01%乙酸洗滌3次后風(fēng)干，加入200 μL 0.1 mol/L NaOH，振蕩 1 h 后應(yīng)用多功能酶標(biāo)儀在540 nm處進(jìn)行吸光度的測定。相對膠原沉積率=A540nm（給藥組）/A540nm（陽性藥組）。包括模型組、陽性藥組、空白對照組、給藥組在內(nèi)的每組樣品都平行進(jìn)行了4次復(fù)孔實(shí)驗。

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法 使用SPSS 20.0統(tǒng)計軟件，實(shí)驗數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析（one-way ANOVA），兩兩比較采用Dunnett檢驗，P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 實(shí)驗結(jié)果

2.1 成纖維細(xì)胞膠原沉積模型構(gòu)建及中藥提取物對細(xì)胞活力的影響 肺成纖維細(xì)胞貼壁同步化后，通過TGF-β1誘導(dǎo)48 h，經(jīng)天狼星紅染色，鏡下可見明顯膠原沉積。陽性對照藥，TGF-β1抑制劑SB431542（SB，終濃度 5 μmol/L）可有效降低膠原沉積（人源肺成纖維細(xì)胞膠原沉積模型，見圖1；鼠源胚胎纖維細(xì)胞膠原沉積模型，見圖2），說明本實(shí)驗體系建立成功。各中成藥提取物在本實(shí)驗設(shè)計濃度下，鏡下未見細(xì)胞形態(tài)及密度明顯改變。

圖1 人源肺成纖維細(xì)胞膠原沉積模型構(gòu)建Fig.1 Human-derived lung fibroblast collagen deposition model

圖2 鼠源胚胎成纖維細(xì)胞膠原沉積模型構(gòu)建Fig.2 Murine-derived fibroblast collagen deposition model

2.2 中成藥提取物對MRC5人源肺成纖維細(xì)胞膠原沉積的影響 與空白對照組相比，TGF-β1誘導(dǎo)人源肺成纖維細(xì)胞膠原沉積量上升約1.3倍，TGF-β1抑制劑SB431542（終濃度5 μmol/L）處理后能有效降低膠原沉積至正常水平。在100 μg/mL濃度下，清喉利咽顆粒、止嗽定喘丸、清金止嗽化痰丸（天津中新藥業(yè)樂仁堂制藥廠，生產(chǎn)批號分別為0780974、15502235和0790104），六神丸（上海雷允上藥業(yè)有限公司，生產(chǎn)批號為190601），復(fù)方一枝黃花噴霧劑（貴州百靈企業(yè)集團(tuán)，生產(chǎn)批號為20200115），復(fù)方芩蘭口服液（黑龍江珍寶島藥業(yè)股份有限公司，生產(chǎn)批號為B36200206001），八寶丹膠囊（廈門中藥廠，生產(chǎn)批號為190630），痰熱清膠囊（上海凱寶藥業(yè)股份有限公司，生產(chǎn)批號為2001102），蒲地藍(lán)消炎片、通宣理肺片、清瘟解毒片（天津中新藥業(yè)隆順榕制藥廠，生產(chǎn)批號分別為190082、250001和220002）等11種中成藥提取物能有效抑制膠原沉積（見表 1，圖3）。

表1 中成藥對人源肺成纖維細(xì)胞膠原沉積的抑制作用（±s）Tab.1 Inhibition effect of Chinese patent medicine on collagen deposition of human-derived lung fibroblasts（±s）

表1 中成藥對人源肺成纖維細(xì)胞膠原沉積的抑制作用（±s）Tab.1 Inhibition effect of Chinese patent medicine on collagen deposition of human-derived lung fibroblasts（±s）

注：與模型組（TGF-β1）比較，*P＜0.05，**P＜0.01，***P＜0.001。

組別 相對膠原沉積率[A 540nm（給藥組）/A 540nm（陽性藥組）]空白對照組（C o n t r o l） 0.9 9±0.0 2模型組（T G F-β 1） 1.2 4±0.0 2陽性藥組（T G F-β 1+S B） 1.0 6±0.0 6給藥組（清喉利咽顆粒） 0.9 7±0.1 0*給藥組（止嗽定喘丸） 1.1 1±0.0 1***給藥組（清金止嗽化痰丸） 0.9 9±0.0 6**給藥組（六神丸） 0.7 1±0.0 7**給藥組（復(fù)方一枝黃花噴霧劑） 1.0 5±0.0 8*給藥組（復(fù)方芩蘭口服液） 0.9 7±0.1 1*給藥組（八寶丹膠囊） 0.8 3±0.0 7**給藥組（痰熱清膠囊） 0.8 9±0.1 4*給藥組（蒲地藍(lán)消炎片） 1.1 6±0.0 2*給藥組（通宣理肺片） 1.0 9±0.0 5**給藥組（清瘟解毒片） 1.0 5±0.0 5**

圖3 中成藥提取物對人源肺成纖維細(xì)胞膠原沉積的抑制作用Fig.3 Inhibitory effect of Chinese patent medicine extract on collagen deposition of human-derived lung fibroblasts

2.3 中成藥提取物對NIH/3T3鼠源胚胎成纖維細(xì)胞膠原沉積的影響 與空白對照組相比，TGF-β1誘導(dǎo)鼠源胚胎成纖維細(xì)胞膠原沉積量上升約1.2倍，TGF-β1 抑制劑 SB431542（終濃度 5 μmol/L）處理后能有效降低膠原沉積至正常水平。在100 μg/mL濃度下，牛黃清心丸局方（天津中新藥業(yè)達(dá)仁堂制藥廠，生產(chǎn)批號190622），清喉利咽顆粒、止嗽定喘丸（天津中新藥業(yè)樂仁堂制藥廠，生產(chǎn)批號分別為0780974和15502235），八寶丹膠囊（廈門中藥廠，生產(chǎn)批號為190630），痰熱清膠囊（上海凱寶藥業(yè)股份有限公司，生產(chǎn)批號為2001102），清熱解毒口服液、清開靈注射液（神威藥業(yè)集團(tuán)，生產(chǎn)批號分別為1912271和20011601），清瘟解毒片（天津中新藥業(yè)隆順榕制藥廠，生產(chǎn)批號為220002）等8種中成藥提取物能有效抑制膠原沉積（表2，圖4）。

3 討論

在肺部炎癥的損傷修復(fù)階段，巨噬細(xì)胞調(diào)節(jié)炎癥反應(yīng)，并分泌轉(zhuǎn)化生長因子TGF-β1和血小板衍生生長因子等，刺激成纖維細(xì)胞增殖，造成胞外基質(zhì)重塑，膠原蛋白過度沉積，這個過程如果不加以藥物干預(yù)，將發(fā)展為不可逆的肺纖維化，肺部會出現(xiàn)“毛玻璃”“蜂窩煤”狀，導(dǎo)致呼吸困難甚至衰竭，嚴(yán)重影響患者生活質(zhì)量。

表2 中成藥對鼠源胚胎成纖維細(xì)胞膠原沉積的抑制作用（±s）Tab.2 Inhibition effect of Chinese patent medicine on collagen deposition of murine-derived lung fibroblasts（±s）

表2 中成藥對鼠源胚胎成纖維細(xì)胞膠原沉積的抑制作用（±s）Tab.2 Inhibition effect of Chinese patent medicine on collagen deposition of murine-derived lung fibroblasts（±s）

注：與模型組（TGF-β1）比較，*P＜0.05，**P＜0.01，***P＜0.001。

組別 相對膠原沉積率[A 540nm（給藥組）/A 540nm（陽性藥組）]空白對照組（C o n t r o l） 1.0 6±0.0 3模型組（T G F-β 1） 1.2 5±0.0 3陽性藥組（T G F-β 1+S B） 1.0 0±0.0 4給藥組（牛黃清心丸局方） 1.0 9±0.0 6*給藥組（清喉利咽顆粒） 0.9 7±0.1 0*給藥組（止嗽定喘丸） 0.9 6±0.0 5**給藥組（八寶丹膠囊） 1.0 1±0.0 6**給藥組（痰熱清膠囊） 0.8 0±0.0 2***給藥組（清熱解毒口服液） 1.1 0±0.0 6*給藥組（清開靈注射液） 1.0 2±0.0 8**給藥組（清瘟解毒片） 1.0 3±0.1 0*

圖4 中成藥提取物對鼠源胚胎成纖維細(xì)胞膠原沉積的抑制作用Fig.4 Inhibitory effect of Chinese patent medicine extract on collagen deposition of murine-derived lung fibroblasts

目前，美國食品藥品監(jiān)督管理局（FDA）批準(zhǔn)用于治療肺纖維化的藥物僅有吡非尼酮（細(xì)胞因子抑制劑）和尼達(dá)尼布（酪氨酸激酶抑制劑）[4]，但這兩種藥物臨床用量大，治療成本高，且易出現(xiàn)耐藥性，患者依從性差。目前為止，中國尚無治療肺纖維化藥物上市。中醫(yī)認(rèn)為，肺纖維化屬于“肺痹”和“肺痿”的范疇，其病機(jī)在于氣陰兩虛，并兼有痰、瘀、熱之邪。氣滯而痰凝，脾虛而聚濕，阻于肺腔。中醫(yī)治療以益氣養(yǎng)陰為主，活血化瘀為輔，補(bǔ)肺生津，標(biāo)本兼治。臨床證實(shí)，血府逐瘀湯、丹參飲合二陳湯、桑白皮湯[5]等具有一定臨床治療效果。

本研究從已上市中成藥出發(fā)，尋找能有效抑制膠原沉積、阻礙肺纖維化發(fā)生發(fā)展的藥物，以滿足肺纖維化治療的臨床藥物需求。在對纖維化考察的細(xì)胞水平實(shí)驗中，人源肺成纖維細(xì)胞（MRC-5）和鼠源胚胎成纖維細(xì)胞（NIH-3T3）為體外實(shí)驗常用的兩種細(xì)胞系[6-7]。在纖維化的發(fā)展過程中，一部分纖維細(xì)胞分化為肌成纖維細(xì)胞，產(chǎn)生并積聚過量的膠原蛋白，膠原蛋白沉積會破壞肺部組織結(jié)構(gòu)和功能，引發(fā)纖維化[8-9]。本實(shí)驗所涉及的兩種細(xì)胞模型，均首先通過TGF-β誘導(dǎo)活化后用天狼星紅染色法檢測細(xì)胞內(nèi)膠原沉積，確定模型誘導(dǎo)成功，以此作為肺纖維化中膠原沉積的細(xì)胞模型。研究結(jié)果表明，清喉利咽顆粒、止嗽定喘丸、八寶丹膠囊、痰熱清膠囊、清瘟解毒片5種中成藥提取物，對鼠源、人源肺成纖維化細(xì)胞的膠原沉積均有抑制作用，提示這些上市中成藥有應(yīng)用于治療肺纖維化的前景。

進(jìn)一步對所有有效中成藥組成藥味進(jìn)行分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，黃芩、甘草、連翹、桔梗等飲片使用頻率較高，通過文獻(xiàn)查閱，對這4味藥所含有的化學(xué)成分進(jìn)行了整理，與本研究發(fā)現(xiàn)一致，如黃芩中的黃芩苷、黃芩素，甘草中的甘草酸[8]、甘草次酸，連翹中的連翹苷元、牛蒡子苷，桔梗根中的皂苷類成分等對纖維化有緩解作用[10-17]。

本研究正在持續(xù)進(jìn)行，下一步將針對活性中成藥開展體內(nèi)研究，以明確其藥效物質(zhì)及作用機(jī)制，為臨床治療肺纖維化提供科學(xué)依據(jù)。

致謝：多家中藥制藥企業(yè)無私提供檢測樣品，在此表示衷心地感謝!由于時間倉促，本次僅報道了部分結(jié)果，后續(xù)研究將陸續(xù)報道，為疫情防控提供中醫(yī)科技支撐。